氫氧化鈉-鹽酸改性處理后的余甘果粉末對EGCG的吸附作用研究

杜之正 黃旭建 孫 云 吳亮宇

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

1 引言

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶葉中含量最高的兒茶素類單體，具有抗癌[1]、消炎[2]、抗氧化[3]、抗輻射[4]和預(yù)防心血管疾病[5]等保健功效，因此EGCG在功能性食品開發(fā)方面具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。目前研究表明，EGCG的穩(wěn)定性和生物利用率會(huì)受環(huán)境pH值、溫度和各種酶類的影響。當(dāng)pH>6的時(shí)候，水溶液中的EGCG會(huì)迅速降解[6, 7]；而當(dāng)環(huán)境溫度超過40℃時(shí)，EGCG會(huì)快速差向異構(gòu)化[8]；而生物體內(nèi)的各種酶類，尤其是小腸等消化器官中的消化酶，也可降解EGCG[9]。已有研究顯示，在EGCG中加入乳蛋白、維生素C、米糠蛋白，以及通過納米包埋等，均可提高EGCG的穩(wěn)定性[10-13]。

余甘，是廣泛種植于中國熱帶和亞熱帶地區(qū)的一種植物，其果實(shí)是傳統(tǒng)中藥重要的配伍成分，具有抗氧化[14]、消炎殺菌[15]、提高免疫力[16]，保護(hù)心血管[17]等功能。近年來，對余甘果的研究較多地集中在其醫(yī)藥和營養(yǎng)價(jià)值開發(fā)方面[18, 19]。而作為一種藥食同源的材料，余甘果集生物相容性、功能性和來源廣泛等特點(diǎn)于一身[20]，可以用作功能性食品開發(fā)的載體成分。目前，以余甘果為載體的EGCG復(fù)合物的開發(fā)和利用還未見報(bào)道。前期研究顯示，以酸、堿、有機(jī)溶液對生物質(zhì)材料進(jìn)行改性和洗滌，可以脫除大量可溶性物質(zhì)(小分子的多糖、蛋白、次生代謝物等)，增加生物質(zhì)材料的表面吸附位點(diǎn)，從而提高其對其它生物活性物質(zhì)的吸附能力[21-24]。本研究以氫氧化鈉-鹽酸改性處理后的余甘果為吸附劑，對水溶液中的EGCG進(jìn)行吸附處理，通過吸附動(dòng)力學(xué)和等溫吸附研究，探索其作為EGCG載體的可行性，為今后EGCG生物利用率的提高打下基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 試劑

EGCG購自湖州四豐生物技術(shù)公司，純度≥95%。EGCG標(biāo)準(zhǔn)樣購于Sigma-Aldrich公司。其它化學(xué)試劑為分析純，購于國藥集團(tuán)。去離子水由盈科供水系統(tǒng)提供。

2.2 余甘果樣品

余甘果采購自福州當(dāng)?shù)厥袌?。將購置的余甘果洗凈，粉碎機(jī)(FW177型, 泰斯特儀器有限公司，天津)粉碎。在室溫下，將得到的粉碎樣品進(jìn)行酸堿改性處理：將粉碎后的余甘果置于布氏漏斗，加入0.1 M的氫氧化鈉，在Waterman 3號(hào)濾紙上進(jìn)行抽濾，直至濾液pH值穩(wěn)定；再加入去離子水洗滌，直至濾液達(dá)到中性；再用0.1 M的鹽酸進(jìn)行酸洗并抽濾，直至濾液pH值穩(wěn)定，再用去離子水進(jìn)行洗脫，濾液達(dá)到中性后，得到氫氧化鈉-鹽酸改性處理后的余甘果，貯藏于-20 ℃冰柜，待用。

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)研究

將改性后的余甘果粉末用去離子水清洗，布氏漏斗過濾(Whatman3號(hào)濾紙)，待用，其含水率用MA-30型含水率測定儀(Sartorius，德國)測定。取濕重為2.0 g的改性余甘果粉末置于錐形瓶中，然后加入200 mL的EGCG溶液(初始濃度為200 mg/L)，將瓶口密封后置于25 ℃水浴搖床(100 rpm)進(jìn)行吸附，在吸附過程進(jìn)行的第5，10,15,30,60,120,240，480和1440 min取上清液樣品1 mL，將上清液在4 ℃，10000 rpm的離心機(jī)中離心10 min，樣品中的EGCG濃度用HPLC分析。用公式(1)計(jì)算，在吸附反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間t (min)時(shí)，EGCG被處理后的余甘果吸附的量qt(mg/g)：

(1)

公式中，C0和Ct(mg/L)是EGCG溶液初始濃度和吸附反應(yīng)進(jìn)行了t時(shí)間后的濃度。V(L)為吸附體系體積。W (g)是所用余甘果的干重。為了研究吸附動(dòng)力學(xué)特性，將實(shí)驗(yàn)得到數(shù)據(jù)分別代入擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)(2)和擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)(3)方程：

ln(qe-qt)=lnqe-k1t

(2)

(3)

公式中，qt和qe(mg/g) 分別是吸附體系中時(shí)間t時(shí)和吸附平衡時(shí)余甘果的吸附率； k1(min-1) 和 k2(g mg-1min-1) 分別是擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)和擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程反應(yīng)速率常數(shù)。

2.4 等溫吸附實(shí)驗(yàn)

將改性后的余甘果粉末用去離子水清洗，布氏漏斗過濾(Whatman 3號(hào)濾紙)，待用。其含水率用MA-30型含水率測定儀測定。取濕重為2.0 g的改性余甘果粉末置于錐形瓶中，加入200 mL的EGCG水溶液(EGCG初始濃度分別為50，100，200，400和800 mg/L)，再將錐形瓶放置于轉(zhuǎn)速為100 rpm的水浴搖床，溫度分別為25，40和55 ℃，吸附反應(yīng)時(shí)間為1440 min。達(dá)到平衡后取上清液1 mL，4 ℃，10000 rpm離心10 min，樣品中的EGCG濃度由HPLC檢測得出。平衡時(shí)單位余甘果吸附EGCG的量qe(mg/g)，同樣可以由公式(4)算得：

(4)

C0和 Ce(mg/L)分別是初始和吸附平衡時(shí)EGCG的濃度；V(L)是吸附體系體積；W(g)是所用余甘果干重。

2.5 等溫吸附模型

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Langmuir和Freundlich吸附模型進(jìn)行分析。Langmuir公式如下：

(5)

Ce(mg/L)是吸附體系達(dá)到平衡時(shí)溶液中游離態(tài)EGCG的濃度，qe(mg/g)為吸附體系達(dá)到平衡時(shí)單位重量余甘果吸附的EGCG的量。Qm(mg/g)是理論最大吸附值，KL(L/mol)是Langmuir平衡常數(shù)。Freundlich公式如下：

(6)

Freundlich常數(shù)1/n是與吸附體系均一性相關(guān)的常數(shù)，KF(mg/g (mL/mg)1/n)是吸附劑的吸附效率。

2.6 吸附熱力學(xué)研究

熱力學(xué)常數(shù)標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變(ΔGo)、焓變(ΔHo)、熵變(ΔSo)可以指示反應(yīng)的自發(fā)性，可以通過公式(7)算得

ΔGo=-RTlnKa

(7)

Ka是熱力學(xué)平衡常數(shù)，T(K)為反應(yīng)進(jìn)行的溫度，R是氣體常數(shù)，為8.314 J/mol/K。根據(jù)前人研究[25]，在中性或弱電性吸附質(zhì)為主的吸附體系中，熱力學(xué)平衡常數(shù)Ka可以被Langmuir平衡常數(shù)(KL)替代，因此公式(7)可以變換為公式(8)：

ΔGo=-RTlnKL

(8)

根據(jù)Van’t Hoff方程(9)，可以算出標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)焓變(ΔHo)和熵變(ΔSo)：

(9)

2.7 HPLC分析

HPLC系統(tǒng)每個(gè)樣品進(jìn)樣體積為10 μL，采用VYDAC的C18反向柱，柱溫28 ℃，流動(dòng)相A為乙腈+0.08%三氟乙酸，流動(dòng)相B為水+0.1%三氟乙酸，梯度變化為：2% A：98% B 至24% A：76% B 持續(xù)45 min，然后變?yōu)?2% A：98% B持續(xù)5 min。流速 200 μL/min，檢測波長為280 nm。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0(Origin Lab Inc)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 吸附動(dòng)力學(xué)研究

在25 ℃下，經(jīng)過氫氧化鈉-鹽酸改性處理后的余甘果粉末對EGCG的吸附動(dòng)力學(xué)曲線如圖1(A)所示。余甘果粉末對EGCG的單位吸附量(qt)隨著吸附時(shí)間的延長而呈現(xiàn)對數(shù)增長趨勢。吸附開始后的前30 min內(nèi)顯示出了快速增長趨勢；而在吸附后期(120～1440 min)出現(xiàn)了平臺(tái)型，表明吸附基本達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。說明，在吸附初始階段，余甘果粉末表面有大量的可吸附位點(diǎn)，因此在吸附初期的吸附量增速較大。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，由于吸附劑表明可吸附位點(diǎn)的減少，同時(shí)吸附體系中游離態(tài)EGCG分子的減少，已吸附EGCG與游離態(tài)的EGCG之間排斥力等因素綜合作用下，吸附效率開始下降。

圖1 改性余甘果粉末對EGCG吸附的動(dòng)力學(xué)曲線(A)，擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合曲線(B)和擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合曲線(C)。EGCG起始濃度為200 mg/L。

將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)代入擬一級(jí)和擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合，擬合后得到擬一級(jí)和擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)曲線(圖1，B和C)，擬合所得參數(shù)列于表1。結(jié)果表明：擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合所得相關(guān)系數(shù)(0.99)大于擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果(0.84)，且由擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)預(yù)測的qe值(qe.cal)，相較于擬一級(jí)動(dòng)力學(xué)預(yù)測值，更接近于實(shí)驗(yàn)所得數(shù)值(qe.exp)，說明擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型更適用于描述改性余甘果粉末對EGCG的吸附過程，這一結(jié)果與前人利用PVPP吸附茶兒茶素類物質(zhì)時(shí)所得動(dòng)力學(xué)結(jié)果分析一致[26]。此外，余甘果粉末對EGCG的吸附過程中經(jīng)歷3個(gè)階段：

(1)初始階段中吸附質(zhì)(EGCG)分子通過外部邊界大量轉(zhuǎn)移至吸附劑(改性余甘果粉末)，這一階段也叫膜擴(kuò)散階段；

(2)第二階段是由吸附質(zhì)分子通過孔隙在吸附劑中擴(kuò)散，也稱為粒子內(nèi)擴(kuò)散；

(3)第三階段是吸附質(zhì)表面可吸附位點(diǎn)上吸附質(zhì)的交換；

表1 改性余甘果粉末對EGCG吸附動(dòng)力學(xué)的擬一級(jí)和擬二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合參數(shù)

*qe.exp,為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；qe.cal,為模型擬合數(shù)據(jù)；相對誤差=100×(|擬合數(shù)據(jù)-實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))/實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

由于第三階段吸附速度快，時(shí)間短，所以基本上吸附過程是由膜擴(kuò)散和粒子內(nèi)擴(kuò)散為主導(dǎo)的[27-28]。

3.2 等溫吸附研究

等溫吸附是用于描述在給定溫度條件下，吸附體系平衡時(shí)吸附劑的吸附率(qe)和吸附質(zhì)初始濃度(Ce)之間的關(guān)系。圖2(A)展示了改性余甘果粉末對EGCG吸附率和EGCG初始濃度之間的關(guān)系。

余甘果的平衡吸附率隨著初始EGCG濃度的增加而升高，推測這一現(xiàn)象是由以下原因造成：

(1)隨著初始EGCG濃度的提高，余甘果粉末表面未被占據(jù)的吸附位點(diǎn)會(huì)被越來越多的EGCG分子包圍，這導(dǎo)致了更多的EGCG分子能克服表面張力，吸附在余甘果粉末表面；

(2)更高的初始EGCG濃度意味著更多的游離態(tài)EGCG分子通過吸附質(zhì)孔隙擴(kuò)散至吸附劑內(nèi)部，這樣使得單位質(zhì)量吸附劑的吸附量上升；

Langmuir等溫吸附模型用于描述在給定溫度下單分子層的吸附過程，而Freundlich等溫吸附模型則用于描述在給定溫度下多分子層的吸附過程。本研究通過這兩種模型描述了改性余甘果粉末吸附EGCG的過程，擬合曲線如圖2(B和C)所示，這兩種吸附模型的參數(shù)列于表2，結(jié)果表明：這兩種模型均可以用于描述改性余甘果粉末吸附EGCG的過程(R2≥0.92)，吸附過程受初始EGCG的濃度和吸附劑表面未吸附位點(diǎn)數(shù)量共同作用的影響[29]。在Langmuir模型預(yù)測結(jié)果中，在較高溫度情況下，改性余甘果粉末具有較高的吸附率。這一趨勢也在Freundlich模型中的KF值得到驗(yàn)證。表2中，KF值沒有量綱，不具有物理學(xué)意義，只是吸附率的指征。

圖2 不同溫度條件下，改性余甘果粉末對EGCG等溫吸附曲線(A)，Langmuir擬合曲線(B)和Freundlich擬合曲線(C)。原點(diǎn)為25 ℃，方塊為40 ℃，三角形為55 ℃。

3.3 吸附的熱動(dòng)力學(xué)研究

吸附反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)吉布斯自由能變(ΔGo)，焓變(ΔHo)和熵變(ΔSo)計(jì)算值列于表3。改性處理后的余甘果粉末吸附EGCG反應(yīng)的ΔGo值均小于0，表明這余甘果粉末吸附EGCG的反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的；而各值之間極為接近，說明反應(yīng)的自發(fā)性對于反應(yīng)的溫度是獨(dú)立的[30]。當(dāng) ΔHo的絕對值在 2.1～20.9 kJ/mol時(shí)，反應(yīng)由物理吸附占主導(dǎo)；而當(dāng)ΔHo的絕對值在 80～200 kJ/mol時(shí)，反應(yīng)由化學(xué)反應(yīng)占主導(dǎo)[31-32]。本研究中，改性余甘果粉末吸附EGCG反應(yīng)的ΔHo值為7.63 kJ/mol，表明反應(yīng)是吸熱反應(yīng)，且反應(yīng)過程是由物理吸附為主導(dǎo)的，吸附劑與吸附質(zhì)分子間的范德華力是吸附過程的主要驅(qū)動(dòng)力。反應(yīng)的ΔSo值與液相/固相表明的吸附質(zhì)相關(guān)，而ΔSo值大于0，說明反應(yīng)的混亂度增加，可能是由于吸附劑表面的水分子被EGCG取代所致[26,33-34]。

表2 改性余甘果粉末吸附EGCG的Langmuir和Freundlich模型擬合參數(shù)

表3 改性余甘果粉末對EGCG吸附的熱力學(xué)參數(shù)

4 結(jié)論

本文研究了氫氧化鈉-鹽酸處理的余甘果粉末對EGCG的吸附特性，結(jié)果顯示，EGCG溶液初始濃度會(huì)影響改性余甘果粉末的吸附率，而反應(yīng)溫度的升高也會(huì)增加余甘果粉末對EGCG的吸附率。Langmuir和Freundlich等溫方程均可以描述這一體系的吸附反應(yīng)過程。熱力學(xué)分析表明，吸附反應(yīng)是一個(gè)吸熱、自發(fā)的過程，且反應(yīng)過程是由物理吸附占主導(dǎo)地位。研究結(jié)果說明，改性余甘果粉末可作為EGCG復(fù)合物載體應(yīng)用。