廣東地區(qū)漢族人群乙醛脫氫酶2基因Glu504Lys多態(tài)性的研究

王 慧，羅 娥，歐雅文

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州 510120；2.廣州醫(yī)科大學，廣州 510180)

乙醛脫氫酶(ALDH)和乙醇脫氫酶(ADH)在人體內共同組成了人乙醇脫氫酶系，負責催化人體的乙醇分解代謝。其中，ALDH主要有兩種，即對乙醛親和力較弱的胞質同工酶(ALDHl)和親和力較強的線粒體同工酶(ALDH2)。 ALDH2在肝和胃中具有很高的表達量，是乙醇代謝途徑中最重要的酶之一，若編碼該酶的基因異常將會導致乙醛代謝受阻，在體內堆積，造成機體損傷。ALDH2基因具有高度的多態(tài)性，其中以東方人缺失的發(fā)生率最高[1]。ALDH2基因位于12號染色體，由13個外顯子構成，由于第12個外顯子內存在一個單核苷酸多態(tài)(SNPs) rs671，出現(xiàn)堿基置換：當鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)時，導致該基因編碼蛋白504位的谷氨酸(Glu)替換為賴氨酸，即Glu504Lys，使得酶活性大大下降[2]。所以，ALDH2有兩個等位基因：野生型(ALDH2*1，*504Glu)，突變型(ALDH2*2，*504Lys)。人群中該酶基因型存在3種組合方式：野生純合型ALDH2*1/*1(Glu504Glu)，產生具有正常催化活性的酶；突變雜合型ALDH2*1/*2(Glu504Lys)，產生的酶催化活性下降；突變純合型ALDH2*2/*2(Lys504 Lys)，產生的酶催化活性明顯降低。本研究將檢測ALDH2基因多態(tài)性在廣東地區(qū)漢族人群中的分布，并與其他地區(qū)的分布情況進行比較。

1 資料與方法

1.1一般資料 在廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院進行健康體檢或住院的廣東地區(qū)成年漢族人共296例，其中男192例，年齡28～85歲；女104例，年齡35～81歲。

1.2儀器與試劑 ABI9700 PCR擴增儀(美國Applied Biosystems公司)，e-Hyb全自動雜交儀和BE-2.0生物芯片適讀儀(上海百傲科技有限公司)，Thermo NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)。血液基因組DNA提取純化試劑盒和ALDH2基因檢測試劑盒，購自上海百傲科技有限公司。

1.3方法

1.3.1DNA提取 抽取受檢者靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)管中抗凝，按照血液基因組DNA提取純化試劑盒的流程提取血液基因組DNA；用超微紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度，DNA水平應在10～60 ng/μL為宜，OD260/OD280的比值應為1.5～2.0。

1.3.2聚合酶鏈式反應(PCR)擴增 ALDH2擴增液融解后，將其分裝到0.2 mL離心管中，每管22 μL，在各擴增管中分別加入1 μL反應液A，在各擴增管中分別加入2 μL提取好的樣品基因組DNA，總反應體系為25 μL；將各離心管放入PCR儀中，按下列條件進行擴增：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，60 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.3.3芯片雜交顯色 按操作說明配好預雜交液、雜交反應液(190 μL雜交緩沖液+10 μL ALDH2擴增產物)、洗液1、洗液2、洗液3、抗體液和顯色液；在百傲e-Hyb全自動雜交儀上選擇已設置好的雜交程序，將ALDH2基因芯片放入芯片片架中，并插入到雜交儀插片口內，將配好的雜交反應試劑條正確放入雜交儀中相應位置，運行雜交程序。

1.3.4芯片識讀與數據分析 啟動BE-2.0生物芯片適讀儀，將芯片放入適讀儀中，運行基因芯片圖像分析軟件進行圖像掃描與分析，圖像分析自動輸出檢測報告。每次實驗設置陰性對照(空白)，陽性對照(ALDH2*2/*2)，跟隨標本一起進行試驗，以保證結果的準確性。

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行數據處理及統(tǒng)計分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1ALDH2基因型 研究標本檢測出的ALDH2基因型共有3種，分別為GG型(野生純合子)ALDH2*1/*1(Glu504Glu)；GA型(突變雜合子)ALDH2*1/*2(Glu504Lys)；AA型(突變純合子)ALDH2*2/*2(Lys504Lys)，見圖1。

注：A為ALDH2*1/*1(Glu504Glu)；B為ALDH2*1/*2(Glu504Lys)； C為ALDH2*2/*2(Lys504Lys)

圖1 ALDH2基因型3種掃描結果

2.2研究人群ALDH2基因型及等位基因分布頻率 ALDH2各基因型及等位基因分布情況見表1。各基因型(GG型、GA型、AA型)在不同性別廣東地區(qū)漢族人群中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 ALDH2基因多態(tài)性的分布

2.3研究人群ALDH2基因多態(tài)性分布的比較 進一步將ALDH2的各基因型分成ALDH2野生型組(GG)及ALDH2突變型組(GA+AA)；將ALDH2的各基因型分成ALDH2(AA)組及ALDH2(GG+GA)組。分組結果均顯示，不同性別組組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

2.4廣東地區(qū)漢族人群ALDH2基因型和等位基因頻率結果 廣東地區(qū)漢族人群ALDH2*1/*1、ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2 3種基因型的頻率分別為54.7%(162/296)、 37.5%(111/296)、7.8%(23/296)；廣東地區(qū)漢族人群ALDH2*1及ALDH2*2等位基因頻率分別為73.5%、26.5%；廣東地區(qū)漢族人群突變型基因(ALDH2*1/*2+ALDH2*2/*2)的頻率為45.3%。

表2 ALDH2基因多態(tài)性分布的比較[n(%)]

3 討 論

乙醇進入體內后，將通過以下途徑代謝：乙醇→乙醛→水、二氧化碳→排出體外。乙醛在體內的清除快慢是由“酒精基因”ALDH2決定的。當ALDH2基因發(fā)生突變，將使ALDH活性降低，使乙醇在體內從乙醇→乙醛→水、二氧化碳的代謝過程受阻，大量乙醛滯留在體內，將會增加醉酒的嚴重性和導致身體傷害。YAMAMOTO等[3]的研究結果表明，飲酒后ALDH2純合子缺失者(ALDH2*2/*2)血液中的乙醛水平是攜帶ALDH2野生純合子者(ALDH2*1/*1)的19倍，是ALDH2突變雜合子者(ALDH2*1/*2)的3倍。這說明ALDH2 等位基因缺損者，無論是賴氨酸純合型，還是谷氨酸賴氨酸雜合型，ALDH2 都不具有活性或活性很低。因此，ALDH2基因發(fā)生突變的人，不能快速地完成酒精代謝過程，導致乙醛在體內堆積，將對人體的肝、腎、心、腦造成嚴重傷害，檢測ALDH2基因多態(tài)性在篩選乙醇不耐受人群，并采取有效的保護和干預措施等方面都具有潛在的應用前景。

硝酸甘油是心絞痛急性發(fā)作的常規(guī)首選藥物，但該藥的臨床療效常因人而異，中國漢族人群中，硝酸甘油含服無效的比例高達25%以上[4]。硝酸甘油需先在體內經ALDH2生物轉化，然后才能釋放出有藥理活性的一氧化氮，發(fā)揮其抗心絞痛作用。如果患者基因中攜帶有ALDH2突變，會導致硝酸酯酶活性降低，從而使硝酸甘油無法產生一氧化氮，難以發(fā)揮藥效。因此，今后醫(yī)生在臨床使用硝酸甘油的過程中，需考慮患者的這一遺傳因素，用藥前必須考慮先檢測患者的ALDH2基因型，以減少用藥無效導致的意外死亡。

大量文獻均顯示ALDH2基因型與心血管疾病、癌癥和藥物代謝等均存在很大的關聯(lián)性[5-7]，ALDH2基因突變人群罹患結直腸癌、食管癌、胃癌、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心肌梗死等疾病風險更高。而我國漢族人群ALDH2的基因型存在普遍的變異性，因此在人群中進行ALDH2基因型的普查,對該類人群無論從某些藥物的應用上，還是在心血管病防治及癌癥等疾病的研究中都有重要的啟示性。

檢測基因多態(tài)性的方法很多，包括熒光定量PCR技術、測序技術、等位基因特異性PCR技術、PCR-限制性片段長度多態(tài)性技術等。本研究采用的是DNA微陣列芯片法：提取樣品基因組DNA后，用ALDH2基因特異引物進行PCR擴增；將帶生物素標記的擴增產物與固定在醛基基片上的ALDH2基因型檢測探針進行特異雜交反應，并通過酶促顯色反應，使特異性雜交信號出現(xiàn)顏色；通過對芯片進行掃描，得到樣品DNA與ALDH2(Glu504Lys)基因位點的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像，判斷待檢樣品的基因型。該方法操作簡單，一張芯片即可檢測一個樣本，可自動化檢測和分析，結果準確可靠，通過一次檢測即可獲得患者的相關遺傳信息，終生受用，可用于指導制定合理用藥方案，實現(xiàn)個性化治療。

ALDH2第12外顯子的基因多態(tài)性存在明顯的種族差異，亞洲人群中，ALDH2*1/*2 基因型頻率為30%～50%[1]。但是同一種族不同地域的人群ALDH2基因多態(tài)性分布也不一致，本研究顯示廣東地區(qū)漢族人群ALDH2*1/*1、ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2 3種基因型的頻率分別為54.7%、37.5%、7.8%。據國內研究報道，上海人群3種基因型的頻率分別為65.4%、29.8%、4.8%；山東人群3種基因型的頻率分別為72.1%、26.3%、1.6%；湖北人群3種基因型的頻率分別為78.1%、21.9%、0%；浙江人群3種基因型的頻率分別為55.55%、38.90%、5.55%[8-10]。

廣東地區(qū)漢族人群ALDH2*2等位基因頻率為26.5%，上海漢族人群ALDH2*2等位基因頻率為19.7%，山東地區(qū)人群為14.7%，湖北地區(qū)人群為10.9%，浙江地區(qū)人群為25.0%，即廣東地區(qū)漢族人群ALDH2*2等位基因頻率高于以上各地區(qū)。提示廣東地區(qū)人群對乙醛的代謝能力差，對乙醇的耐受性差。

本研究結果顯示廣東地區(qū)漢族人群突變型基因(ALDH2*1/*2+ALDH2*2/*2)的頻率為45.3%，說明廣東地區(qū)漢族人發(fā)生ALDH2基因突變的概率較高，高于文獻[8-10]報道的上海(34.6%)、山東(27.9%)、湖北(21.9%)等地區(qū)，即廣東地區(qū)人群中ALDH及硝酸酯酶活性降低的概率高，從而導致對乙醛的代謝能力差，對乙醇的耐受性低，對硝酸甘油的無效概率高；此人群中ALDH2 酶活性缺乏者占近半數，罹患相關疾病的風險值可能會升高。

因此，在廣東人群中進行ALDH2基因的普查檢測非常重要，可為硝酸甘油的用藥、飲酒指導及相關高風險疾病的預防提供有效的參考依據。