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    MTA1基因同小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為的相關(guān)性研究

    2018-11-07 01:12:06薛洪省李建新錢海利趙志龍
    關(guān)鍵詞:肺癌小鼠

    薛洪省,韓 麗,李建新,錢海利,趙志龍

    (1大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院,遼寧大連116600;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院,分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100021)

    0 引言

    肺癌作為人類癌癥致死的首要原因,其中小細(xì)胞肺癌(small cell lung cance,SCLC)約占肺癌總數(shù)的13%[1],對(duì)于老年抽煙患者是一種死亡率較高的疾病。其腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)迅速、早期轉(zhuǎn)移以及早期對(duì)化療藥物出現(xiàn)耐藥等問(wèn)題均可以影響臨床治療效果。近40年間,無(wú)論外科手術(shù)還是化學(xué)藥物在預(yù)后方面均未取得滿意效果[2]。通過(guò)對(duì)SCLC分子生物學(xué)的研究,其惡性生物學(xué)行為逐步被揭示,新的化學(xué)藥物以及靶向藥物已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。

    肺癌形成是由于在基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中堿基異常錯(cuò)配所引起的長(zhǎng)期累積結(jié)果。在多種惡性性腫瘤中均普遍高表達(dá)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(metastasis associated protein 1, MTA1)[3-4]。 MTA 家族包括 6 個(gè)不同亞型,分 別 為: MTA1、 MTA1s、 MTA1?ZG29p、 MTA2、MTA3及 MTA3L[5]。MTA1作為染色質(zhì)核重塑和核小體去乙?;飶?fù)合體(NuRD復(fù)合體)成員之一,主要通過(guò)調(diào)控靶基因染色質(zhì)重構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄[6]。研究[7]提示,人類多種惡性腫瘤如乳腺癌、口腔鱗癌、食管鱗癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌(non?small cell lung cance,NSCLC)均與MTA1過(guò)表達(dá)密切相關(guān)。然而,SCLC中有關(guān)MTA1研究尚少,主要發(fā)病機(jī)制尚未明確。為了研究SCLC中MTA1的表達(dá)及功能機(jī)制,我們通過(guò)人SCLC及正常肺組織芯片、肺癌細(xì)胞株及MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠探索MTA1在體內(nèi)外的表達(dá)、功能及作用機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 SCLC及正常肺組織石蠟包埋組合芯片芯片中包含SCLC組織40例,正常肺組織10例,每張芯片中包含2點(diǎn)相同的組織標(biāo)本(西安艾麗娜生物公司、附TNM和臨床分期)。

    MTA1和 SOX2染色強(qiáng)度評(píng)分:0(陰性)、1(弱陽(yáng)性)、2(中陽(yáng)性)、3(強(qiáng)陽(yáng)性);MTA1 和 SOX2 染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分:0(0%~10%)、1(>10%~25%)、2(>25%~50%)、3(>50%~75%)、4(>75%~100%)。染色評(píng)分為染色強(qiáng)度評(píng)分和染色陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積[8]。>8分為強(qiáng)表達(dá),≤8分為弱表達(dá)。

    1.2 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件人SCLC細(xì)胞系NCI?H446,人 NSCLC 細(xì)胞系 NCI?A549 和 NCI?H1650,均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%小牛血清、盤尼西林(100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)的 RPMI 1640。細(xì)胞孵育在含有5%CO2,37℃的濕潤(rùn)培養(yǎng)箱中。

    1.3 MTA1小干擾RNA轉(zhuǎn)染MTA1小干擾RNA(MTA1?siRNA)和陰性對(duì)照 siRNA(NC?siRNA,上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)按照試劑操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,其中空白對(duì)照組(mock)為僅加入Lipofectamine2000(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑。

    1.4 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 使用Trizol試劑按照試劑操作說(shuō)明提取細(xì)胞RNA。MTA1擴(kuò)增的有義引物5′?CAGCTACGAGCAGCACAACG?3′和 反 義 引 物 5′?TGTCCGTGGTTTGCCAGA?3′。 內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的有義引物 5′?GGTGGTCTCCTCTGACT?TCAACA?3′和 反 義 引物 5′?GTTGCTGTAGCCAAAT?TCGTTGT?3′。 PCR 條件:預(yù)變性 94℃ 60 s,40 個(gè)循環(huán),94℃ 60 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s。

    1.5 免疫印跡分析(western blot) 組織及細(xì)胞蛋白提取、濃度測(cè)定、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別與抗MTA1多克隆抗體(1 ∶1000,Abcam),抗?β?actin 單克隆抗體(1 ∶10000,Abcam),抗 E?cadherin 多克隆抗體(1 ∶1000,Abcam),抗?PARP 多克隆抗體(1 ∶1000,Cell Signaling),抗?puma 多克隆抗體(1 ∶1000,Cell Signaling),抗?CyclinD1 多克隆抗體(1 ∶500,BIO?WORLD),抗?CyclinE1 多克隆抗體(1 ∶500,BIO?WORLD),抗?SOX2 多克隆抗體(1 ∶1000,Abcam),抗?OCT4多克隆抗體(1∶1000,Abcam)進(jìn)行封閉雜交,然后分別和對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫雜交孵育,最后通過(guò) LAS?4000自動(dòng)曝光系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。

    1.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將3×103細(xì)胞/孔接種于含有完全培養(yǎng)基中的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,待細(xì)胞貼壁后,將培養(yǎng)基更換為100 μL的不含血清培養(yǎng)基及10 μL的MTS試劑混合液,37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h,最后利用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)板各孔在λ=490 nm處的吸光度。

    1.7 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)使用完全培養(yǎng)基將收獲轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞懸浮成1×103個(gè)細(xì)胞/mL,然后在6孔板中分別加入0.5 mL的懸浮液及2.5 mL完全細(xì)胞培養(yǎng)基,搖勻后靜置于培養(yǎng)箱中10 d,然后用含0.2%結(jié)晶紫染料固定染色10 min,在凝膠成像系統(tǒng)下拍照分析。

    1.8 免疫組化組織固定、包埋、切片后經(jīng)烤片、石蠟脫水、抗原修復(fù)、沖洗、封閉。加入抗MTA1多克隆抗體(1 ∶100,Abcam)、抗 SOX2多克隆抗體(1 ∶100,Abcam)4℃避光孵育過(guò)夜,洗滌后取PV?9000 Immu?no?Bridge免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物公司)按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。進(jìn)行DAB顯色。顯色充分后終止反應(yīng)。復(fù)染、反藍(lán)、脫水、中性樹(shù)脂封片。

    1.9 轉(zhuǎn)基因小鼠MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供,實(shí)驗(yàn)室使用許可證[SYSKS(京)2008?0025]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員批準(zhǔn)(ILAS?002),MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠具體制備步驟見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用均值和T檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 SCLC組織和細(xì)胞中MTA1呈高表達(dá)狀態(tài)在SCLC細(xì)胞NCI?H466中,通過(guò) PCR及 western blot檢測(cè)到MTA1高表達(dá),且較NSCLC細(xì)胞系NCI?A549及NCI?H1650表達(dá)水平顯著增高(圖1A)。利用包括40例SCLC組織和10例正常肺組織的組織芯片(圖1B),進(jìn)行免疫組化染色,顯示SCLC中的MTA1表達(dá)評(píng)分較正常肺組織顯著增高(P=0.003,圖 1C)。同時(shí),SCLC 組織 MTA1表達(dá)在性別(P=0.399)、年齡(P=0.999)、腫瘤分期(T 分期:P =0.478、N 分期:P=0.814、M 分期:P = 0.119)各亞組中無(wú)顯著差異(表 1)。

    圖1 SCLC組織芯片及細(xì)胞系中MTA1呈高表達(dá)狀態(tài)

    表1 MTA1蛋白表達(dá)與SCLC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

    2.2 下調(diào)MTA1表達(dá)后,SCLC細(xì)胞增殖能力明顯下降對(duì)比 NC?siRNA組,MTA1?siRNA組的 SCLC細(xì)胞中MTA1表達(dá)水平明顯下調(diào)(圖2A、B),同時(shí),SCLC細(xì)胞增殖能力(P=0.022)和細(xì)胞克隆形成能力(P=0.038)顯著降低(圖 2C、D)。

    圖2 下調(diào)MTA1表達(dá)后,SCLC細(xì)胞增殖能力明顯下降

    2.3 MTA1表達(dá)下調(diào)后,SCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)能力顯著下降對(duì)比 NC?siRNA 組,MTA1?siRNA 組SCLC細(xì)胞中E?cadherin蛋白表達(dá)量明顯增高。凋亡相關(guān)蛋白PUMA表達(dá)亦明顯增加,各組中周期相關(guān)蛋白cyclin E1和 cyclin D1無(wú)明顯變化(圖3)。

    圖3 MTA1表達(dá)下調(diào)后,SCLC細(xì)胞惡性生物學(xué)能力顯著下降

    2.4 MTA1通過(guò)調(diào)控干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2參與SCLC的惡性生物學(xué)進(jìn)程通過(guò)檢索TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)肺癌中與MTA1表達(dá)呈正相關(guān)的基因約有12 000個(gè),SOX2相關(guān)系數(shù)為0.25(圖4A)。免疫組化結(jié)果對(duì)比正常肺組織,SCLC組織芯片中SOX2染色得分明顯增高(P=0.015,圖 4B)。 對(duì)比 NC?siRNA 組,MTA1?siRNA組SCLC細(xì)胞中SOX2蛋白表達(dá)量明顯降低,Oct4表達(dá)無(wú)明顯差異(圖4C)。MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織MTA1和SOX2蛋白表達(dá)量均較野生型小鼠肺組織明顯增高(圖4D、E)。免疫組化結(jié)果提示MTA1同SOX2具有緊密的正相關(guān)性(r=0.781,圖4F、G)。

    3 討論

    Sasaki在 2002年首次在 74例 SCLC中發(fā)現(xiàn)MTA1普遍高表達(dá)。因此,推斷MTA1與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)[10]。 之后,多項(xiàng)研究[11-14]證實(shí)MTA1在NSCLC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中具有促進(jìn)作用。MTA1作為染色質(zhì)重塑及核小體去乙酰化復(fù)合體組成部分通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子依賴的方式調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[15],促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[16],增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[17],涉及DNA的損傷修復(fù)[18],并且正常組織中處于普遍低表達(dá)水平[19]。MTA1在腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移方面具有重要價(jià)值,為評(píng)估腫瘤惡性程度、個(gè)體化治療及預(yù)后判斷指明了方向。

    為了探索SCLC中MTA1的表達(dá)及功能,實(shí)驗(yàn)證實(shí)MTA1在肺癌細(xì)胞系中高表達(dá),并且在SCLC細(xì)胞系NCI?H446中顯著高表達(dá)。通過(guò)siRNA下調(diào)SCLC中MTA1表達(dá),SCLC的增殖及克隆能力顯著下降,揭示MTA1參與調(diào)控SCLC的生長(zhǎng)和增殖。MTA1作為轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子?β1的下游效應(yīng)器介導(dǎo) E?cadherin表達(dá)參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程,并發(fā)揮重要作用[20]。惡性腫瘤中E?cadherin蛋白表達(dá)缺失表現(xiàn)為腫瘤生長(zhǎng)迅速、早期轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良等[21]。下調(diào)MTA1表達(dá)后E?cadherin表達(dá)顯著上調(diào),表明MTA1通過(guò)調(diào)控E?cadherin參與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。在DNA損傷修復(fù)方面,MTA1通過(guò)最為常見(jiàn)的PARP依賴途徑參與DNA損傷修復(fù)[20]。本研究通過(guò)下調(diào)MTA1后PARP出現(xiàn)了顯著的凋亡帶,Puma呈高表達(dá),提示SCLC中MTA1通過(guò)PARP依賴方式參與DNA損傷修復(fù)。惡性腫瘤中MTA1過(guò)表達(dá)可激活cyclin D1通路[23],cy?clin D1及cyclin E1表達(dá)無(wú)明顯變化,原因可能是SCLC中MTA1調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的作用機(jī)制不同。推斷MTA1在不影響SCLC細(xì)胞周期的方式下參與整個(gè)腫瘤進(jìn)程。

    圖4 MTA1通過(guò)參與腫瘤干細(xì)胞調(diào)控促進(jìn)腫瘤惡性生物學(xué)行為

    腫瘤發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過(guò)程中均涉及腫瘤干細(xì)胞[24]。SOX2作為HMG DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員對(duì)胚胎干細(xì)胞全能性的發(fā)育起著重要作用,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[25]。SOX2在人類食管癌、NSCLC、SCLC 中呈現(xiàn)普遍高表達(dá)[26-28]。 研究[29]發(fā)現(xiàn)SOX2參與腫瘤干細(xì)胞進(jìn)程,并促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),下調(diào)SOX2表達(dá)后細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。既往研究[30]表明過(guò)表達(dá)MTA1和SOX2后腫瘤表現(xiàn)為高侵襲性及高轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)方式。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)總體肺癌中MTA1與SOX2呈中等相關(guān)性。至今,在SCLC中仍沒(méi)有關(guān)于MTA1與SOX2之間相互關(guān)系的可用數(shù)據(jù)。 研究[3,31-32]提示 MTA1 通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)通路激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial?mes?enchymal transition,EMT),同樣有研究證實(shí)SOX2也參與了EMT過(guò)程。EMT在腫瘤干細(xì)胞特征維持方面處于基礎(chǔ)地位,并在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[33]。SCLC組織芯片結(jié)果提示腫瘤組織較正常組織MTA1顯著增高,但在性別、年齡、腫瘤TNM分期等亞組中MTA1表達(dá)無(wú)明顯差異,提示SCLC中MTA1普遍高表達(dá),亦不排除病例數(shù)少造成的統(tǒng)計(jì)誤差。SCLC組織芯片結(jié)果提示MTA1與SOX2表達(dá)呈正相關(guān),表明MTA1可能通過(guò)調(diào)控SOX2涉及到腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控過(guò)程中。對(duì)比野生型小鼠,MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中SOX2顯著高表達(dá),更進(jìn)一步證實(shí)了MTA1與SOX2的正相關(guān)性。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中由于包含了大量NSCLC患者進(jìn)而造成二者相關(guān)性減小,而本研究數(shù)據(jù)彌補(bǔ)了TCGA中關(guān)于SCLC部分的空白。至此,在SCLC中提示MTA1可能通過(guò)EMT方式調(diào)控SOX2。

    本研究表明在SCLC中MTA1作為關(guān)鍵調(diào)控因子通過(guò)調(diào)控SOX2參與腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程,并且在腫瘤的增殖、凋亡方面具有顯著影響。在SCLC惡性進(jìn)程中發(fā)揮著重要生物學(xué)作用,這將有可能為SCLC的治療帶來(lái)新的希望。

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