快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定26味中藥中黃曲霉毒素

朱筱玲*

(江西省分析測試研究所，江西南昌 330029)

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)是黃曲霉(Aspergillus Flavus)、寄生曲霉(Aspergillus Parasiticus)和模式曲霉(Aspergillus Nomius)等在高溫高濕時產(chǎn)生的，一組結構中含有一個雙氫呋喃環(huán)和一個氧雜萘鄰酮的劇毒次級代謝產(chǎn)物，對人畜有強烈致癌、致突變和致畸毒性。常見的主要有AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2等。其中，AFT B1的三致性最強，在糧食和經(jīng)濟作物中廣泛存在，從國際上制定的諸多標準可見其危害性和受重視程度[1]。我國對AFT監(jiān)測主要集中于食品[2]和飼料[3]，隨著對中藥需求的增加，國家近年也加強了中藥監(jiān)管。江西屬高濕高熱地區(qū)，中藥在生產(chǎn)、加工、貯藏、運輸過程中因條件和技術簡陋極易霉變污染黃曲霉毒素。中國藥典[4]監(jiān)測AFT的有植物源性14味和動物源性5味共計19味中藥，規(guī)定AFT B1和4種AFT總量的最高限量分別為5 μg/kg和10 μg/kg，比2010年版中國藥典的5味大幅增加。

AFT檢測方法有薄層層析法(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)[5 - 12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[13 - 16]。TLC法操作麻煩、定量差，實際應用少；ELISA法不能測定單個AFT且假陽性率高；HPLC法樣品需衍生，操作復雜并對中藥易產(chǎn)生假陽性[8]；同位素稀釋LC-MS/MS法[5]標準品購買難且價格昂貴。凈化柱有用超順磁納米免疫磁珠[9]、Oasis HLB固相萃取柱(SPE)[11]和混合型SPE[12]等。以上各柱不具特異性，復雜基質(zhì)尚需進一步采用免疫親和柱(IAC)[5]?；趩慰寺】贵w免疫技術的IAC通過抗原抗體結合特異性地吸附目標物，其他雜質(zhì)不保留，可實現(xiàn)對復雜基質(zhì)樣品的凈化，適合中藥中痕量物質(zhì)快速定量分析。用免疫親和柱凈化-快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對中藥中AFT的測定未見報道。該方法靈敏度高、特異性強、污染少，符合當前綠色檢驗的要求。通過對26味中藥800余批次樣品的檢測未出現(xiàn)一例假陽性，具有實用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

6410B型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)，配有1200SL快速液相色譜系統(tǒng)，電噴霧離子源(ESI)及Masshunter數(shù)據(jù)處理軟件；Toxin Fast黃曲霉毒素免疫親和柱(3 mL，北京華安麥科生物技術有限公司)；MecoSep 226真菌毒素多功能凈化柱(美國，Romer公司)；T25 DS25型高速均質(zhì)器(德國，IKA公司)；XH-B型渦旋混合器(江蘇康健醫(yī)療用品公司)；HC3514型離心機(科大創(chuàng)新公司)。

黃曲霉毒素標準溶液(SUPELCO公司提供，B1、B2、G1、G2：LB46323～6-U；濃度均為3 μg/mL；1 mL裝，美國)；甲醇、乙腈、正己烷為色譜純(美國，Honeywell公司B&J品牌)；NaCl為分析純。實驗用水為市售哇哈哈純凈水。中藥樣品來自省內(nèi)各藥廠。

1.2 溶液的制備

1.2.1混合標準溶液將黃曲霉毒素標準溶液B1、B2、G1、G2(1 mL)分別用甲醇定容至10 mL容量瓶中，其濃度均為0.3 μg/mL，4 ℃冰箱保存。取適量4種標準儲備液用流動相稀釋分別配成濃度為1.5、3.0、4.5、6.0 ng/mL的系列混合標準溶液，制作工作曲線。

1.2.2混合基質(zhì)標準溶液取適量4種標準儲備液，用陰性樣品提取液稀釋，分別配成濃度為0.6、0.9、1.5、1.8、3.0、4.5、6.0、12.0、24.0、30.0 ng/mL的系列混合標準溶液，制作基質(zhì)校正工作曲線。

1.3 液相色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Luna C18(2)100?柱(150×2.0 mm i.d.,3μm)；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL；流動相：甲醇+5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)(50+50)；流速：0.3 mL/min。

1.3.2質(zhì)譜條件離子化模式：ESI+；霧化氣壓力：35 psi；干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：10 L/min；毛細管電壓：4 000 V；質(zhì)量掃描范圍m/z100～500；質(zhì)譜掃描方式：多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測。檢測離子對、源內(nèi)碎裂電壓及碰撞氣能量見表1。

表1 黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的MRM掃描參數(shù)

Note：*quantitative product ions.

1.4 樣品的提取和凈化

稱取過2#篩的粉末樣品2.5 g(精確至0.0001 g)，置于50 mL的塑料離心管中，加入0.5 g NaCl(如樣品脂肪含量高，先用10 mL正己烷分兩次渦旋萃取1 min，靜置后倒掉上清液)，加入15 mL甲醇+水(70+30)溶液，渦旋1 min后超聲1 h。離心5 min(4 000 r/min)，取5 mL上清液，加10 mL水稀釋后過玻璃纖維濾紙，濾液全部通過IAC，20 mL水分兩次淋洗后抽真空20 s讓空氣入柱，加1 mL甲醇溫育1 min洗脫被測物，流速保持1～3 mL/min。樣液經(jīng)0.22 μm有機相膜過濾后，上機測定。

2 結果與討論

2.1 線性關系考察

用陰性陳皮基質(zhì)配制4種黃曲霉毒素溶液，其濃度范圍為0.6～30.0 ng/mL，在優(yōu)化條件下測定，以峰面積(y)對黃曲霉毒素濃度(x，ng/mL)進行線性回歸，4種黃曲霉毒素在相應濃度范圍內(nèi)的線性良好,線性相關系數(shù)R2均大于0.999，其回歸方程和相關系數(shù)見表2。

2.2 樣品的加標回收率

用陳皮基質(zhì)標準曲線作對照，在3.0、6.0、12.0 ng/mL 3個濃度水平上進行加標回收實驗(6次平均)，黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2回收率在73.8%～100.8%范圍(表3)。

2.3 精密度試驗

以陳皮基質(zhì)標準為例，同一標準樣品重復9次進樣測定，4種黃曲霉毒素的RSD為3.5%～8.2%。

表3 三個濃度添加水平的加標回收率實驗結果(n=6)

2.4 前處理過程的優(yōu)化

2.4.1提取液的篩選黃曲霉毒素溶于甲醇和乙腈，實驗比較甲醇+水(70+30)、乙腈+水(84+16)、甲醇和乙腈作介質(zhì)，前兩種的提取效果相當且明顯好于后兩者，分析是適量的水有利于滲透到基質(zhì)復雜的中藥分子內(nèi)部而使提取更完全?？紤]毒性和成本，選擇甲醇+水(70+30)作提取液。

2.4.2提取方法的選擇樣品中黃曲霉毒素分布很不均勻，按1.4節(jié)操作(對無法過篩的樣品用高速均質(zhì)器勻漿)，比對振蕩1 h、振蕩0.5 h后超聲0.5 h、超聲1 h，無明顯差別，選擇超聲1 h。

2.4.3凈化濃縮方法的選擇比較了IAC凈化濃縮和直接過MecoSep 226 柱，后者基質(zhì)干擾嚴重，導致離子化效率降低使回收率不高，并嚴重污染分析柱和離子源，故選用前者。

2.5 色譜條件的優(yōu)化

2.5.1色譜柱的選擇比較Eclipse Plus C18柱(50×2.1 mm i.d.,1.8 μm)、Narrow Bore RR柱(100×2.1 mm i.d.,3.5 μm)和Luna C18(2) 100?柱(150×2.0 mm i.d.,3 μm)，綜合考慮采用后者能使4種AFT基線分離、峰形對稱、靈敏度高、出峰時間短，等度洗脫5 min全部出峰。

2.5.2流動相的優(yōu)化質(zhì)譜電噴霧電離是在溶液狀態(tài)，流動相的組成和添加物除了影響分析物的保留時間和峰形外，還影響分析物的離子化效率從而降低檢測靈敏度[16]。本實驗比較了：(a)甲醇+水；(b)甲醇+0.1%甲酸水溶液；(c)甲醇+5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸)三種流動相體系，結果表明(c)的離子化效率最高。進一步對(c)項比較了40+60、45+55和50+50三組，確定用最后一組。

2.5.3基質(zhì)效應的消除基質(zhì)效應根據(jù)對檢測信號影響不同分為基質(zhì)增強效應和減弱效應[11]。本實驗按照1.2節(jié)標準溶液制備，以1.5、3.0、4.5、6.0 ng/mL 4個濃度的空白山藥和陳皮基質(zhì)混合標準溶液的響應值除以用流動相稀釋混合標準溶液的響應值，結果比值在0.68～0.93之間，顯示為減弱效應。實驗中對每批次樣品嚴格采用基質(zhì)標準曲線進行校正，實現(xiàn)準確定量。

圖1 黃曲霉毒素標準(A)、桃仁基質(zhì)校正標準(B)及陽性樣品桃仁(C)的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of aflatoxin B1,B2,G1 and G2(A),Persicae Semen matrix correction(B) and positive sample Persicae Semen(C)

2.6 實際樣品的檢測

本方法共檢測陳皮、桃仁、酸棗仁、僵蠶、胖大海、柏子仁、蓮子、使君子、檳榔、麥芽、肉豆蔻、決明子、遠志、薏苡仁、大棗、地龍、蜈蚣、水蛭、全蝎、山藥、土鱉蟲、蟲草菌粉、半夏、山楂、苦杏仁及蜂膠26味中藥800余批次，無一例假陽性。還對ELISA法陽性飼料樣品進行了確證。黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2的標準和桃仁基質(zhì)標準及某1批次陽性桃仁樣品的總離子流圖見圖1。此外檢出陽性的還有酸棗仁、柏子仁、薏苡仁、檳榔、蜈蚣、土鱉蟲等，最高陽性桃仁、檳榔AFT B1和AFT B2檢出分別為46.99、47.80 μg/kg和5.24、2.95 μg/kg，兩者AFT B1均超出限量近10倍；最高陽性土鱉蟲AFT B1和AFT G1檢出分別為10.32 μg/kg和20.22 μg/kg。含脂肪高的堅果類(如花生、玉米也屬此列)、檳榔及土鱉蟲等樣品尤其易發(fā)霉產(chǎn)生黃曲霉毒素。

3 結論

本文建立了免疫親和柱凈化-快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定26味中藥中4種黃曲霉毒素方法，在實測的800多批次中藥中避免了假陽性的誤判。適用于國家藥典中中藥的黃曲霉毒素監(jiān)控。