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    MTA1基因同小細胞肺癌生物學(xué)行為的相關(guān)性研究

    2018-11-07 01:12:06薛洪省李建新錢海利趙志龍
    關(guān)鍵詞:肺癌小鼠

    薛洪省,韓 麗,李建新,錢海利,趙志龍

    (1大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院,遼寧大連116600;2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院,分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室,北京100021)

    0 引言

    肺癌作為人類癌癥致死的首要原因,其中小細胞肺癌(small cell lung cance,SCLC)約占肺癌總數(shù)的13%[1],對于老年抽煙患者是一種死亡率較高的疾病。其腫瘤細胞生長迅速、早期轉(zhuǎn)移以及早期對化療藥物出現(xiàn)耐藥等問題均可以影響臨床治療效果。近40年間,無論外科手術(shù)還是化學(xué)藥物在預(yù)后方面均未取得滿意效果[2]。通過對SCLC分子生物學(xué)的研究,其惡性生物學(xué)行為逐步被揭示,新的化學(xué)藥物以及靶向藥物已經(jīng)成為研究熱點。

    肺癌形成是由于在基因轉(zhuǎn)錄過程中堿基異常錯配所引起的長期累積結(jié)果。在多種惡性性腫瘤中均普遍高表達腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1(metastasis associated protein 1, MTA1)[3-4]。 MTA 家族包括 6 個不同亞型,分 別 為: MTA1、 MTA1s、 MTA1?ZG29p、 MTA2、MTA3及 MTA3L[5]。MTA1作為染色質(zhì)核重塑和核小體去乙酰化物復(fù)合體(NuRD復(fù)合體)成員之一,主要通過調(diào)控靶基因染色質(zhì)重構(gòu)影響基因轉(zhuǎn)錄[6]。研究[7]提示,人類多種惡性腫瘤如乳腺癌、口腔鱗癌、食管鱗癌、結(jié)腸癌、非小細胞肺癌(non?small cell lung cance,NSCLC)均與MTA1過表達密切相關(guān)。然而,SCLC中有關(guān)MTA1研究尚少,主要發(fā)病機制尚未明確。為了研究SCLC中MTA1的表達及功能機制,我們通過人SCLC及正常肺組織芯片、肺癌細胞株及MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠探索MTA1在體內(nèi)外的表達、功能及作用機制。

    1 材料和方法

    1.1 SCLC及正常肺組織石蠟包埋組合芯片芯片中包含SCLC組織40例,正常肺組織10例,每張芯片中包含2點相同的組織標(biāo)本(西安艾麗娜生物公司、附TNM和臨床分期)。

    MTA1和 SOX2染色強度評分:0(陰性)、1(弱陽性)、2(中陽性)、3(強陽性);MTA1 和 SOX2 染色陽性細胞百分比評分:0(0%~10%)、1(>10%~25%)、2(>25%~50%)、3(>50%~75%)、4(>75%~100%)。染色評分為染色強度評分和染色陽性細胞百分比評分的乘積[8]。>8分為強表達,≤8分為弱表達。

    1.2 細胞系及培養(yǎng)條件人SCLC細胞系NCI?H446,人 NSCLC 細胞系 NCI?A549 和 NCI?H1650,均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室保存并提供。細胞培養(yǎng)基為含10%小牛血清、盤尼西林(100 U/mL)、鏈霉素(100 mg/mL)的 RPMI 1640。細胞孵育在含有5%CO2,37℃的濕潤培養(yǎng)箱中。

    1.3 MTA1小干擾RNA轉(zhuǎn)染MTA1小干擾RNA(MTA1?siRNA)和陰性對照 siRNA(NC?siRNA,上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)按照試劑操作說明書進行,其中空白對照組(mock)為僅加入Lipofectamine2000(Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑。

    1.4 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 使用Trizol試劑按照試劑操作說明提取細胞RNA。MTA1擴增的有義引物5′?CAGCTACGAGCAGCACAACG?3′和 反 義 引 物 5′?TGTCCGTGGTTTGCCAGA?3′。 內(nèi)參磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的有義引物 5′?GGTGGTCTCCTCTGACT?TCAACA?3′和 反 義 引物 5′?GTTGCTGTAGCCAAAT?TCGTTGT?3′。 PCR 條件:預(yù)變性 94℃ 60 s,40 個循環(huán),94℃ 60 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s。

    1.5 免疫印跡分析(western blot) 組織及細胞蛋白提取、濃度測定、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別與抗MTA1多克隆抗體(1 ∶1000,Abcam),抗?β?actin 單克隆抗體(1 ∶10000,Abcam),抗 E?cadherin 多克隆抗體(1 ∶1000,Abcam),抗?PARP 多克隆抗體(1 ∶1000,Cell Signaling),抗?puma 多克隆抗體(1 ∶1000,Cell Signaling),抗?CyclinD1 多克隆抗體(1 ∶500,BIO?WORLD),抗?CyclinE1 多克隆抗體(1 ∶500,BIO?WORLD),抗?SOX2 多克隆抗體(1 ∶1000,Abcam),抗?OCT4多克隆抗體(1∶1000,Abcam)進行封閉雜交,然后分別和對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫雜交孵育,最后通過 LAS?4000自動曝光系統(tǒng)進行結(jié)果檢測。

    1.6 細胞增殖實驗將3×103細胞/孔接種于含有完全培養(yǎng)基中的96孔細胞培養(yǎng)板中,待細胞貼壁后,將培養(yǎng)基更換為100 μL的不含血清培養(yǎng)基及10 μL的MTS試劑混合液,37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h,最后利用酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)板各孔在λ=490 nm處的吸光度。

    1.7 細胞克隆實驗使用完全培養(yǎng)基將收獲轉(zhuǎn)染48 h后的細胞懸浮成1×103個細胞/mL,然后在6孔板中分別加入0.5 mL的懸浮液及2.5 mL完全細胞培養(yǎng)基,搖勻后靜置于培養(yǎng)箱中10 d,然后用含0.2%結(jié)晶紫染料固定染色10 min,在凝膠成像系統(tǒng)下拍照分析。

    1.8 免疫組化組織固定、包埋、切片后經(jīng)烤片、石蠟脫水、抗原修復(fù)、沖洗、封閉。加入抗MTA1多克隆抗體(1 ∶100,Abcam)、抗 SOX2多克隆抗體(1 ∶100,Abcam)4℃避光孵育過夜,洗滌后取PV?9000 Immu?no?Bridge免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物公司)按照操作說明書進行。進行DAB顯色。顯色充分后終止反應(yīng)。復(fù)染、反藍、脫水、中性樹脂封片。

    1.9 轉(zhuǎn)基因小鼠MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室保存并提供,實驗室使用許可證[SYSKS(京)2008?0025]。 動物實驗得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員批準(zhǔn)(ILAS?002),MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠具體制備步驟見文獻[9]。

    1.10 統(tǒng)計學(xué)處理統(tǒng)計學(xué)分析采用均值和T檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 SCLC組織和細胞中MTA1呈高表達狀態(tài)在SCLC細胞NCI?H466中,通過 PCR及 western blot檢測到MTA1高表達,且較NSCLC細胞系NCI?A549及NCI?H1650表達水平顯著增高(圖1A)。利用包括40例SCLC組織和10例正常肺組織的組織芯片(圖1B),進行免疫組化染色,顯示SCLC中的MTA1表達評分較正常肺組織顯著增高(P=0.003,圖 1C)。同時,SCLC 組織 MTA1表達在性別(P=0.399)、年齡(P=0.999)、腫瘤分期(T 分期:P =0.478、N 分期:P=0.814、M 分期:P = 0.119)各亞組中無顯著差異(表 1)。

    圖1 SCLC組織芯片及細胞系中MTA1呈高表達狀態(tài)

    表1 MTA1蛋白表達與SCLC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

    2.2 下調(diào)MTA1表達后,SCLC細胞增殖能力明顯下降對比 NC?siRNA組,MTA1?siRNA組的 SCLC細胞中MTA1表達水平明顯下調(diào)(圖2A、B),同時,SCLC細胞增殖能力(P=0.022)和細胞克隆形成能力(P=0.038)顯著降低(圖 2C、D)。

    圖2 下調(diào)MTA1表達后,SCLC細胞增殖能力明顯下降

    2.3 MTA1表達下調(diào)后,SCLC細胞惡性生物學(xué)能力顯著下降對比 NC?siRNA 組,MTA1?siRNA 組SCLC細胞中E?cadherin蛋白表達量明顯增高。凋亡相關(guān)蛋白PUMA表達亦明顯增加,各組中周期相關(guān)蛋白cyclin E1和 cyclin D1無明顯變化(圖3)。

    圖3 MTA1表達下調(diào)后,SCLC細胞惡性生物學(xué)能力顯著下降

    2.4 MTA1通過調(diào)控干細胞轉(zhuǎn)錄因子2參與SCLC的惡性生物學(xué)進程通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)肺癌中與MTA1表達呈正相關(guān)的基因約有12 000個,SOX2相關(guān)系數(shù)為0.25(圖4A)。免疫組化結(jié)果對比正常肺組織,SCLC組織芯片中SOX2染色得分明顯增高(P=0.015,圖 4B)。 對比 NC?siRNA 組,MTA1?siRNA組SCLC細胞中SOX2蛋白表達量明顯降低,Oct4表達無明顯差異(圖4C)。MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織MTA1和SOX2蛋白表達量均較野生型小鼠肺組織明顯增高(圖4D、E)。免疫組化結(jié)果提示MTA1同SOX2具有緊密的正相關(guān)性(r=0.781,圖4F、G)。

    3 討論

    Sasaki在 2002年首次在 74例 SCLC中發(fā)現(xiàn)MTA1普遍高表達。因此,推斷MTA1與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[10]。 之后,多項研究[11-14]證實MTA1在NSCLC發(fā)生發(fā)展進程中具有促進作用。MTA1作為染色質(zhì)重塑及核小體去乙酰化復(fù)合體組成部分通過轉(zhuǎn)錄因子依賴的方式調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄表達[15],促進基因轉(zhuǎn)錄[16],增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[17],涉及DNA的損傷修復(fù)[18],并且正常組織中處于普遍低表達水平[19]。MTA1在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移方面具有重要價值,為評估腫瘤惡性程度、個體化治療及預(yù)后判斷指明了方向。

    為了探索SCLC中MTA1的表達及功能,實驗證實MTA1在肺癌細胞系中高表達,并且在SCLC細胞系NCI?H446中顯著高表達。通過siRNA下調(diào)SCLC中MTA1表達,SCLC的增殖及克隆能力顯著下降,揭示MTA1參與調(diào)控SCLC的生長和增殖。MTA1作為轉(zhuǎn)錄生長因子?β1的下游效應(yīng)器介導(dǎo) E?cadherin表達參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程,并發(fā)揮重要作用[20]。惡性腫瘤中E?cadherin蛋白表達缺失表現(xiàn)為腫瘤生長迅速、早期轉(zhuǎn)移、預(yù)后不良等[21]。下調(diào)MTA1表達后E?cadherin表達顯著上調(diào),表明MTA1通過調(diào)控E?cadherin參與腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。在DNA損傷修復(fù)方面,MTA1通過最為常見的PARP依賴途徑參與DNA損傷修復(fù)[20]。本研究通過下調(diào)MTA1后PARP出現(xiàn)了顯著的凋亡帶,Puma呈高表達,提示SCLC中MTA1通過PARP依賴方式參與DNA損傷修復(fù)。惡性腫瘤中MTA1過表達可激活cyclin D1通路[23],cy?clin D1及cyclin E1表達無明顯變化,原因可能是SCLC中MTA1調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白的作用機制不同。推斷MTA1在不影響SCLC細胞周期的方式下參與整個腫瘤進程。

    圖4 MTA1通過參與腫瘤干細胞調(diào)控促進腫瘤惡性生物學(xué)行為

    腫瘤發(fā)生、發(fā)展的整個過程中均涉及腫瘤干細胞[24]。SOX2作為HMG DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員對胚胎干細胞全能性的發(fā)育起著重要作用,并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[25]。SOX2在人類食管癌、NSCLC、SCLC 中呈現(xiàn)普遍高表達[26-28]。 研究[29]發(fā)現(xiàn)SOX2參與腫瘤干細胞進程,并促進了腫瘤細胞的生長,下調(diào)SOX2表達后細胞生長受到明顯抑制。既往研究[30]表明過表達MTA1和SOX2后腫瘤表現(xiàn)為高侵襲性及高轉(zhuǎn)移性生長方式。在TCGA數(shù)據(jù)庫中通過分析發(fā)現(xiàn)總體肺癌中MTA1與SOX2呈中等相關(guān)性。至今,在SCLC中仍沒有關(guān)于MTA1與SOX2之間相互關(guān)系的可用數(shù)據(jù)。 研究[3,31-32]提示 MTA1 通過復(fù)雜的信號通路激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial?mes?enchymal transition,EMT),同樣有研究證實SOX2也參與了EMT過程。EMT在腫瘤干細胞特征維持方面處于基礎(chǔ)地位,并在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[33]。SCLC組織芯片結(jié)果提示腫瘤組織較正常組織MTA1顯著增高,但在性別、年齡、腫瘤TNM分期等亞組中MTA1表達無明顯差異,提示SCLC中MTA1普遍高表達,亦不排除病例數(shù)少造成的統(tǒng)計誤差。SCLC組織芯片結(jié)果提示MTA1與SOX2表達呈正相關(guān),表明MTA1可能通過調(diào)控SOX2涉及到腫瘤干細胞的調(diào)控過程中。對比野生型小鼠,MTA1轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中SOX2顯著高表達,更進一步證實了MTA1與SOX2的正相關(guān)性。在TCGA數(shù)據(jù)庫中由于包含了大量NSCLC患者進而造成二者相關(guān)性減小,而本研究數(shù)據(jù)彌補了TCGA中關(guān)于SCLC部分的空白。至此,在SCLC中提示MTA1可能通過EMT方式調(diào)控SOX2。

    本研究表明在SCLC中MTA1作為關(guān)鍵調(diào)控因子通過調(diào)控SOX2參與腫瘤干細胞生物學(xué)進程,并且在腫瘤的增殖、凋亡方面具有顯著影響。在SCLC惡性進程中發(fā)揮著重要生物學(xué)作用,這將有可能為SCLC的治療帶來新的希望。

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