基質(zhì)固相分散-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測雞蛋中14種氟喹諾酮類藥物殘留

羅 靜, 鄭良清, 尚吟竹, 趙曉亞, 葉 誠, 王 晗, 車志龑, 王 鵬*

(武漢海關，湖北武漢 430050)

氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones,FQs)是一類人工合成的廣譜、高效、低毒抗菌藥，在畜牧養(yǎng)殖中被廣泛用于預防和治療動物疾病，但其在禽類養(yǎng)殖過程中的濫用，會導致食品樣本中累積量急劇遞增，對人體健康造成不可預測的潛在風險[1 - 3]。因此，在我國國家標準(GB/T 2007)中對其進行了限量：雞蛋中西諾沙星、恩諾沙星、洛美沙星、氧氟沙星檢出量不得超過0.5 μg/kg；沙拉沙星、諾氟沙星、培氟沙星檢出量不得超過1.0 μg/kg；環(huán)丙沙星檢出量不得超過1.2 μg/kg；依諾沙星檢出量不得超過1.5 μg/kg。

目前，食品中喹諾酮類藥物殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法[4]、毛細管電泳法[5 - 6]、高效液相色譜法[7 - 8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9 - 11]和氣相色譜-質(zhì)譜法等。其中，基于LC-MS/MS的檢測方法靈敏度高，能對多種喹諾酮類藥物進行同時篩選和確證，是氟喹諾酮類藥物多組分殘留確證檢測的最佳方法之一。然而，食品樣品中氟喹諾酮類藥物的檢測一直缺乏合適的樣品前處理技術(shù)。以雞蛋樣品為例，由于樣品基質(zhì)復雜，氟喹諾酮類藥物殘留量通常較低，因此目前通常采用溶劑提取的方式進行預處理，步驟繁瑣、溶劑消耗量大、且耗時較長。相比之下，基質(zhì)固相分散(Matrix Solid Phase Dispersion，MSPD)技術(shù)[12 - 14]這種適用于固體、半固體樣品的前處理方法，具有操作簡單快捷、抗基體干擾能力強的特點，非常適合作為雞蛋樣品的前處理手段。

本工作以14種氟喹諾酮類藥物為研究對象，建立了一種MSPD-LC-MS/MS分析方法，在簡化樣品前處理過程的基礎上，實現(xiàn)了雞蛋中14種氟喹諾酮類藥物殘留的高靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、藥品與試劑

8050型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本，島津公司)；2-16PK型低溫離心機(德國，Sigma)；MS2型漩渦混合儀(德國，IKA)；TurboVap LV型氮吹儀(瑞典，Biotage);ECLIPSE 80i顯微鏡(日本，Nikon)。

雙氟沙星(純度90.0%)、依諾沙星(純度99.0%)、氧氟沙星(純度99.0%)、諾氟沙星(純度99.1%)、環(huán)丙沙星(純度94.0%)、洛美沙星(純度98.7%)、達氟沙星(純度94.0%)、恩諾沙星(純度99.0%)、沙拉沙星(純度97.0%)、西諾沙星(純度99.5%)、氟羅沙星(純度99.6%)、奧比沙星(純度97.7%)、司帕沙星(純度98.8%)、馬波沙星(純度99.0%)，均購于Dr.E公司。標準貯備溶液：準確稱取10.00 mg標準品，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，若不能完全溶解，加入200 μL甲酸。此溶液濃度為1 mg/mL，4 ℃ 下避光保存，有效期為6個月。將各標準儲備液稀釋，配成混合標準溶液，各組分濃度均為10 μg/mL。精確吸取適量混合標準工作液用初始流動相逐級稀釋，加入到與試樣基質(zhì)相應的陰性樣品中，使各目標分析物濃度為0.1～50 μg/kg，所有樣品均設置5個平行組。乙酸、乙腈為色譜純試劑。

1.2 樣品前處理

雞蛋去殼，蛋清和蛋黃攪拌均勻。取1.0 g均質(zhì)樣品置于研缽中，加入3.0 g硅膠，研磨均勻后裝入容量為30 mL的注射器內(nèi)，注射器底部及硅膠上部各墊一張濾紙，壓實樣品。用30 mL氨甲醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，8 000 r/min離心后，取上層清液于45 ℃條件下氮氣吹至近干。然后加入1 mL 0.1%乙酸溶液，漩渦混合1 min，12 000 r/min超速離心10 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾，濾液待測。

1.3 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GISS C18柱(50×2.1 mm，1.9 μm)，流速：0.25 mL/min，柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。流動相A：0.1%乙酸溶液；流動相B：乙腈。洗脫梯度如下： 0～6 min，95%A；6～8 min，95%～88%A；8～12 min，88%A；12～16 min，88%～75%A；16～18 min，75%A；18～20 min，75%～10%A；20～23 min，10%A；23 min10%～95% A；23～27 min，95%A。

1.4 質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI+；噴霧電壓(IS)：5 500 V；霧化器(N2)：12 mL/min；氣簾氣(N2)：9 mL/min；輔助氣(N2)流速：8 mL/min；離子源溫度：480 ℃；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)模式；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 14種氟喹諾酮類抗生素最優(yōu)化的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法優(yōu)化

雞蛋樣品中含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，因此樣品易乳化，基質(zhì)干擾嚴重，樣品預處理過程中重現(xiàn)性通常較差，導致喹諾酮類藥物殘留分析困難。國家標準(GB/T 20366-2006)方法中，采用甲酸-乙腈混合溶液配合均質(zhì)器均質(zhì)提取兩次，提取液用乙腈飽和的正己烷除脂凈化的方式進行預處理；國家標準(GB/T 21312-2007)方法中，采用磷酸鹽水溶液超聲輔助提取，HLB固相萃取柱純化的方式進行預處理。雖然以上預處理方法能得到較好的純化效果，但需要均質(zhì)器或超聲輔助，且耗時長、操作復雜、試劑消耗量大、成本高。為了在保證良好的重現(xiàn)性及較高的提取效率的前提下簡化預處理過程，本實驗采用了基質(zhì)固相分散的方法，將適量雞蛋直接與硅膠混合研磨，使雞蛋均勻分散于硅膠顆粒的表面，裝柱后進行洗脫。

2.1.1洗脫液的選擇比較了不同洗脫液對目標物的洗脫效果，按照預處理方法裝柱后，分別加入相同體積的洗脫液1(乙腈/乙酸=99/1)、洗脫液2(乙腈/氨水=20/1)、洗脫液3(氨甲醇溶液)進行洗脫，結(jié)果表明，氨甲醇溶液的洗脫效果最佳。

2.1.2洗脫液體積的優(yōu)化為保證14種氟喹諾酮類藥物能被完全洗脫，以加標5 μg/kg的空白雞蛋樣品為目標模型，依次用10 mL氨甲醇溶液洗脫5次，采用LC-MS/MS分別對5次洗脫液進行分析。結(jié)果表明，洗脫3次后洗脫液中不再有待測物檢出，因此選擇洗脫液體積為30 mL。

2.1.3基質(zhì)固相分散提取過程在本工作的基質(zhì)固相分散提取過程中，固定相硅膠主要起到分散樣品的作用。通常，在有機溶劑提取過程中，雞蛋樣品會產(chǎn)生蛋白質(zhì)凝結(jié)(如圖1b)，導致目標分析物被蛋白包裹而無法被完全提取，因此在國家標準中需采用均質(zhì)器輔助提取。而根據(jù)顯微鏡成像分析(如圖1a)，固定相硅膠的輔助使得雞蛋樣品在加入有機溶劑的情況下，依然能夠均勻地附著在硅膠顆粒表面，即保證了樣品與洗脫溶劑在洗脫過程中依然能夠充分接觸，從而達到更好的提取效果和提取重現(xiàn)性。

圖1 MSPD(a)與液-液萃取(b)后樣品的顯微成像圖Fig.1 Microscope images of egg samples subjected to MSPD(a) and liquid-liquid extraction(b)

圖2 空白雞蛋試樣中添加氟喹諾酮類藥物色譜圖Fig.2 Chromatogram of fluoroquinolones in spiked egg samples(1) difloxacin,(2) enoxacin,(3) ofloxacin,(4) norfloxacin,(5) ciprofloxacin,(6) lomefloxacin,(7) danofloxacin,(8) enrofloxacin,(9) sarafloxacin,(10) cinoxacin,(11) fleroxacin,(12) orbifloxacin,(13) sparfloxacin,(14) marbofloxacin(5 μg/kg).

2.2 液相條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇由于喹諾酮類化合物的叔胺基和羧基官能團能在水中發(fā)生解離，色譜柱固定相表面的殘存硅醇基和金屬離子可通過氫鍵或離子交換作用保留喹諾酮類化合物，導致目標分析物色譜峰拖尾、保留時間不穩(wěn)定或過長，甚至被完全保留在色譜柱上。因此需要選用以高純硅膠為基體并經(jīng)端基封閉處理的C18柱作為分離柱。本工作采用Shim-pack GISS C18柱進行了分離實驗，可滿足色譜分離要求。

2.2.2流動相的選擇與優(yōu)化流動相的pH值對喹諾酮類化合物的分離和保留具有顯著影響：(1)喹諾酮類化合物為酸堿兩性化合物，其解離狀態(tài)和在流動相中的溶解性隨流動相的pH值而變化；(2)硅膠基鍵合固定相表面的殘余硅醇基的解離程度與流動相的pH值有關，pH>3即可完全解離。為維持流動相的低pH值以抑制硅醇基的解離和保證喹諾酮類化合物在流動相中的穩(wěn)定溶解狀態(tài)，達到較好的分離效果，實驗中試驗了各種流動相。結(jié)果表明，0.1%乙酸溶液與乙腈進行梯度洗脫時，能實現(xiàn)各待測物質(zhì)完好分離。色譜分離情況如圖2所示。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用1 mg/L的目標分析物標準溶液在正離子模式下進行母離子全掃描，確定各種抗生素的分子離子，然后分別以各種喹諾酮類化合物的分子離子為母離子，對其子離子進行全掃描。喹諾酮化合物的二級質(zhì)譜中主要的碎片離子峰是喹諾酮藥物分子的脫水峰([M+H-H2O]+)、脫羧峰([M+H-CO2]+)以及脫羧后哌嗪環(huán)斷裂發(fā)生結(jié)構(gòu)重排失去CHR的產(chǎn)物離子([M+H-CO2-CHR]+)，以沙拉沙星為例，當碰撞電壓較小時，主要是脫水峰、脫羧峰，產(chǎn)生m/z368.1和m/z342.2的二級碎片。升高碰撞電壓，哌嗪環(huán)斷裂，產(chǎn)生m/z299.1 的二級碎片，其可能的裂解途徑見圖3。

圖3 沙拉沙星碎片離子可能裂解途徑Fig.3 Possible fragmentation pathway of sarafloxacin

選取豐度較強、干擾較小的兩對子離子為定性離子。最后以多反應監(jiān)測(MRM)正離子模式優(yōu)化各種質(zhì)譜參數(shù)，最優(yōu)參數(shù)列入表1。

2.4 分析性能

電噴霧電離離子源(ESI)易受樣品基質(zhì)的影響，實驗中發(fā)現(xiàn)雞蛋樣品的基質(zhì)會對喹諾酮類藥物的離子峰信號產(chǎn)生增強效應，因此我們采用向陰性雞蛋樣品中添加標準品的方式進行定量。結(jié)果表明，14種氟喹諾酮藥物的檢出限為0.1 μg/kg，方法線性范圍為0.1～50.0 μg/kg,相對標準偏差(RSD)在8.8%～10.4%之間(c=0.5 μg/kg,n=3)。

2.5 回收率與精密度

在與檢測樣品基質(zhì)相同的陰性樣品中添加不同濃度的氟喹諾酮標準品，每個水平做5個平行樣，測定結(jié)果見表4?？瞻讟悠分刑砑幼畹蜐舛鹊?4種氟喹諾酮類藥物的標準溶液，以3倍信噪比為檢出限，計算得出14種氟喹諾酮類藥物檢出限達到0.1 μg/kg。

表2 平均回收率及精密度(n=5)

2.6 實際樣品的測定

采用本工作建立的方法對湖北出入境檢驗檢疫局接檢的50個樣品進行分析，結(jié)果有兩個雞蛋樣品中恩諾沙星的殘留量超出限量標準，殘留量分別為1.10 μg/kg和4.95 μg/kg。由檢測結(jié)果可知，陽性樣品檢出率較低，證實了市場上大部分雞蛋中的喹諾酮類藥物殘留未超出限量標準。

3 結(jié)論

本文建立了一種基質(zhì)固相分散-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測14種殘留氟喹諾酮類藥物的新方法，具有快速、簡便和高靈敏的優(yōu)點，適合于固體及半固體食品樣品，特別是雞蛋樣品中多種氟喹諾酮類藥物的高通量分析，相較于國家標準方法優(yōu)勢明顯。