3種人參屬藥用植物種子生根過(guò)程中胚乳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與酶活性的變化

， ， ， ， 英平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所， 吉林 長(zhǎng)春 130112)

關(guān)鍵字： 人參屬藥用植物； 胚乳； 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)； 淀粉酶

圖1 人參種子生根過(guò)程中的變化

圖2 西洋參種子生根過(guò)程中的變化

人參(PanaxginsengC.A.Mey)、西洋參(P.quinquefoliusL.)、三七(P.notoginseng(Burk.)F.H.chen)是五加科多年生草本藥用植物，播種是目前三者最常采用的栽培方式。人參、西洋參種子具有深度休眠特性，三七種子也至少需要2個(gè)月才能夠完成后熟。因此，有關(guān)三者種子的研究，大多集中在如何解除種子休眠[1-2]，促進(jìn)種子萌發(fā)方面[3]。目前對(duì)人參、西洋參、三七種子生根過(guò)程中胚乳中營(yíng)養(yǎng)成分的變化還未見(jiàn)報(bào)道。種子在發(fā)芽的過(guò)程中需要不斷吸收胚乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為種子的呼吸提供能量，為新物質(zhì)的合成提供必要的成分。本研究測(cè)定了三者種子生根過(guò)程中蔗糖、可溶性總糖、淀粉和可溶性蛋白含量和淀粉酶活性的動(dòng)態(tài)變化，為人參、西洋參、三七種子在生根過(guò)程中的物質(zhì)代謝的基本規(guī)律提供基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)所用的人參、西洋參裂口種子于2017年4月購(gòu)自吉林撫松，三七種子于2017年11月購(gòu)自云南文山，新鮮果實(shí)洗去果肉后15 ℃沙藏50 d，完成形態(tài)后熟和生理后熟。選取大小一致、飽滿的種子播種于蒸餾水濕潤(rùn)過(guò)的2層濾紙上，放入培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)置溫度為20 ℃，保持濾紙濕潤(rùn)。取未萌發(fā)、露白階段、胚根伸長(zhǎng)至2，5，8 mm的種子，剝?nèi)∨呷椋凑詹煌纳A段裝進(jìn)相應(yīng)的離心管中待用。

1.2 蔗糖含量測(cè)定

蔗糖含量采用UPLC-ELSD法測(cè)定[4]，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1×100 mm，1.7μm)；流動(dòng)相：0.2%TEA乙腈-水(梯度洗脫：0～2 min，85%～78%乙腈；2～7 min，78%～68%乙腈)；流速：0.2 mL/min；柱溫：50 ℃，進(jìn)樣量2μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品0.400 0 g，置于100 mL容量瓶中，加入50%甲醇配置成濃度為4.000 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.3 供試品溶液制備

取人參種子胚乳于50 ℃烘干至恒重，研成粉末，準(zhǔn)確稱取樣品0.100 0 g置于15 mL離心管中，加入10 mL蒸餾水，室溫超聲提取30 min(功率500 W，頻率40 kHz)，靜置過(guò)夜，吸取上清液1 mL，10 000 r/min離心10 min，過(guò)0.22μm PTFE濾膜，在“1.2.1”色譜條件下進(jìn)樣。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取蔗糖對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，4 mL于20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=1.35x+6.92，r=0.997，線性范圍0.039 7～0.199 mg/mL。

1.3 可溶性總糖、淀粉、淀粉酶和可溶性蛋白含量的測(cè)定

可溶性總糖和淀粉含量測(cè)定采用蒽酮比色法[5]，可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[6]，淀粉酶活力測(cè)定采用3, 5-二硝基水揚(yáng)酸還原法[5]，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010軟件作圖，SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生根過(guò)程的變化

圖1、圖2、圖3分別為人參、西洋參、三七種子未萌發(fā)、露白階段到胚根伸長(zhǎng)至2，5，8 mm時(shí)種子及種胚形態(tài)的變化圖。

圖3 三七種子生根過(guò)程中的變化

2.2 蔗糖含量的變化

未萌發(fā)時(shí)人參、西洋參、三七種子的蔗糖含量分別為1.30%、0.78%、0.52%(DW)，萌發(fā)后急劇下降。 生根過(guò)程中呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，當(dāng)胚根長(zhǎng)為2 mm時(shí)，分別達(dá)到最大值1.45%、0.80%、0.37%(DW)，隨后不斷下降(圖4)，這可能是由于淀粉等多糖在水解酶的作用下水解為蔗糖而出現(xiàn)了短暫的積累而顯著增加，后期又在蔗糖酶的作用下水解為能被直接利用的小分子糖，為種子的呼吸提供底物，從而使蔗糖含量顯著下降。

圖4 人參、西洋參、三七種子生根過(guò)程中蔗糖含量的變化

2.3 可溶性總糖含量的變化

在未萌發(fā)時(shí)，人參、西洋參、三七種子胚乳中的可溶性總糖含量分別為6.14%、4.80%、3.93%(FW)，露白階段下降至4.16%、3.71%、2.84%(FW)，呈顯著性差異(圖5)。隨著胚根長(zhǎng)度的伸長(zhǎng)，人參、西洋參、三七種子胚乳中的可溶性總糖含量逐漸下降，胚根長(zhǎng)為8 mm時(shí)胚乳中的可溶性總糖含量分別顯著下降至2.27%、2.57%、1.71%(FW)，可溶性總糖含量的下降也與種子的呼吸作用不斷增強(qiáng)有關(guān)。

圖5 人參、西洋參、三七種子生根過(guò)程中胚乳可溶性總糖含量變化

2.4 淀粉含量的變化

未萌發(fā)時(shí)，人參、西洋參、三七種子胚乳中的淀粉含量分別為4.31%、3.38%、2.43%(FW)，在種子的生根過(guò)程中人參、西洋參、三七種子胚乳中的淀粉含量均呈顯著下降趨勢(shì)(圖6)。在這個(gè)過(guò)程中，人參種子胚乳中的淀粉消耗最多為2.31%，西洋參種子胚乳中的淀粉含量下降了1.06%，而三七種子胚乳中的淀粉含量?jī)H減少了0.65%。胚乳中的淀粉被分解為小分子糖，轉(zhuǎn)化或合成新的物質(zhì)。淀粉含量在種子胚根伸長(zhǎng)的過(guò)程中不斷降低，也說(shuō)明淀粉在種子生根過(guò)程中作為主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被分解。

圖6 人參、西洋參、三七種子生根過(guò)程中胚乳淀粉含量變化

2.5 可溶性蛋白質(zhì)含量的變化

在種子生根過(guò)程中，人參、三七種子胚乳中的可溶性蛋白含量胚根伸長(zhǎng)至2 mm時(shí)沒(méi)有顯著性變化，當(dāng)胚根長(zhǎng)為5 mm時(shí)顯著下降至0.84%和0.63%(FW)(圖7)，而西洋參種子胚乳中的可溶性蛋白含量在生根過(guò)程中呈顯著性下降趨勢(shì)，減少了0.33%(FW)。人參、三七種子胚乳中的可溶性蛋白含量分別下降了0.37%和0.20%(FW)。胚根持續(xù)伸長(zhǎng)需要更多的物質(zhì)合成新的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和功能蛋白質(zhì)，胚乳中的貯藏蛋白不斷降解為溶解狀態(tài)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到胚根部分從而使胚乳中的蛋白含量降低。

圖7 人參、西洋參、三七種子生根過(guò)程中胚乳可溶性蛋白質(zhì)含量變化

2.6 淀粉酶活性的變化

2.6.1 人參淀粉酶活性的變化

由圖8可知，人參種子在生根過(guò)程中，胚乳中的α-淀粉酶活性先上升后下降，在胚根伸長(zhǎng)至5 mm時(shí)達(dá)到最大值3.14 mg/(g·min)，隨后活性開始降低。β-淀粉酶活性則在生根期間呈顯著降低趨勢(shì)，在胚根伸長(zhǎng)至8 mm時(shí)迅速上升為14.08 mg/(g·min)?？偟矸勖富钚缘淖兓厔?shì)與β-淀粉酶活性變化一致。

圖8 人參種子生根過(guò)程中胚乳淀粉酶活性的變化

2.6.2 西洋參淀粉酶活性的變化

由圖9可知，隨著西洋參種子的萌發(fā)，胚乳中的α-淀粉酶活性開始緩慢增加，在胚根伸長(zhǎng)至5 mm時(shí)達(dá)到最大值1.98 mg/(g·min)，隨后下降。β-淀粉酶活性先緩慢下降，在胚根伸長(zhǎng)至8 mm時(shí)迅速上升為7.46 mg/(g·min)。這個(gè)過(guò)程中西洋參種子胚乳內(nèi)的β-淀粉酶活性下降幅度較人參小，總淀粉酶活性的變化趨勢(shì)與β-淀粉酶活性變化一致。

2.6.3 三七淀粉酶活性的變化

由圖10可以看出，三七種子胚乳中的α-淀粉酶活性并無(wú)顯著性變化，β-淀粉酶活性先緩慢升高為7.72 mg/(g·min)，在胚根長(zhǎng)為8 mm時(shí)迅速下降?？偟矸勖富钚栽谂吒L(zhǎng)為2 mm時(shí)上升至最大值10.50 mg/(g·min)，隨后顯著下降。

圖9 西洋參種子生根過(guò)程中胚乳淀粉酶活性的變化

圖10 三七種子生根過(guò)程中胚乳淀粉酶活性的變化

3 討 論

胚乳中的可溶性總糖在人參、西洋參、三七種子生根過(guò)程中不斷下降，不僅為種胚的生長(zhǎng)提供能量和中間物質(zhì)[7]，還為種子的呼吸作用提供底物，為細(xì)胞和細(xì)胞器的合成提供結(jié)構(gòu)物質(zhì)，從而導(dǎo)致可溶性總糖含量降低，這與趙玉錦等[8]的研究相似，而王延琴[9]、王建波[10]等的研究表明，種子在萌發(fā)過(guò)程中可溶性總糖含量的變化趨勢(shì)是先升后降，這與本研究的結(jié)果不一致，可能可溶性總糖先于淀粉被利用，淀粉的轉(zhuǎn)化速度慢于可溶性總糖利用的速度，使得可溶性總糖呈顯著下降趨勢(shì)。

大分子糖類化合物在水解酶的作用下水解為蔗糖而出現(xiàn)了短暫的積累而增加，后期在蔗糖酶的作用下水解為能被直接利用的小分子糖，為種子的呼吸提供底物，從而使蔗糖含量下降，這與黃升謀等[11]的研究相似。種子內(nèi)的碳源主要以淀粉的形式貯藏在胚乳當(dāng)中，在種子生根過(guò)程中隨著種子呼吸作用的增強(qiáng)，淀粉在淀粉酶的作用下不斷由大分子糖水解為能被利用的小分子可溶性糖和其他碳水化合物，為胚根的生長(zhǎng)提供物質(zhì)和能量[12]。

人參、西洋參種子在萌發(fā)前淀粉在淀粉酶的作用下水解為可溶性糖等物質(zhì)為萌發(fā)提供動(dòng)力，因此萌發(fā)前β-淀粉酶的含量較高。萌發(fā)后淀粉含量的迅速減少導(dǎo)致β-淀粉酶活性的短暫降低，當(dāng)胚根生長(zhǎng)至8 mm時(shí)，β-淀粉酶活性再次顯著升高，表明此時(shí)的種子進(jìn)入了下一個(gè)時(shí)段需要大量分解貯藏物質(zhì)供應(yīng)胚根和胚芽的生長(zhǎng)。在浦梅的研究中，滇重樓種子萌發(fā)后，β-淀粉酶活性先降低，在胚根伸長(zhǎng)至1.5 cm時(shí)繼而又上升至極大值[13]，這與本研究結(jié)果一致。三七種子β-淀粉酶活性在生根過(guò)程中先升高后降低，與人參、西洋參不同的是三七種子在萌發(fā)生長(zhǎng)的過(guò)程中淀粉含量并未有大幅度的減少，β-淀粉酶活性的緩慢升高不斷促進(jìn)著淀粉的水解，這與沈超等[14]的研究結(jié)果一致。

在這3種人參屬藥用植物種子生根過(guò)程中，胚乳中的貯藏蛋白在蛋白酶的作用下不斷降解為多肽、二肽或者是溶解狀態(tài)的氨基酸[15]轉(zhuǎn)運(yùn)到胚根部分，合成新的蛋白質(zhì)，這個(gè)過(guò)程所釋放的能量可用于物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。在碳水化合物之間相互轉(zhuǎn)化的過(guò)程中淀粉酶、蔗糖酶以及相關(guān)性酶的變化，貯藏蛋白質(zhì)降解的順序與相關(guān)蛋白酶的變化還有待于利用蛋白質(zhì)組學(xué)等方法做進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

3種人參屬藥用植物種子胚乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在生根過(guò)程中整體呈下降趨勢(shì)，蔗糖含量萌發(fā)后急劇下降，在萌發(fā)后直至胚根伸長(zhǎng)至8 mm先上升再下降；可溶性總糖、淀粉、可溶性蛋白含量人參種子消耗最多，其次是西洋參，最后是三七。

人參、西洋參的α-淀粉酶活性呈先上升后下降趨勢(shì)，β-淀粉酶活性在萌發(fā)后直至胚根生長(zhǎng)到5 mm期間呈顯著下降趨勢(shì)，而在胚根伸長(zhǎng)至8 mm時(shí)迅速上升。三七的α-淀粉酶活性并無(wú)顯著性變化，β-淀粉酶活性則先緩慢升高再下降。3種人參屬藥用植物種子生根過(guò)程中總淀粉酶活性的變化趨勢(shì)均與β-淀粉酶活性變化一致。