固相微萃取-氣相色譜/質(zhì)譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法分析四種茶油的揮發(fā)性成分

鐘培培， 喻 晴， 王遠(yuǎn)興

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌 330047)

油茶籽油俗稱茶油，它是從山茶科山茶屬植物的普通油茶(CamelliaoleiferaAbel)成熟種子中提取的純天然高級食用植物油，屬我國特有的木本食用油脂。茶油中富含多種功能性成分，營養(yǎng)豐富，具有調(diào)節(jié)血脂，降低膽固醇含量，預(yù)防心腦血管疾病，延緩動脈粥樣硬化等功效[1]。精制茶油是粗制茶油經(jīng)過一系列的脫膠、脫酸、脫色、脫臭等生產(chǎn)工藝加工制成，而粗制茶油顏色較深，氣味較豐富。外用山茶油主要用于外用護(hù)膚，不宜食用。茶油放置時間過久會發(fā)生變質(zhì)，從而失去原有的營養(yǎng)價值。

固相微萃取(SPME)是一種新型無溶劑樣品前處理技術(shù)，一般在2～30 min內(nèi)可達(dá)吸附平衡[2]，已廣泛應(yīng)用于油脂揮發(fā)物質(zhì)的分析。通過氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)檢測多個樣本后所得到的樣品信息具有數(shù)據(jù)信息復(fù)雜、多維數(shù)據(jù)矩陣內(nèi)各變量之間具有高度的相關(guān)性等特點，常常無法用傳統(tǒng)的單變量分析方法進(jìn)行提取，但與多元統(tǒng)計分析手段結(jié)合后可以確定樣本之間的相似性或均一性。其中，主成分分析方法可以高分辨、高效率地確定引起組間差異的化學(xué)成分[3]；聚類分析是以“物以類聚”的原理,根據(jù)所測樣品的諸多屬性,按照所測樣品性質(zhì)的親疏遠(yuǎn)近程度而進(jìn)行分類的一種多元統(tǒng)計學(xué)分析方法[4]。本文采用SPME技術(shù)提取4種茶油中的揮發(fā)性物質(zhì)，通過GC/MS與保留指數(shù)對其中的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，并采用主成分分析和聚類分析技術(shù)比較4種茶油揮發(fā)性物質(zhì)的成分差異，為茶油的質(zhì)量鑒別與品質(zhì)控制提供了有效的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、材料與試劑

7890-7000氣相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Agilent公司)，配有Mass Hunter Workstation色譜工作站和NIST MS Search 2.0質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫；57330-U SPME手柄及50/30 μm二乙烯基苯-碳分子篩-聚二甲基硅氧烷(DVB-CAR-PDMS，Stable flex)固相微萃取纖維頭(美國，SUPELCO公司)；AL104電子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)。

從市場上采集精制茶油、粗制茶油、外用茶油及過期茶油(儲存時間超過保質(zhì)期1年以上)4種茶油樣本，其中精制茶油與粗制茶油各7個樣本，外用茶油及過期茶油各8個樣本，4種茶油于4 ℃冰箱中存放。

正構(gòu)烷烴(C7～C30)的混合標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純，美國AccuStandard公司)；正己烷(色譜純，德國Merck公司)。

1.2 樣品前處理

稱取6.00 g茶油樣品于20 mL頂空萃取瓶中，將頂空萃取瓶置于80 ℃水浴鍋中平衡20 min，再將固相萃取頭插入頂空萃取瓶中，萃取吸附50 min。萃取結(jié)束后將萃取頭放入GC/MS進(jìn)樣口中，于250 ℃解析5 min后，進(jìn)行GC/MS測定。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：HP-5 MS石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：起始柱溫30 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至110 ℃，然后以4 ℃/min升至150 ℃，最后以10 ℃/min升至220 ℃保持5 min；載氣為高純氦氣(純度≥99.999%)；流速為1 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流比為2∶1。電子轟擊離子源(EI)；電子能量70 eV；四極桿溫度為150 ℃，離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲為3 min；質(zhì)量掃描為全掃描模式，質(zhì)量范圍m/z30～500。

1.4 茶油揮發(fā)性成分保留指數(shù)(Retention Index,RI)的測定

取正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3條件進(jìn)行GC/MS分析，進(jìn)樣量1 μL，分流比為10∶1，記錄每種正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時間，采用Kovats保留指數(shù)(Retention Index,RI)來計算各組分的RI值:

RI=100n+100(TRx-TRn)/(TRn+1-TRn)

(1)

式中：RI為待測組分的保留指數(shù)；TRx為待測組分的保留時間；n和n+1 分別表示正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)；其中TRn

1.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)NIST MS Search 2.0質(zhì)譜圖庫檢索結(jié)果，并結(jié)合保留指數(shù)參考文獻(xiàn)值對4種茶油的揮發(fā)性成分進(jìn)行初步篩查鑒定，并運用峰面積歸一化法測得各揮發(fā)性成分的相對百分含量。以樣本揮發(fā)性物質(zhì)的相對峰面積為變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0版軟件，將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶油的揮發(fā)性成分的定性分析

經(jīng)過GC/MS檢測后，根據(jù)NIST MS Search 2.0質(zhì)譜圖庫檢索結(jié)果，結(jié)合保留指數(shù)文獻(xiàn)值對精制、粗制、外用及過期茶油中的共同成分進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果詳見表1。由表1可知，4種茶油共初步鑒別出81種揮發(fā)性成分，精制茶油中共同含有31種揮發(fā)性成分，包括11種醛類(47.7%)，4種酮類(1.55%)，1種醇類(1.58%)、3種烯烴類(4.97%)，8種烷烴類(39.99%)，1種呋喃類(1.89%)，1種芳香烴(0.78%)、1種酸(0.26%)，一種單帖(1.26%)，其中十二烷(21.23%)、壬醛(18.48%)、己醛(8.4%)、反式-2-庚烯醛(5.71%)含量較高；在粗制茶油中共同含有43種揮發(fā)性成分，包括12種醛類(60.54%)、2種酮類(4.41%)、1種醇(1.01%)、6種酚類(4.32%)、4種烷烴類(4.94%)、4種烯烴類(1.57%)、1種呋喃(0.94%)、3種芳香烴(8.49%)、7種酯(4.44%)、1種萘(0.11%)，1種胺(4.5%)，其中(反，反)-2，4-癸二烯醛(16.15%)、壬醛(10.91%)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(2.12%)含量較高；外用茶油各樣品共同含有33種揮發(fā)性成分，包括14種醛類(85%)，5種酮類(5.16%)，3種醇類(3.86%)，1種酸酐(0.64%)，3種烷烴類(0.27%)，4種烯烴類(2.59%)，2種呋喃(0.44%)，其中反式-2-十一烯醛(13.76%)，反式-2-癸烯醛(24.7%)，壬醛(14.45%)，己醛(11.41%)含量較高；過期茶油各樣品共同含有50種揮發(fā)性成分，19種醛類(75.13%)、9種酮類(4.64%)、6種醇類(6.99%)、1種酸酐(4.65%)、3種烷烴類(0.6%)、3種烯烴類(2.14%)、3種酯(0.68%)、1種呋喃(2.14%)、3種酸(0.42%)、2種芳香烴(2.62%)，其中己醛(13.06%)，(反，反)-2，4-癸二烯醛(10.87%)，反式-2-十一烯醛(9.73%)，反式-2-癸烯醛(9.29%)，反式-2-辛烯醛(9.18%)相對含量較高。從中可以看出精制茶油中烷烴和醛類相對含量較高，粗制茶油中醛類、芳香烴、酚類成分的相對含量較高，過期茶油中的醛類、醇類成分相對含量較高，外用茶油中的醛類和酮類成分相對含量最高。四種茶油樣品中共同含有己醛、庚醛、3-乙烯基-環(huán)己酮、3-丙基環(huán)己烯、反式-2-庚烯醛、2-戊基呋喃、反-2-辛烯醛、反式-3-辛二烯-2-酮、壬醛、癸醛、反式-2-癸烯醛、茴香腦、(反，反)-2，4-癸二烯醛、反式-2-十一烯醛、十四烷等揮發(fā)性成分。

表1 4種茶油揮發(fā)性成分定性分析結(jié)果

(續(xù)表1)

No.tRCompoundMolecular formulaRetention indexRIexpRIlitIdentificationRelative content(%)RefinedCrudeExternal usingExpired5623.3755-Butyldihydro-2(3H)-FuranoneC8H14O212621277MS,RI-0.83-0.125723.470(E)-2-DecenalC10H18O12651267[5]MS,RI3.947.8224.79.295823.571-Oxaspiro[4.5]decan-2-oneC9H14O21269-MS--1.740.635923.8102,6-Dimethyl-5,7-octadi-en-3-olC10H18O1276-MS---0.460244-EthylguaiacolC9H12O212811280[17]MS,RI-2.12--6124.442Cis-AnetholC10H12O12961293[5]MS,RI0.787.791.872.566224.581TridecaneC13H2813011300MS,RI0.40.13--6324.9342-MethylnaphthaleneC11H1013121289MS,RI-0.11--6425.143(E,E)-2,4-DecadienalC10H16O13191322[5]MS,RI1.6516.154.0310.876525.244α-2-Dimethyl-1-cyclo-hexene-1-acetaldehydeC10H16O1323-MS---0.046625.9134,4,6-Trimethyl-cyclohex-2-en-1-ol C9H16O1251-MS-1.012.573.146726.2222,6-Dimethoxy-phenolC8H10O313551347MS,RI-0.94--6826.3865-AllylguaiacolC10H12O213581360MS,RI-0.08--6926.513(E)-2-UndecenalC11H20O13671369[5]MS,RI1.99.8313.769.737026.967Fumaric acid,decyl 3-methylbut-3-enyl esterC19H32O41383-MS---0.447127.561TetradecaneC14H3014001400MS,RI8.122.220.170.217229.998CyclopentadecaneC15H3014831480[18]MS,RI1.41---7330.1121-PentadeceneC15H3014871491MS,RI0.570.12--7430.693EremophileneC15H2415091514MS,RI--2.14-7532.959HexadecaneC16H3416011600MS,RI1.260.590.06-7634.380Oleic acidC18H34O21680-MS---0.077734.74HeptadecaneC17H3617001700MS,RI--0.04-7835.851OctadecanolC18H38O1778-MS1.58---7935.946(Z)-13-Eicosenoic acidC20H38O21784-MS0.26---8038.497Ethyl palmitateC18H36O219961995[17]MS,RI-0.2--8139.905Methyl oleateC19H36O221042100[19]MS,RI-0.35--

Note：tR:retention time；RIexp:Retention index for detection；RIlit:Retention index for literature.

圖1 4種典型茶油樣本的揮發(fā)性成分的總離子流圖 Fig.1 Total ion current chromatograms of volatile components in four typical camellia oils the serial number(1-81) of volatile competents are the same as those table 1.

圖2 4種茶油12個樣本的揮發(fā)性成分縱向疊加總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatograms of volatile components in 12 camellia oil samples stacked by vertical pattern

茶油風(fēng)味清淡，多數(shù)風(fēng)味化合物為油脂內(nèi)部分解產(chǎn)生，醛類風(fēng)味閥值一般較低，對油脂風(fēng)味有突出貢獻(xiàn)。其中，己醛、庚醛和2-戊基呋喃為亞油酸的氧化裂解產(chǎn)物，壬醛和辛醛為油酸的氧化裂解產(chǎn)物。己醛具有強(qiáng)烈的青香、木香、草香、蔬菜、水果香氣，庚醛具有類似甜杏、堅果香氣，2-戊基呋喃具有豆香、果香、泥土、青香及類似蔬菜香氣，壬醛具有蠟香、甜桔香、脂肪香、花香，辛醛高濃度有粗油脂味，低濃度呈甜橙、輕微油脂、蜂蜜樣香氣[5]。過期茶油中的哈喇氣味是由普通茶油油脂的氧化酸敗生成的一些小分子的醛、酮、醇而產(chǎn)生的[20]，所以過期茶油中的醛、酮、醇類等成分含量高于其它3種茶油。粗制茶油中的酚類物質(zhì)含量高于精制茶油，是因為茶油在堿煉過程中大量酚類物質(zhì)遭到破壞，而且茶油在精煉過程中還會損失一部分揮發(fā)性成分，所以粗制茶油的成分較為復(fù)雜，氣味比精制茶油豐富。精制茶油與外用茶油的加工方式不同，用途不同，也就導(dǎo)致了揮發(fā)性成分之間存在差異。

4種茶油的典型總離子流圖色譜見圖1(各峰編號同表1)。不同種類的茶油其揮發(fā)性成分及其含量會有差別，同一種類不同的茶油樣品由于地域、生產(chǎn)時間、生產(chǎn)機(jī)器等因素的不同其各揮發(fā)性成分組成及含量也會存在較大差別。圖1是從各類茶油中選取的比較典型的樣本，可以看出4種茶油成分復(fù)雜，在本實驗中所采用的色譜-質(zhì)譜條件能較好的將其中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分離。圖2是4種茶油其中的12個樣本揮發(fā)性成分縱向疊加總離子流色譜圖。

2.2 主成分分析

利用SIMCA-P 13.0軟件對4種茶油樣品揮發(fā)性成分的相對含量進(jìn)行主成分分析，由結(jié)果可知，第一主成分的貢獻(xiàn)率為33.9%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為21.3%，第三主成分的貢獻(xiàn)率為13.3%，第四主成分的貢獻(xiàn)率為5.37%，第五主成分的貢獻(xiàn)率為3.1%，第六主成分貢獻(xiàn)率為2.66%，累積貢獻(xiàn)率為79.6%，足以說明數(shù)據(jù)的變化趨勢。圖3為4種茶油的主成分二維得分圖和二維載荷圖。

從圖3(A)可以看出4種茶油在主成分空間中的分布較為分散，且均處于相對獨立的空間，基本得到有效區(qū)分，說明四種茶油的揮發(fā)性成分存在明顯的差異。由圖3(B)可以看出，不同的變量對茶油的區(qū)分模型的建立和貢獻(xiàn)是不同的。圖3(A)得分圖表示各種樣品基于揮發(fā)性成分含量的相似性和差異性，圖3(B)則能比較明顯的看出區(qū)分這些樣品的關(guān)鍵變量。其中癸烷(19)、檸檬烯(23)、2-壬酮(34)、十一烷(36)、3-甲基十一烷(45)、十三烷(62)、環(huán)15烷(72)、十六烷(75)、十八醇(78)、5-十八碳烯醛(79)等揮發(fā)性成分在載荷圖中的位置與得分圖中精制茶油的位置類似，說明這些成分在精制茶油中較其它種類油高。三乙胺(1)、苯乙烯(5)、間乙基甲苯(31)、愈創(chuàng)木酚(33)、3-甲基-2-丁烯酸十七烷基酯(42)、甘菊藍(lán)(46)、反式-2-甲基巴豆酸異戊酯(49)、2-己烯酸乙酯(55)、2-甲基萘(63)、2，6-二甲氧基苯酚(67)、5-丁香酚(68)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(60)、棕櫚酸乙酯(80)、油酸甲酯(81)等揮發(fā)性成分在載荷圖中的位置與得分圖中粗制茶油的位置類似，其在粗制茶油中的含量較高。反式-3-壬烯-2-酮(40)、壬烷(8)、反式-2-戊烯醛(3)、己醛(4)、正辛醛(20)、反式-2，4-庚二烯(22)、正己酸(24)、3，5-辛二烯-2-醇(25)、桃醛(27)、反式-2-辛烯醛(28)、己酸酐(29)、2，5-二甲基環(huán)己醇(35)、(反，反)-2，4-辛二烯醛(38)、17-十八炔酸(47)、癸醛(51)、1-氧雜螺[4.5]癸-2-酮(58)、2，6-二甲基-5，7-辛二烯-2-醇(59)、油酸(76)等揮發(fā)性物質(zhì)的載荷圖與得分圖中過期茶油所處的位置類似，所以在過期茶油中這些揮發(fā)性成分的含量高于其它種類油。3-乙烯基環(huán)己酮(10)、反式-2，4-庚二烯醛(18)、2-正丙基呋喃(21)、(反，反)-3-辛二烯-2-酮(32)、茴香腦(61)、佛術(shù)烯(74)、十七烷(77)等揮發(fā)性成分在載荷圖中的位置與得分圖中外用茶油所處的位置類似，所以這些成分在過期茶油中的含量較高。

圖4 4種茶油的聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster dendrogram of 4 types of camellia oils

2.3 聚類分析

圖4為4種茶油樣本的聚類分析圖，其中縱坐標(biāo)代表類間距離，而橫坐標(biāo)代表茶油的樣本編號。臨界值λ=590時，茶油樣本分為兩大類，過期茶油(15～22)聚為一類，其余三種茶油聚為一類，臨界值λ=490時，茶油樣本分為三類，過期茶油與粗制茶油(8～14)各聚為一類，外用茶油(23～30)與精制茶油(1～7)聚為一類，臨界值λ=350時，茶油樣本分為四類，四種茶油各聚為一類。聚類分析圖直觀地顯示了整個聚類過程，縮小了憑借主觀判斷造成的誤差。聚類分析結(jié)果表明，不同種類的茶油具有明顯的內(nèi)在差異，精制茶油與外用茶油揮發(fā)性成分的差異程度最小，其次是粗制茶油，精制茶油與過期茶油揮發(fā)性成分差別最大。由此可見，采用聚類分析可將不同種類的茶油得以較好的聚類。

3 結(jié)論

本實驗通過SPME-GC/MS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對4種不同種類的茶油揮發(fā)性成分進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，4種茶油共鑒定出81種揮發(fā)性成分，其中醛類在4種茶油中的含量最高，是構(gòu)成茶油香氣的主要成分。利用主成分分析方法提取了6個主成分，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到79.6%，從主成分得分圖中可直觀看出不同種類茶油間的差異，從載荷圖中可以明顯找出區(qū)分不同種類茶油的差異成分。利用聚類分析可以看出各種茶油之間的親疏遠(yuǎn)近，其中精制茶油與外用茶油的揮發(fā)性成分最為接近。SPME-GC/MS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法能夠?qū)崿F(xiàn)不同種類茶油或其它品種油的區(qū)分，并篩選出其中的差異成分，也可用于茶油的產(chǎn)地判別研究，為茶油的質(zhì)量鑒別與品質(zhì)控制提供了有效的檢測方法。