菜豆種子攜帶病原真菌的檢測(cè)及其致病鐮刀菌的室內(nèi)藥劑篩選

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(1.天津市植物保護(hù)研究所， 天津 300381； 2.天津科潤(rùn)蔬菜研究所， 天津 300384)

普通菜豆(PhaseolusvulgarisL.)，別名蕓豆、四季豆等，起源于中南美洲，我國(guó)為次級(jí)起源中心[1]。普通菜豆在我國(guó)有悠久的栽培歷史，我國(guó)是世界上重要的菜豆資源和生產(chǎn)國(guó)之一，各省均有栽培，主產(chǎn)區(qū)分布在黑龍江、山西、內(nèi)蒙古、陜西、貴州、云南等省區(qū)[2]。但病害已成為菜豆生產(chǎn)中的主要限制因素。目前已報(bào)道的菜豆上真菌性病原有22屬36種，炭疽病、角斑病、銹病、根腐病和枯萎病是生產(chǎn)中的重要真菌病害，對(duì)我國(guó)菜豆的產(chǎn)量和品種造成巨大的影響[3]。

種子可以攜帶大量危害種苗或植株的病原，在病害傳播過程中擔(dān)當(dāng)重要傳播媒介[4]。種子真菌可以吸附于種子表面或侵入種子組織內(nèi)部，引起病害從一個(gè)生長(zhǎng)季傳播到下一個(gè)生長(zhǎng)季，從一個(gè)地方擴(kuò)展到另一個(gè)地方，從而對(duì)種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、成株健康方面造成巨大的負(fù)面影響[5]。種子健康檢測(cè)的目的是測(cè)定種子樣品的健康狀況，據(jù)此推測(cè)種子批是否攜帶有害病蟲，為種子質(zhì)量提供有關(guān)信息。種子攜帶病原真菌及其攜帶量的檢測(cè)是種子健康檢驗(yàn)的重要組成部分[6]。

目前，我國(guó)對(duì)于菜豆種子攜帶真菌的研究幾乎屬于空白，僅見程美仁[7]1988年對(duì)北京地區(qū)4個(gè)主要菜豆品種的種子攜帶病原真菌進(jìn)行初步檢測(cè)。因此，本項(xiàng)目鑒于近年來菜豆種植中真菌病害，尤其是菜豆根腐病在我國(guó)的發(fā)生逐年加重，以京津冀地區(qū)4個(gè)主栽培品種為代表，開展菜豆種子攜帶真菌病原的檢測(cè)研究，并測(cè)定不同殺菌劑對(duì)種子攜帶致病鐮刀菌的藥劑敏感性，明確菜豆種子攜帶病原真菌的情況，篩選種子處理藥劑，為種子生產(chǎn)、調(diào)運(yùn)過程中種傳病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菜豆品種4個(gè)，白花架豆(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所)，白玉滿架(天津薊縣四季種子有限公司)，83-B架豆(北京綠百旺農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所)，雙豐1號(hào)(天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所)，以上種子均在通風(fēng)干燥的條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

供試殺菌劑4個(gè)，分別為70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司)、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)、250 g/L吡唑醚菌酯乳油(巴斯夫中國(guó)有限公司)和25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑(先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司)。

表1 菜豆種子外部攜帶真菌種類及分離頻率

品種分離頻率/帶菌頻率(%)鐮刀菌屬(Fusarium)鏈格孢屬(Alternaria)木霉屬(Trichoderma)曲霉屬(Aspergillus)青霉屬(Penicillium)毛殼菌屬(Chaetomium)白花架豆23.53/2.0014.71/1.6720.59/1.3320.59/2.338.82/1.0011.76/1.33白玉滿架6.06/0.6727.27/2.3318.18/2.00—/—15.15/1.3333.33/3.0083-B架豆23.08/2.0030.77/2.33—/—30.77/2.00—/—15.38/1.33雙豐1號(hào)11.11/1.0033.33/3.00—/—18.52/1.333.70/0.3333.33/2.67

注：“-”為未檢出到該菌。下同。

表2 菜豆種子內(nèi)部攜帶真菌種類和分離頻率

品種分離頻率/帶菌頻率(%)鐮刀菌屬(Fusarium)鏈格孢屬(Alternaria)曲霉屬(Aspergillus)青霉屬(Penicillium)白花架豆3.33/25.00—/—6.67/503.33/25.00白玉滿架5.00/37.55.00/37.53.33/25—/—83-B架豆—/—1.6710.0010.00/605.00/30/00雙豐1號(hào)3.33/28.57—/—6.67/57.141.67/14.29

1.2 種子帶菌檢測(cè)

采用吸水紙法[7-8]，將無菌濾紙置于培養(yǎng)皿底部，加入0.5 mL水溶性0.2% 2,4-D鈉鹽溶液浸潤(rùn)濾紙保濕。供試4個(gè)品種中，隨機(jī)挑選300粒種子進(jìn)行檢測(cè)。種子外部帶菌直接培養(yǎng)鏡檢。種子內(nèi)部帶菌將種子外部消毒處理后，置于培養(yǎng)皿保濕培養(yǎng)。種子內(nèi)部和外部帶菌檢測(cè)每皿50粒種子放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，當(dāng)種子周圍長(zhǎng)出菌絲或表面有霉層時(shí)，移入PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)性狀和顯微形態(tài)特征進(jìn)行分類鑒定。計(jì)算種子的帶菌率和分離頻率。

種子帶菌率(%)=(帶菌種子數(shù)/檢測(cè)種子總數(shù))×100%；

特定菌分離頻率(%)=(帶某類菌種子數(shù)/帶菌種子總數(shù))×100%。

將分離的真菌純化后保存。

1.3 種子攜帶鐮刀菌致病力的鑒定

將種子外部和種子內(nèi)部分離到的鐮刀菌分離物純化，對(duì)其進(jìn)行致病力鑒定。具體方法如下：將分離到的鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)7 d后，用滅菌的刷子刷下孢子，配成濃度為106個(gè)孢子/mL的鐮刀菌孢子懸浮液。以白花架豆為供試品種，進(jìn)行催芽，播種。待豆苗長(zhǎng)出2片子葉時(shí)期灌根接種鐮刀菌孢子懸浮液，每個(gè)菌株接種10株豆苗，空白對(duì)照不接菌，接種后待出現(xiàn)發(fā)病植株開始調(diào)查發(fā)病情況。按柯赫氏法則對(duì)病原菌再分離鑒定。

1.4 不同殺菌劑對(duì)菜豆致病鐮刀菌室內(nèi)毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法。在藥劑濃度為1 000，500，200，100，50，10，1，0.1 mg/L的PDA平板上測(cè)定4種常用種衣藥劑對(duì)致病鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。將直徑為4 mm鐮刀菌菌塊，菌面向下接種在不同濃度藥劑平板的中心，放入25 ℃，恒溫培養(yǎng)5 d。每處理3次重復(fù)，以加無菌水為對(duì)照。采用十字交叉法測(cè)量菌絲擴(kuò)展直徑，于空白對(duì)照菌落直徑相比，計(jì)算不同藥劑對(duì)鐮刀菌的抑制率，回歸方程和有效中濃度(EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆種子表皮攜帶真菌檢測(cè)

通過吸水紙檢測(cè)的方法發(fā)現(xiàn)，從不同菜豆種子分離到6個(gè)屬的真菌，其中2個(gè)屬的菌株可能為菜豆病原真菌，分別為引起菜豆根腐病的鐮刀菌(Fusariumspp.)和菜豆黑斑病的鏈格孢(Alternariaspp.)。另外，菜豆種子表皮還攜帶包括曲霉屬(Aspergillusspp.)、青霉屬(Penicilliumspp.)、木霉屬(Trichodermaspp.)和毛殼菌屬(Chaetomiumspp.)類腐生菌。不同菜豆品種表皮攜帶真菌具有一定的差異(表1)，白花架豆和83-B架豆上攜帶的鐮刀菌分離頻率較高，分別為23.53%和23.08%。白花架豆、白玉滿架和83-B架豆上攜帶的鏈格孢菌較多，分離頻率在30%左右。腐生菌中曲霉菌屬和毛殼菌屬分離頻率顯著高于木霉屬和青霉屬。

2.2 菜豆種子內(nèi)部攜帶真菌檢測(cè)

從試驗(yàn)菜豆種子的內(nèi)部分離到4類真菌，分別為鐮刀菌(Fusariumspp.)、鏈格孢(Alternariaspp.)、曲霉(Aspergillusspp.)和青霉(Penicilliumspp.)。分離頻率和帶菌率最高的為曲霉，分別為25%～60%和3.33%～10.00%；其次為鐮刀菌，分離頻率為25%～37.5%，帶菌率為3.33%～5.00%。而種子外部帶菌率較高的毛殼菌和木霉均沒有分離到。

2.3 種子攜帶鐮刀菌致病力的鑒定

本研究從菜豆種子表皮分離到25株鐮刀菌，其中3株致病，引起菜豆苗根基部腐爛，種傳病原分離頻率為12%；而在菜豆種子內(nèi)部分離到了7株鐮刀菌，其中1株能夠引起菜豆根部腐爛，種傳病原分離頻率為14.29%。由此說明，菜豆種子上攜帶的鐮刀菌以腐生菌居多，種子檢驗(yàn)中需要進(jìn)一步的接種試驗(yàn)驗(yàn)證其致病力。

表3 種子上攜帶鐮刀菌對(duì)菜豆植株致病力鑒定

品種 種子表皮攜帶鐮刀菌 種子內(nèi)部攜帶鐮刀菌 編號(hào)致病菌株數(shù)目編號(hào)致病菌株數(shù)目白花架豆S1～S61I1,I21白玉滿架S7～S162I3～I(xiàn)5083-B架豆S17～S220—/—0雙豐1號(hào)S23～S250I6,I70

表4 致病鐮刀菌對(duì)4種藥劑的毒力測(cè)定

藥劑名稱EC50(mg/L)S3S7S13I110%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑0.972±0.1071.815±0.31814.033±3.0510.978±0.15170%甲基硫菌靈可濕性粉劑44.275±8.09621.461±3.18993.372±12.108121.915±15.132250g/L吡唑醚菌酯乳油176.251±12.147128.03±13.43395.321±9.782101.76±14.12625g/L咯菌腈懸浮種衣劑1.906±0.5312.173±1.0420.596±0.0450.963±0.053

2.4 不同殺菌劑對(duì)菜豆致病鐮刀菌室內(nèi)毒力測(cè)定

本研究采用室內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定4種常用的種子處理藥劑苯醚甲環(huán)唑、甲基硫菌靈、吡唑醚菌酯和咯菌腈對(duì)菜豆種子上分離到的鐮刀菌的抑制作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，4種藥劑對(duì)鐮刀菌的抑制作用具有顯著的差異，其中，25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑對(duì)菜豆種子上分離得到的4株致病鐮刀菌抑制作用較強(qiáng)，EC50為0.596～2.173 mg/L。250 g/L吡唑醚菌酯乳油對(duì)鐮刀菌抑制作用較弱，EC50為95.321～176.251 mg/L。10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對(duì)鐮刀菌有一定抑制作用，但不同菌株之間EC50值差異較大。

3 結(jié)論與討論

種子帶菌是田間病害主要初侵染源之一，導(dǎo)致病害的逐年發(fā)生危害和遠(yuǎn)距離傳播。種子表面或內(nèi)部攜帶病原真菌，均可隨種子萌發(fā)而侵染[9-10]。種子表面與內(nèi)部帶菌具有很大相關(guān)性。一般病原真菌先附著于種子表面，然后再逐漸侵入種子內(nèi)部、或侵染萌發(fā)后的幼芽、幼根。劉西莉等對(duì)不同水稻品種進(jìn)行種子帶菌檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同種子外部帶菌差異較大，而內(nèi)部帶菌差異不大[11]。陳玉森等對(duì)紅麻種子攜帶真菌的研究果發(fā)現(xiàn)，種子攜帶真菌多多為腐生菌，少數(shù)病原菌，可引起苗期炭疽病、灰霉病和枯萎病的發(fā)生[13]。

大量菜豆種子攜帶真菌的分類鑒定試驗(yàn)證明，菜豆種子上攜帶病原真菌的數(shù)量和種類較少，分離到的主要病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)[12]和腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)[13]，同時(shí)也分離到其它種的非致病鐮刀菌，而其他致病菌分離到較少[14-15]。鑒于近年來菜豆根腐病在我國(guó)發(fā)生危害較重，病原菌初侵染源不明的現(xiàn)狀，本研究開展菜豆種子攜帶真菌的檢測(cè)。通過顯微觀察和平板分離培養(yǎng)檢測(cè)到菜豆種子上存在2個(gè)種傳病原屬種鐮刀菌屬(菜豆根腐病菌)和鏈格孢屬(菜豆黑斑病菌)，4個(gè)主要的腐生菌曲霉、青霉、木霉和毛殼菌。其中，鐮刀菌的分離頻率較高，與程美仁[7]1988年對(duì)菜豆種子攜帶真菌的研究報(bào)道結(jié)果一致。

種子包衣、藥劑浸種是預(yù)防種傳病害發(fā)生減輕其危害的高效、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的措施，在生產(chǎn)上發(fā)揮重要的作用[16-17]。本研究初步測(cè)定了4種常用的種子處理化學(xué)藥劑對(duì)菜豆種子攜帶病原鐮刀菌的抑制作用，測(cè)定結(jié)果顯示，25 g/L咯菌腈懸浮種衣劑對(duì)4株病原鐮刀菌的抑制作用最強(qiáng)，可以作為有效的種子處理藥劑選擇，而250 g/L吡唑醚菌酯乳油對(duì)鐮刀菌抑制作用較弱，生產(chǎn)上不宜選用。殺菌劑的包衣、浸種處理可以對(duì)種子表面攜帶的真菌進(jìn)行有效的消毒，從而抑制種傳病原的萌發(fā)危害，對(duì)種傳病害的發(fā)生與流行具有有效的控制作用，建議在播種前選擇適合的藥劑做好菜豆種子消毒處理。