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    CpG?ODN通過調(diào)控細(xì)胞免疫顯著增強(qiáng)熱休克蛋白腫瘤疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫效應(yīng)

    2018-11-07 01:12:06張瑩瑩王曉文唐勁天
    關(guān)鍵詞:聯(lián)合疫苗抗原細(xì)胞因子

    張瑩瑩,王曉文,唐勁天

    (1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科,湖南 長沙410078;2清華大學(xué)工程物理系醫(yī)學(xué)物理與工程研究所,北京100084)

    0 引言

    隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,腫瘤治療的技術(shù)也在不斷的進(jìn)步。但是對于很多惡性腫瘤來說,常規(guī)治療效果欠佳,死亡率居高不下,仍是臨床治療中的難點(diǎn)。近年來,研究者們發(fā)現(xiàn),部分惡性黑素瘤患者出現(xiàn)腫瘤自發(fā)性的消退現(xiàn)象,于是逐漸關(guān)注黑色素瘤固有的致免疫性。隨著研究的不斷深入,人們將其認(rèn)為是惡性腫瘤中具有高免疫原性的一種。因此,免疫治療開始成為惡性黑色素瘤治療的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向,并期待取得突破性進(jìn)展[1]。

    已有研究[2-3]報道熱療可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性,且這種增強(qiáng)在很大程度上與熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)的過表達(dá)有關(guān)。大量的實(shí)驗(yàn)研究[4-5]已經(jīng)證實(shí)了經(jīng)熱誘導(dǎo)的癌細(xì)胞中的HSP70、HSP90等物質(zhì)能夠激發(fā)抗腫瘤免疫。然而,眾多熱休克蛋白相關(guān)腫瘤疫苗的動物或臨床研究[6-8]均顯示,雖然在實(shí)驗(yàn)對象體內(nèi)可以檢測到特異性免疫反應(yīng)并且腫瘤生長受到不同程度地抑制,但尚難達(dá)到滿意的療效。分析原因,發(fā)現(xiàn)有可能與MHC?I抗原的表達(dá)不強(qiáng)有關(guān)[9]。甚至有研究[3]表明熱休克處理雖然可以增加抗原肽形成,但同時抑制了抗原的呈遞。B16細(xì)胞經(jīng)熱誘導(dǎo)后,會形成免疫原性的抗原。例如檢測細(xì)胞中的HS,發(fā)現(xiàn)其P?抗原復(fù)合物的含量有所上升,但是MHC?I分子卻不能有效地將抗原傳遞給T細(xì)胞,從而造成免疫耐受或逃逸。因而,比較理想的腫瘤疫苗應(yīng)該能夠有效地激活T細(xì)胞,為其提供良好的第一和第二信號,將其特異性抗腫瘤免疫效應(yīng)充分發(fā)揮出來[8],同時也避免由于免疫強(qiáng)度不夠而發(fā)生逃逸,影響患者身體健康。

    要想抗原誘導(dǎo)機(jī)體更好地發(fā)生免疫反應(yīng),可適當(dāng)?shù)靥砑幼魟?,適當(dāng)?shù)淖魟┠軌驗(yàn)門細(xì)胞的活化提供第二信號。所以在疫苗的研究過程中,對佐劑的研究也是其中很重要的部分。目前使用比較多的佐劑大多是人工合成的,寡聚核苷酸鏈(oligodeoxynucleoti?des,ODN)中含有非甲基化 CpG 基序(CpG?ODN),也是一種近年新引起廣泛關(guān)注的水性佐劑。其自身無免疫原性,不會引起自身免疫疾病。更重要的是CpG?ODN作為Toll樣受體9的配體,能夠提高蛋白抗原和DNA疫苗的免疫原性,直接激活 NK細(xì)胞[10]、樹突狀細(xì)胞[11]、巨噬細(xì)胞[12]等,并刺激這些細(xì)胞分泌 IFN?γ、IL?2、TNF?α 等 Th1 樣細(xì)胞因子,從而誘導(dǎo) Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答[13-14]。 此外,它還能夠在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞抗原呈遞,促進(jìn)其細(xì)胞表面分子MHC?II、B7?1、B7?2 等的表達(dá),活化樹突狀細(xì)胞,促進(jìn)抗原呈遞,協(xié)同激活 T 細(xì)胞[15-16]。 因此,可將 CpG?ODN作為多種抗原的免疫佐劑,以增強(qiáng)免疫作用[13,15,17-19],在抗腫瘤免疫治療領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。

    綜上所述,富含熱休克蛋白的腫瘤細(xì)胞瘤苗和CpG?ODN在抗腫瘤免疫功能上具有互補(bǔ)性,CpG?ODN有望克服單純腫瘤細(xì)胞疫苗抗原呈遞活性的不足,起到協(xié)同增效的作用。本研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)P褪切∈髳盒院谏亓?,腫瘤疫苗選擇經(jīng)過熱誘導(dǎo)且富含HSP70的B16細(xì)胞裂解的產(chǎn)物,聯(lián)合新型免疫佐劑CpG?ODN免疫小鼠,觀察疫苗對小鼠產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用,并研究小鼠免疫系統(tǒng)的功能改變。

    1 材料和方法

    1.1 主要試劑羊抗鼠HSP70多克隆抗體,購自美國Cellsigna公司;抗羊二抗液,被辣根過氧化物酶標(biāo)記,購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,大鼠抗小鼠CD4 R?PE和CD8a TRI?COLOR熒光抗體、大鼠抗小鼠CD25?FITC熒光抗體均購自美國Invitrogen公司;脾淋巴細(xì)胞分離液,購自達(dá)科為生物有限公司;小鼠 IL?2、 IFN?γELISA 試劑盒,購自美國 Bioscience公司;LDH釋放法檢測試劑盒購自美國Promega公司(Madison, WI)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)小鼠,健康清潔級C57BL/6,雄性,體質(zhì)量18~22 g,6~7周,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。小鼠飼養(yǎng)時溫度為(23±2)℃,相對濕度(55%±2%),普食飼養(yǎng)。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫。B16細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基,接種之后放于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)約24 h即可進(jìn)行傳代,觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的數(shù)量呈對數(shù)期增長時即可提取用于實(shí)驗(yàn)。

    1.4 制備熱處理后細(xì)胞裂解瘤苗將經(jīng)45℃15 min熱處理后的B16細(xì)胞(我們前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),相較42℃ 60 min和50℃ 5 min,45℃ 15 min熱處理能誘導(dǎo)最高程度的HSP70蛋白表達(dá),該western blot結(jié)果在補(bǔ)充材料中提供),立即更換培養(yǎng)基后放回37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱復(fù)溫孵育24 h后取出,收集全部細(xì)胞,用PBS將細(xì)胞洗滌兩次,然后將其濃度調(diào)整至5×108個/mL。即可將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至冷凍管中進(jìn)行保存,然后再交替置于液氮內(nèi)10 min,37℃水浴中5 min,多次操作之后待細(xì)胞完全溶解后,即可放于-80℃的環(huán)境中進(jìn)行冷凍保存,以備后用。

    1.5 CpG?ODN2395佐劑配制CpG?ODN2395 的序列為 5′?TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG?3′,購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。根據(jù)說明書,使用PBS溶解核酸,將濃度調(diào)制為0.1 mL/OD,注意即配即用。

    1.6 實(shí)驗(yàn)分組以及小鼠腫瘤疫苗接種及攻擊實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為下述四組。①對照組:接種PBS;②瘤苗組(heated cell lysates,HCL組):將45℃熱處理腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物(每0.1 mL含2×107個細(xì)胞的裂解產(chǎn)物)+PBS等體積混合后接種;③佐劑組(CpG?ODN 組): CpG?ODN2395(濃度為 30 μg/0.1 mL) +PBS等體積混合后接種;④聯(lián)合組(HCL+CpG?ODN組):將 45℃熱處理腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物+CpG?ODN2395等體積混合后接種。

    健康小鼠的疫苗接種:分別于第 0、6、12、18及24 d向小鼠注射疫苗,需注意疫苗應(yīng)分四點(diǎn)進(jìn)行注射,注射位置為小鼠雙側(cè)腹股溝和腋窩皮下,每個位置的注射量為0.05 mL,每間隔5 d進(jìn)行一次注射,每只小鼠接種5次。

    B16細(xì)胞攻擊接種后小鼠:當(dāng)B16細(xì)胞呈對數(shù)生長之后,取細(xì)胞放于0.25%胰酶中進(jìn)行消化。重懸于PBS中。并將 B16的濃度調(diào)至 1×106個/mL,于第30天在小鼠為右肋腹部皮下位置進(jìn)行注射,每只小鼠注射 0.1 mL。

    觀察并記錄小鼠皮下腫瘤出現(xiàn)的時間、體積大小和小鼠生存天數(shù)。

    1.7 外周血T細(xì)胞亞群檢測免疫結(jié)束后的第六天(d30),隨機(jī)從每組中挑選3只小鼠,用摘眼球取血法采集小鼠血液,并置于抗凝管中。在抗凝管中取血100 μL,置于 1.5 mL 離心管,分別向離心管中加入3 L的,在溫室、避光的環(huán)境中孵育15~20 min。1000 rpm離心 5 min,棄上清。加入 2 mL PBS,1000 rpm離心5 min,將未結(jié)合抗體洗去。在溶液中加入稀釋了的流式紅細(xì)胞裂解液,在溫室、避光的環(huán)境中孵育15 min,觀察發(fā)現(xiàn)溶液呈透明狀后取出。以1000 rpm的速度離心溶液離心5 min,棄上清。向其中加入2 mL PBS,再以1000 rpm的速度離心溶液離心5 min,重復(fù)洗滌2次。加入4%多聚甲醛,固定待測。用流式細(xì)胞儀檢測外周血中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞以及CD25+T細(xì)胞的數(shù)量,計算各亞群比例。

    1.8 小鼠脾淋巴細(xì)胞分離和培養(yǎng)取血后將小鼠斷頸處死,無菌取脾,置于200目尼龍網(wǎng)中研磨脾組織,分散的細(xì)胞經(jīng)過尼龍網(wǎng)過濾即可進(jìn)入到脾淋巴細(xì)胞分離液中。收集懸液,以1500 rpm的速度離心溶液離心30 min(密度梯度法),得到脾臟單個核細(xì)胞。用PBS液將細(xì)胞漂洗兩次,于5 mL 10%FCS RPMI 1640培養(yǎng)液重懸(含 IL?2 100 U/L),以常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)液隔天更換。

    1.9 ELISA法檢測小鼠脾細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子IL?2、INF?γ水平將所獲各組小鼠脾淋巴細(xì)胞(單核細(xì)胞)作為效應(yīng)細(xì)胞,以絲裂霉素C滅活處理后B16細(xì)胞作為刺激細(xì)胞,按10∶1的比例共培養(yǎng)3 d,收集培養(yǎng)上清,ELISA法檢測其中Th1型細(xì)胞因子 IL?2、INF?γ 的水平。

    1.10 LDH釋放法檢測免疫后小鼠脾細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)對B16的特異性細(xì)胞毒作用將效應(yīng)細(xì)胞(分離的脾單核細(xì)胞)和靶細(xì)胞(滅活的B16細(xì)胞)以效靶比為20∶1混合培養(yǎng)于10%FCS RPMI 1640 培養(yǎng)液(含 IL?2 100U/L)中,4 h后用LDH釋放法檢測試劑盒檢測不同組LDH的釋放水平,CTL殺傷效率計算公式:殺傷率(%)=OD(實(shí)驗(yàn)組?效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)?靶細(xì)胞自發(fā))OD(靶細(xì)胞最大?靶細(xì)胞自發(fā))×100%。

    1.11 統(tǒng)計學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少兩次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 StatView (version 5.0) software(SAS Institute Inc.Cary,NC)統(tǒng)計軟件處理。計量數(shù)據(jù)以x ±s表示,組間均數(shù)比較采用ANOVA分析,統(tǒng)計學(xué)差異顯著性采用 log?rank檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 同源腫瘤細(xì)胞攻擊后小鼠出瘤情況、腫瘤生長曲線及生存期觀察的比較總觀察期為40 d,將小鼠體內(nèi)腫瘤體積繪制成動態(tài)圖(圖1):PBS對照組腫瘤生長迅速,平均出瘤時間為(5.3±1.8) d,并在 30 d內(nèi)全部死亡(小鼠的生存周期為 20.9±2.9 d)。 相比于PBS組,CpG?ODN組、HCL組以及聯(lián)合疫苗組(HCL+CpG?ODN)的小鼠腫瘤均受到不同程度的抑制,其中聯(lián)合疫苗組的腫瘤抑制水平最高(P<0.05)。小鼠接瘤之后,直至觀察結(jié)束,約有35%未出瘤。已出瘤小鼠的平均出瘤天數(shù)為(11.7±5.0)d,超過 73%的小鼠在觀察結(jié)束之后仍然存活,存活時間明顯長于其他組(P<0.01)。 CpG?ODN 組未出瘤小鼠僅為一只,出瘤小鼠的出瘤時間為(8.6±3.2)d,小鼠 40 d 的存活率為52%(14/27)。HCL組和PBS組的出瘤時間基本相同,為(5.6±1.7) d,但是在腫瘤生長抑制作用上,兩組的差別比較明顯,HCL組46%(12/26)的小鼠生存期超過了40 d,較對照組延長。CpG?ODN組相較于HCL組來說,無論是平均出瘤時間,還是生存期都有所延長。

    圖1 小鼠腫瘤體積生長曲線圖

    2.2免疫后小鼠外周血T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+的比值升高,但CD4+CD25+T細(xì)胞比例無差異研究顯示機(jī)體的免疫功能狀態(tài)在很大程度上與T細(xì)胞亞群的比例有關(guān),以流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞外周血進(jìn)行檢測,CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞比值低提示免疫功能低下,而 HCL 組、CpG?ODN 組與 HCL+CpG?ODN 組小鼠的外周血CD4+/CD8+的值均較PBS組升高(P<0.001)。 其中聯(lián)合疫苗組 CD4+/CD8+的值最高,與其它治療組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。HCL 組和 CpG?ODN 組的 CD4+/CD8+值比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.048,圖 2)。

    圖2 外周血T細(xì)胞亞群分布比例

    2.3 聯(lián)合免疫小鼠脾細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子的活性顯著增加治療組IFN?γ和IL?2的水平與對照組相比,均有不同程度的提升(P<0.05)。 其中 HCL+CpG?ODN組的小鼠可誘導(dǎo)出最高水平的IFN?γ和IL?2,分別為(1402.5±156.5) pg/mL 和(532.9±41.8) pg/mL;CpG?ODN 組也可誘導(dǎo)出較高的 IFN?γ 和 IL?2,分別為(1021.8±136.9) pg/mL 和(395.3±20.1) pg/mL;HCL免疫組誘導(dǎo)出的IFN?γ和IL?2則相對較低,分別為(654.7±59.5) pg/mL 和(289.2±15.5) pg/mL,組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖 3)。

    圖3 各組Th1細(xì)胞因子分泌水平比較

    2.4 聯(lián)合免疫后小鼠脾CTL的細(xì)胞毒效率明顯增加對CTL細(xì)胞進(jìn)行毒效率檢測,相比于PBS組,單獨(dú)HCL起不到增強(qiáng)CTL特異性細(xì)胞毒效率的作用(P>0.05)。 CpG?ODN 組和 HCL+CpG?ODN 組均能明顯增強(qiáng)小鼠 CTL的細(xì)胞毒殺傷效率(P<0.05),HCL+CpG?ODN 組與 CpG?ODN 組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),對細(xì)胞毒殺傷效率的增強(qiáng)作用最顯著(表 1)。

    表1 各組脾CTL對B16的特異性細(xì)胞毒殺傷效率比較

    3 討論

    熱休克蛋白相關(guān)腫瘤疫苗及免疫活性物質(zhì)CpG?ODN,在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)上,能夠在一定程度上起到互補(bǔ)的作用。本實(shí)驗(yàn)主要研究了小鼠的惡性黑色素瘤腫瘤細(xì)胞疫苗的療效,并觀察了不同疫苗配方對小鼠的抗腫瘤免疫效力的增強(qiáng)作用,通過檢測,聯(lián)合疫苗的效果最佳。聯(lián)合疫苗能使超過35%的小鼠抵抗住了B16細(xì)胞的攻擊。即使長出腫瘤的小鼠,其平均出瘤時間、生存期與其它各組相比亦有顯著性延長。本研究結(jié)果與Ito等[18]研究具有一致性,進(jìn)行HCL瘤苗治療,小鼠未能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫保護(hù),HCL組的出瘤時間與PBS對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但是在腫瘤的生長和小鼠的生存期上有一定的差異,說明HCL瘤苗有一定的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫作用,這可能與熱處理后腫瘤細(xì)胞內(nèi)形成的大量HSP?抗原肽復(fù)合物具有一定抗腫瘤免疫活性且不依賴于MHC的表達(dá)有關(guān)[20-21]。 另外,值得一提的是 CpG?ODN 與HCL聯(lián)合應(yīng)用后部分小鼠出現(xiàn)了因局部變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的皮膚潰瘍(該結(jié)果未在本文中列出),此現(xiàn)象在國內(nèi)外尚未見類似報道,具體原因還有待進(jìn)一步研究。此局部劇烈變態(tài)反應(yīng)的出現(xiàn)除了證實(shí)聯(lián)合疫苗可誘導(dǎo)極強(qiáng)的免疫反應(yīng)外,也提醒我們需改良接種方式以減輕治療的局部不良反應(yīng)。

    為對抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行更進(jìn)一步的研究,本實(shí)驗(yàn)還對小鼠細(xì)胞免疫狀態(tài)進(jìn)行了檢測。在小鼠體內(nèi),CD4+T細(xì)胞是細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞,通過分泌 IL?2、INF?γ 等細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng);CD8+T細(xì)胞能夠分泌物質(zhì),抑制T細(xì)胞因子的免疫作用,對于小鼠機(jī)體而言,CD4+/CD8+細(xì)胞比值決定著免疫是否平衡,從側(cè)面反映出機(jī)體免疫功能狀態(tài),當(dāng)CD4+/CD8+細(xì)胞比值下降,說明小鼠機(jī)體的免疫功能下降,而當(dāng)免疫功能有所恢復(fù),小鼠的CD4+/CD8+細(xì)胞比值會有所上升。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)機(jī)體進(jìn)行免疫治療之后,CD4+/CD8+細(xì)胞比值均有明顯的上調(diào),其中聯(lián)合疫苗組的上調(diào)最為明顯。后續(xù)IL?2、INF?γ細(xì)胞因子以及CTL細(xì)胞毒殺傷效率的檢測結(jié)果亦印證了該結(jié)果。

    CD4+CD25+T細(xì)胞在免疫應(yīng)答過程中起著負(fù)調(diào)節(jié)的作用,所以也將其稱為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regular cell, Treg)。 有研究報道減少或清除 CD4+CD25+T細(xì)胞可以增強(qiáng)細(xì)胞疫苗的療效[22],而CpG?ODN可通過TLR9損傷Treg細(xì)胞使其數(shù)目減少[23]。因此,本實(shí)驗(yàn)預(yù)期聯(lián)合免疫組小鼠CD4+CD25+T細(xì)胞比例會低于對照組,但結(jié)果卻顯示各實(shí)驗(yàn)組無明顯差異。迄今為止,Treg細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確,Treg細(xì)胞可與細(xì)胞因子、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及不同腫瘤和免疫微環(huán)境等多種因素相互影響、相互調(diào)控有關(guān)[24],本研究中各組小鼠Treg細(xì)胞亞群數(shù)量無明顯差異,亦反過來證實(shí)了Treg細(xì)胞調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。下一步我們擬檢測Treg的功能狀態(tài),探索其與CpG?ODN相互作用的可能信號通路,以期進(jìn)一步揭示CpG?ODN強(qiáng)化抗腫瘤免疫應(yīng)答的可能分子機(jī)制。

    綜上所述,新型免疫佐劑CpG?ODN可顯著增強(qiáng)熱休克蛋白腫瘤疫苗的抗腫瘤免疫效應(yīng)。HCL攜帶多種腫瘤特異或者相關(guān)抗原的HSP?抗原肽復(fù)合物,在免疫佐劑CpG?ODN的協(xié)同作用下,免疫細(xì)胞因子分泌將會更強(qiáng),改善T細(xì)胞亞群的比例,活化腫瘤免疫微環(huán)境,進(jìn)而增強(qiáng)單核細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒作用,從而抑制腫瘤生長。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為未來腫瘤疫苗的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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