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    微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒方法的構(gòu)建

    2018-11-07 03:34:40朱曉換王亞男
    關(guān)鍵詞:卷葉凝膠電泳瓊脂糖

    李 姣, 朱曉換, 古 蕾, 王亞男

    (四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川成都610101)

    馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是世界上僅次于大米、小麥和玉米的第4大糧食作物.馬鈴薯易受病毒感染,馬鈴薯病毒嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì).其中馬鈴薯卷葉病毒是最具破壞性的馬鈴薯病毒,普遍分布在世界(包括中國(guó))大多數(shù)馬鈴薯種植地區(qū)[1].馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)是黃癥病毒科(Luteoviridae)馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)的代表成員,通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播.PLRV侵染馬鈴薯植株,引起卷葉、黃化、矮縮、僵化及塊莖網(wǎng)狀壞死等癥狀,導(dǎo)致馬鈴薯嚴(yán)重減產(chǎn),重者減產(chǎn)80%以上.

    大規(guī)模組織培養(yǎng)無(wú)病毒種薯生產(chǎn)是控制馬鈴薯病毒病的主要方法,然而優(yōu)良無(wú)病毒種薯的生產(chǎn)要求建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的可應(yīng)用于大規(guī)模樣本的病毒檢測(cè)技術(shù).目前馬鈴薯病毒檢測(cè)的方法主要有酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)2種.ELISA因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單而被廣泛應(yīng)用于馬鈴薯病毒檢測(cè),然而,靈敏度較低和假陰性結(jié)果的干擾等缺點(diǎn)大大限制了其檢測(cè)的準(zhǔn)確性[2].RT-PCR比ELISA更敏感,也常用于馬鈴薯病毒檢測(cè)[3-5].然而,RT-PCR檢測(cè)過(guò)程需要4個(gè)步驟,先后分別是:1)從植物組織中提取RNA;2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT);3)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR);4)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳成像可視化其反應(yīng)產(chǎn)物.因此,RTPCR的過(guò)程復(fù)雜且耗時(shí),使其不能滿足對(duì)大規(guī)模樣本進(jìn)行快速病毒檢測(cè)的要求.逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)[6-11]是一種用具有鏈置換活性的 Bacillus stearothermophilus(Bst)DNA 聚合酶以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板,通過(guò)2對(duì)(或3對(duì))引物于65℃(Bst DNA聚合酶的最適溫度)恒溫條件下擴(kuò)增的技術(shù).其擴(kuò)增產(chǎn)物為大小不一的DNA片段.同時(shí)伴隨DNA的合成產(chǎn)生大量焦磷酸根離子,該離子與反應(yīng)液本身所含有的鎂離子結(jié)合形成肉眼可視的白色沉淀——焦磷酸鎂[6-8].RT-LAMP反應(yīng)只需1個(gè)恒溫水浴鍋,在1 h內(nèi)完成,因此是一種簡(jiǎn)單、快速和成本低的馬鈴薯病毒檢測(cè)方法.然而,在RT-LAMP檢測(cè)中,制備RNA模板不僅是檢測(cè)的第一個(gè)步驟,也是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的基礎(chǔ)[8].目前主要使用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法、十二烷基硫酸鈉(SDS)法等方法從待測(cè)植物樣品中提取總RNA作為RT-LAMP擴(kuò)增的模板,這些方法操作復(fù)雜,提取時(shí)間較長(zhǎng),同時(shí)提取液中含有的苯酚、氯仿等試劑易對(duì)環(huán)境造成污染.在對(duì)大規(guī)模樣本進(jìn)行病毒檢測(cè)的過(guò)程中,RNA模板的提取已成為檢測(cè)過(guò)程中耗時(shí)耗力最多的一個(gè)環(huán)節(jié).本研究將無(wú)菌大頭針的針尖刺感染馬鈴薯卷葉病毒的馬鈴薯植株的莖尖,用粘附在針尖處的微量植物組織汁液直接進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增.由于植物組織汁液中含有微量的馬鈴薯卷葉病毒RNA,此RNA是RT-LAMP擴(kuò)增用的模板.其擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)肉眼觀察便可檢測(cè)出該植株有無(wú)感染PLRV,從而建立一種無(wú)需RNA模板制備,無(wú)需瓊脂糖凝膠電泳成像或熒光顯色,快速檢測(cè)PLRV的方法.該方法大大減少了檢測(cè)時(shí)間和成本,且操作簡(jiǎn)便,應(yīng)用于對(duì)大規(guī)模樣本的病毒檢測(cè),在大規(guī)模組織培養(yǎng)無(wú)病毒種薯生產(chǎn)中有很大的應(yīng)用空間.本研究之所以采用馬鈴薯莖尖提取微量組織汁液,原因有2點(diǎn):1)高細(xì)胞密度的莖尖可以使足夠量的組織汁液粘附在針尖處;2)植物細(xì)胞含有干擾 RTLAMP和RT-PCR反應(yīng)的抑制劑,而莖尖細(xì)胞含有的抑制劑較少,能減少對(duì)RT-LAMP和RT-PCR反應(yīng)的干擾.

    1 材料與方法

    1.1 供試植株 實(shí)驗(yàn)所用植株為培養(yǎng)室中生長(zhǎng)的馬鈴薯組培苗,其品種為“紫花白”.待測(cè)樣品包括經(jīng)ELISA法鑒定已感染PLRV的6份樣品和沒(méi)有感染PLRV的6份樣品.陽(yáng)性對(duì)照:已感染PLRV的馬鈴薯組培苗;陰性對(duì)照1:沒(méi)有感染PLRV的馬鈴薯組培苗;陰性對(duì)照2:以ddH2O為模板的RTPCR或RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物.

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 植物組織總RNA提取試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司);5X TRUE RT MasterMix逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)、Moloney Murine Leukemia Virus(MMLV)逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司)、2X Utaq PCR MasterMix試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司);Bacillus stearothermophilus(Bst)DNA 聚合酶(美國(guó) New England Biolabs公司)、10X ThermoPol反應(yīng)緩沖液(美國(guó) New England Biolabs公司)、RNase抑制劑(美國(guó)Promega公司)、甜菜堿(美國(guó)Sigma公司);瓊脂糖和Goldview核酸染料(均購(gòu)自北京中科瑞泰生物科技有限公司)、DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和6X上樣緩沖液(均購(gòu)自南京生興生物技術(shù)有限公司).

    1.3 引物 本研究中檢測(cè)的PLRV的基因?yàn)镻LRV外殼蛋白的編碼序列(ORF3),共627個(gè)堿基對(duì)(bp).RT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)所用的引物及引物序列和當(dāng)有PLRV感染植株時(shí)擴(kuò)增的目的片段如表1所示.所有引物均由成都擎科生物技術(shù)公司提供.表1中RT-PCR反應(yīng)所用的引物為正向引物F和反向引物B,當(dāng)有PLRV感染植株時(shí),其反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后表現(xiàn)為一條長(zhǎng)627 bp的條帶.RT-LAMP反應(yīng)所用的引物為1對(duì)外引物(F3/B3)和1 對(duì)內(nèi)引物(FIP/BIP),當(dāng)有PLRV 感染植株時(shí),其反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后表現(xiàn)為瀑布狀的DNA片段.

    表1 RT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)中所用引物的序列Tab.1 Sequences of primers used in RT-PCR and RT-LAMP

    1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Bio-Rad PCR儀 C1000(美國(guó)Bio-Rad公司);Bio-Rad水平15×10 cm Sub-Cell GT電泳槽1704481(美國(guó)Bio-Rad公司);Bio-Rad Powerpac Basic基礎(chǔ)電源1645050(美國(guó)Bio-Rad公司);Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng) SYSTEM GelDoc XR+(美國(guó)Bio-Rad公司);HH-6恒溫水浴鍋(常州朗博儀器制造有限公司).

    1.5 實(shí)驗(yàn)方法

    1.5.1 植物組織總RNA提取 按照傳統(tǒng)的RNA模板的制備方法,將剪下的莖尖組織(長(zhǎng)約0.1 cm)放入事先盛有液氮的研缽中,充分研磨,然后按照北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司提供的植物組織總RNA提取的說(shuō)明書(shū),用該公司提供的植物組織總RNA提取試劑盒進(jìn)行操作.

    1.5.2 微量組織汁液采集 如圖1所示,使用無(wú)菌大頭針的針尖刺馬鈴薯組培苗(苗高6~8 cm)莖尖,莖尖汁液隨之粘附在針尖處.在RT-PCR實(shí)驗(yàn)中,先將針尖浸在逆轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)液中,通過(guò)隨機(jī)引物,總RNA(PLRV和馬鈴薯的RNA)被逆轉(zhuǎn)錄為總 cDNA,然后轉(zhuǎn)移適量 RT反應(yīng)液(總量為0.5μg DNA)到PCR反應(yīng)液中,通過(guò)1對(duì)引物(表1中F/R),病毒DNA被擴(kuò)增為長(zhǎng)627 bp的片段.在RT-LAMP實(shí)驗(yàn)中,將針尖浸在反應(yīng)液中,由于植物組織汁液中含有微量的馬鈴薯卷葉病毒RNA,病毒RNA在RT-LAMP反應(yīng)液中先被M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后cDNA被Bst DNA聚合酶通過(guò)2對(duì)引物(表1中 F3/B3和 FIP/BIP)擴(kuò)增.其擴(kuò)增產(chǎn)物為大小不一的DNA片段.同時(shí)伴隨DNA的合成產(chǎn)生大量焦磷酸根離子,該離子與反應(yīng)液本身所含有的鎂離子結(jié)合形成肉眼可視的白色沉淀——焦磷酸鎂[6-8].如有白色沉淀,即可判定為帶PLRV植株;如沒(méi)有白色沉淀的出現(xiàn),即可判定為無(wú)病毒植株.

    圖1 微量組織汁液采集示意圖Fig.1 Illustration of collecting micro-tissue juice

    1.5.3 RT-PCR RT-PCR 反應(yīng)首先對(duì)傳統(tǒng)法提取的RNA模板或者微量組織汁液中含有的RNA進(jìn)行RT反應(yīng),然后對(duì)RT反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增.

    傳統(tǒng)的RT反應(yīng)體系的總體積為20μL,其中各成分含量為:1μg RNA和4μL 5X TRUE RT Master-Mix(該試劑包含M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和一對(duì)隨機(jī)引物).各成分配置完成后,以雙蒸水補(bǔ)齊至20μL,于42℃恒溫反應(yīng)20 min,獲得DNA模板,隨后于85℃放置5 s,使逆轉(zhuǎn)錄酶失活,終止反應(yīng).

    微量組織汁液直接RT反應(yīng)體系總體積為20μL,成分同傳統(tǒng)的 RT反應(yīng)體系,只是不加RNA,以雙蒸水補(bǔ)齊至20μL.將粘附了莖尖汁液的針尖浸在RT反應(yīng)體系中,室溫中反應(yīng)15 min,獲得DNA模板,隨后于85℃放置5 s,使逆轉(zhuǎn)錄酶失活,終止反應(yīng).操作中,盡量使粘附了莖尖汁液的針尖完全浸在RT反應(yīng)體系中,并蓋嚴(yán)管蓋,否則會(huì)影響RT反應(yīng)結(jié)果.

    PCR反應(yīng)體系總體積為25μL,其中各成分含量為:12.5 μL 2X Utaq PCR MasterMix、10 μM 正反向引物各1μL、0.5μg DNA模板.各成分配置完成后,以雙蒸水補(bǔ)齊至25μL,放入Bio-Rad PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件包括:1)預(yù)變性:94 ℃,3 min;2)30 個(gè)循環(huán):94 ℃,30 s;54 ℃,1 min;72 ℃,30 s;3)末次延伸:72 ℃,7 min.其反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè).

    1.5.4 RT-LAMP 傳統(tǒng)的RT-LAMP反應(yīng)體系總體積為25μL,其中各成分含量為:1.6μM內(nèi)引物 FIP/BIP、0.4 μM外引物 F3/B3、2.5 μL 10X ThermoPol緩沖液、0.8 M betaine、1.0 mM dNTP、8 mM MgSO4、10 U M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、4 U RNase抑制劑、10 U Bst DNA聚合酶和0.1μg DNA模板.各成分配置完成后,以雙蒸水補(bǔ)齊至25μL,于65℃恒溫反應(yīng)60 min,隨后放置于80℃ 5 min,使逆轉(zhuǎn)錄酶失活,終止反應(yīng).

    微量組織汁液直接RT-LAMP反應(yīng)體系總體積為25μL,其中各成分含量同傳統(tǒng)的RT-LAMP反應(yīng)體系,只是不加DNA模板,以雙蒸水補(bǔ)齊至25μL.將粘附了莖尖組織汁液的針尖浸在RTLAMP反應(yīng)體系中,于65℃恒溫反應(yīng)60 min,隨后于85℃放置5 s,使逆轉(zhuǎn)錄酶失活,終止反應(yīng).操作中,盡量使粘附了莖尖組織汁液的針尖完全浸在RT-LAMP反應(yīng)體系中,并蓋嚴(yán)管蓋,否則會(huì)影響RT-LAMP反應(yīng)結(jié)果.

    1.5.5 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳成像 將0.45 g的瓊脂糖放入30 mL 1X TAE緩沖液中溶解,滴入1.5μL Goldview核酸染料(比例:5μL核酸染料/100 mL 1X TAE緩沖液),倒入膠模中,室溫靜置約30 min,使膠完全凝固.把膠放入裝有適量1X TAE緩沖液的Bio-Rad凝膠電泳儀的電泳槽內(nèi),分別往孔道中加入6μL DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和6μL RT-PCR或RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的混合液(比例:1μL反應(yīng)產(chǎn)物/5μL 6X上樣緩沖液)后,蓋上電泳槽,通電1~5 V/cm,使DNA向陽(yáng)極移動(dòng).電泳完畢后,取出凝膠,在Bio-Rad成像系統(tǒng)中檢查凝膠并拍照.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒方法的建立 大規(guī)模組織培養(yǎng)無(wú)病毒種薯,能大大減少馬鈴薯卷葉病毒對(duì)生產(chǎn)的危害,然而,在其生產(chǎn)過(guò)程中尤為需要對(duì)大規(guī)模樣本進(jìn)行快速的病毒檢測(cè).因此,本研究構(gòu)建了微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒方法,即用無(wú)菌大頭針刺馬鈴薯植株的莖尖,將粘附了組織汁液的針尖浸在RT-LAMP反應(yīng)液中,于65℃恒溫反應(yīng)60 min.由于植物組織汁液中含有微量的馬鈴薯卷葉病毒RNA,病毒RNA在RT-LAMP反應(yīng)液中先被M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,然后cDNA被Bst DNA聚合酶在針對(duì)馬鈴薯卷葉病毒外殼蛋白基因ORF3的2對(duì)引物(表1中F3/B3和 FIP/BIP)作用下進(jìn)行擴(kuò)增.其擴(kuò)增產(chǎn)物為大小不一的DNA片段(見(jiàn)圖2B中的瀑布狀片段).同時(shí)伴隨DNA的合成產(chǎn)生大量焦磷酸根離子,該離子與反應(yīng)液本身所含有的鎂離子結(jié)合形成肉眼可視的白色沉淀-焦磷酸鎂.如有白色沉淀,即可判定為帶PLRV植株;如沒(méi)有白色沉淀的出現(xiàn),即可判定為無(wú)病毒植株.

    2.2 微量植物組織汁液直接RT-LAMP可視化檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒方法的可靠性 圖2A:馬鈴薯莖尖直接RT-LAMP反應(yīng)的肉眼觀察所得的結(jié)果.PCR管+:陽(yáng)性對(duì)照(已感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品),反應(yīng)液中出現(xiàn)白色沉淀;PCR管-:陰性對(duì)照(未感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品),反應(yīng)液清澈,無(wú)白色沉淀.圖2B:質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析以微量組織汁液為模板直接RTLAMP法及RT-PCR法和以傳統(tǒng)法提取的植物組織總RNA為模板的RT-LAMP法及RT-PCR法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.泳道M:DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);泳道W:以ddH2O為模板擴(kuò)增的結(jié)果;泳道-:未感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品的檢測(cè)結(jié)果;泳道+:已感染PLRV的馬鈴薯組培苗樣品的檢測(cè)結(jié)果:1)以傳統(tǒng)法提取的植物組織總RNA為模板擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果;2)以莖尖汁液為模板直接擴(kuò)增的檢測(cè)結(jié)果.

    由圖2可知,微量組織汁液直接RT-LAMP檢測(cè)PLRV的結(jié)果與以傳統(tǒng)法提取的植物組織總RNA為模板的RT-LAMP檢測(cè)PLRV的結(jié)果一致,說(shuō)明微量組織汁液直接RT-LAMP檢測(cè)馬鈴薯卷葉病毒的方法是可靠、可行的.通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)產(chǎn)物中有無(wú)白色沉淀來(lái)判定植株是否感染病毒的方法與瓊脂糖凝膠電泳分析法的結(jié)果一致,說(shuō)明通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)產(chǎn)物中有無(wú)白色沉淀來(lái)判定植株是否感染病毒的方法是可靠、可行的.

    圖2 利用引物對(duì)PLRV ORF3序列進(jìn)行RT-PCR和RT-LAMP擴(kuò)增的結(jié)果Fig.2 Amplification results of PLRV ORF3 sequence using primers in RT-PCR and RT-LAMP

    3 結(jié)束語(yǔ)

    該方法不僅限于對(duì)馬鈴薯卷葉病毒的檢測(cè),還可通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)其它病毒靶基因序列的引物,應(yīng)用于其它病毒(如水稻黑條矮縮病毒[12]、草莓輕型黃邊病毒[13])的檢測(cè)中.該方法與以往的檢測(cè)方法相比,具有以下3個(gè)優(yōu)點(diǎn).1)迅速:該方法無(wú)需RNA提取,無(wú)需瓊脂糖凝膠電泳成像或熒光顯色,減少了至少2~3 h的檢測(cè)時(shí)間;2)操作簡(jiǎn)便:RNA提取和瓊脂糖凝膠電泳成像的操作難度較大,需要具備一定操作技能的人員經(jīng)過(guò)一段時(shí)間反復(fù)試驗(yàn)才能掌握其操作技術(shù).該方法無(wú)需RNA提取和瓊脂糖凝膠電泳成像,操作十分簡(jiǎn)便,任何人員都可迅速掌握其操作技術(shù);3)成本低:RT-PCR檢測(cè)法需要PCR儀,然而一個(gè)價(jià)格最低的PCR儀花費(fèi)上萬(wàn)元.RT-PCR和RT-LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物需要瓊脂糖凝膠電泳成像進(jìn)行檢查和分析,然而價(jià)格最低的電泳儀和成像系統(tǒng)花費(fèi)上萬(wàn)元.該方法只需要一個(gè)任何實(shí)驗(yàn)室都具備的儀器——恒溫水浴鍋,因此大大減少了檢測(cè)成本.雖然該方法靈敏度不及RTPCR(如圖2B所示),但其所具有的3個(gè)優(yōu)點(diǎn)使其適用于對(duì)大規(guī)模脫病毒樣本的病毒檢測(cè),在大規(guī)模組織培養(yǎng)無(wú)病毒種薯、花卉和苗木生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用空間,而且它適用于任何一個(gè)植物病毒檢測(cè)機(jī)構(gòu),特別是實(shí)驗(yàn)設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單、操作人員技能相對(duì)有限的基層機(jī)構(gòu).

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