離子色譜測(cè)定窖泥中4種有機(jī)酸的不確定度評(píng)定

胡用軍,劉燕梅,侯 英

(宜賓市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所,四川 宜賓 644000)

白酒在我國有著悠久歷史和文化沉淀。酒中有機(jī)酸對(duì)酒質(zhì)有著重要貢獻(xiàn),可作為酯的前驅(qū)物質(zhì)以及起呈味和穩(wěn)定酒香氣的作用[1]。而窖泥作為發(fā)酵產(chǎn)酒環(huán)境,其中有機(jī)酸含量具有重要作用,如窖泥中有機(jī)酸含量與窖泥優(yōu)劣和熟化程度有關(guān)聯(lián)[2-3],進(jìn)而對(duì)酒質(zhì)產(chǎn)生影響[4]以及作為窖泥質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的依據(jù)之一[5-6]。根據(jù)張方等[1]研究,可依據(jù)有機(jī)酸質(zhì)量濃度≥10 mg/100 mL的乳酸、乙酸、丁酸、己酸歸為一類,且該4種有機(jī)酸可占濃香型白酒總酸的90%以上,研究窖泥中該4種有機(jī)酸具有重要意義。有機(jī)酸含量測(cè)定主要采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(gaschromatography-mass spectrometer,GC-MS)[7-8]、氣相色譜法(gaschromatography,GC)[9]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[10]、離子色譜法(ion chromatography,IC)[11-12]和毛細(xì)管電泳法(capillary electrophoresis,CE)[13-14]等方法,其中IC法對(duì)無機(jī)和有機(jī)陰離子具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),可方便、快速測(cè)定酒或窖泥中有機(jī)酸含量,較GC-MS法和GC法具有對(duì)乳酸直接測(cè)定優(yōu)勢(shì),較HPLC法有淋洗液配制簡單且不易受pH值變化影響優(yōu)勢(shì),較CE法有儀器在實(shí)驗(yàn)室存在的普遍性以至更易進(jìn)行有機(jī)酸測(cè)定的優(yōu)勢(shì)。

測(cè)量不確定度的定義為表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性[15],是對(duì)測(cè)量結(jié)果有效性的信心的體現(xiàn),也是對(duì)測(cè)量過程的分析,是掌握測(cè)量過程關(guān)鍵點(diǎn)的有效途徑。參考JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表不》[16]、CNASGL06—2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》中基本流程和文獻(xiàn)資料[17-18]來評(píng)定離子色譜法對(duì)窖泥中乳酸、乙酸、丁酸和己酸4種有機(jī)酸含量不確定度,分析了影響窖泥中4種有機(jī)酸測(cè)量準(zhǔn)確性的影響因素,掌握窖泥中4種有機(jī)酸含量測(cè)量的關(guān)鍵控制點(diǎn),保障測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性,為窖泥中有機(jī)酸進(jìn)一步相關(guān)研究提供基礎(chǔ)技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳酸(純度88.2%):北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;乙酸、丁酸、己酸(純度均為99.5%):天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;無水乙醇(分析純):成都科隆化學(xué)品有限公司;實(shí)驗(yàn)室用水為賽多利斯超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

IC-1100離子色譜儀(配電導(dǎo)檢測(cè)器(electrical conductivity detector,ECD)和氫氧根自動(dòng)淋洗發(fā)生器):美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg/L。分別準(zhǔn)確稱取適量的乳酸、乙酸、丁酸和己酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液配成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,該溶液冷藏保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL和1.0 mL于100 mL容量瓶中,用純水定容,得到標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為0、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L和10 mg/L?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 樣品前處理

①試樣制備

取適量鮮窖泥撒在干凈、不吸收水分的玻璃板上,充分混勻,裝入自封袋中,避光冷藏,備用。

②提取[19]

稱取新鮮窖泥25 g于250 mL帶蓋三角瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇(100-25×水分%)mL,搖勻。在室溫下浸泡1 h,每隔15 min搖動(dòng)1次。靜置,待泥沉降后,用精密濾紙、傾瀉法將上層溶液過濾于潔凈干燥的50 mL帶蓋三角瓶中。取濾液1 mL于100 mL容量瓶中,用水稀釋定容,經(jīng)0.45μm濾膜過濾后測(cè)定。

1.3.3 離子色譜條件

分離柱AS-11HC+AG11(4 mm×250 mm);流速:1.4 mL/min;柱溫:40℃;電子俘獲檢測(cè)器(electron capture detector,ECD)檢測(cè)器溫度:40℃;ASRS 500抑制電流:104 mA;進(jìn)樣體積:10μL。淋洗液梯度程序見表1。

表1 淋洗液梯度程序Table1 Gradient elution program of eluent

1.3.4 數(shù)學(xué)模型建立

鮮窖泥中4種有機(jī)酸含量計(jì)算公式[19]如下:

式中:ωi為鮮窖泥中有機(jī)酸i含量,mg/100 g;ρi為鮮窖泥浸出液中組分i含量,mg/L;V為浸出液體積,mL;d為浸出液稀釋系數(shù);m為鮮窖泥質(zhì)量,g;10為單位換算系數(shù)。

參考CNAS-GL06—2006《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》中A3.5,將重復(fù)性視為相對(duì)影響,以重復(fù)性系數(shù)frep形式引入不確定評(píng)定數(shù)學(xué)模型,得到完整模型計(jì)算公式如下:

1.3.5 不確定度來源的識(shí)別和分析

根據(jù)窖泥測(cè)量過程和數(shù)學(xué)模型可識(shí)別出測(cè)量過程的不確定度來源:重復(fù)性系數(shù)frep、浸出液中有機(jī)酸含量ρi、浸出液體積V、稀釋系數(shù)d和鮮窖泥質(zhì)量m的不確定度。而浸出液中有機(jī)酸含量ρi的不確定度又由校準(zhǔn)曲線的變動(dòng)性和配制校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度所引起的不確定度組成。繪制的因果關(guān)系圖見圖1。

圖1 不確定度因果關(guān)系Fig.1 Causal relationship of uncertainty

2 結(jié)果與分析

2.1 重復(fù)性系數(shù)frep的不確定度

重復(fù)性不確定度包含其他不確定度分量的重復(fù)性不確定度,故后面分量不再評(píng)定。

對(duì)鮮窖泥進(jìn)行6次獨(dú)立重復(fù)的測(cè)量。對(duì)每個(gè)測(cè)量值,采用JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表不》中貝塞爾公式(3)得到其標(biāo)準(zhǔn)偏差s(x),再利用公式(4)計(jì)算有機(jī)酸含量平均值xˉ的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(xˉ),重復(fù)性系數(shù)frep的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(frep)和相對(duì)不確定度urel(frep)則由公式(5)、(6)計(jì)算得到,結(jié)果見表2。

由表2可知,該窖泥有機(jī)酸含量中乳酸和己酸相當(dāng),其次為乙酸,最低為丁酸。重復(fù)性不確定度中乳酸和乙酸相當(dāng),丁酸和己酸相當(dāng),前者低于或者,但差值較小,大致相當(dāng)。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果不確定度(n=6)Table2 Uncertainty of repeatability tests results(n=6)

2.2 鮮窖泥浸出液中4種有機(jī)酸含量ρi的不確定度

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度

4種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液p的不確定度由純度Pi、質(zhì)量mi、體積V的不確定度決定。

(1)純度Pi的不確定度

乳酸為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(certifiedreferencematerial,CRM),純度為88.2%,相對(duì)擴(kuò)展不確定度為1%(k=2),則乳酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(P乳酸)=88.2%×0.01/2=0.44%。

乙酸、丁酸、己酸為色譜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),純度均為99.5%,相對(duì)誤差均為0.5%。按矩形分布進(jìn)行換算,乙酸、丁酸、己酸的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(P乙酸)=u(P丁酸)=u(P己酸)=0.5=0.29%。

(2)質(zhì)量mi的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用十萬分之一的天平稱量100 mg,經(jīng)過查看該天平檢定證書,其稱量誤差為±0.03 mg。天平測(cè)量兩次(一次空盤調(diào)零,一次稱樣),按照矩形分布,質(zhì)量mi的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(m)i=2×0.03=0.035 mg。

(3)體積V的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至100 mL容量瓶中。100 mL容量瓶的不確定度來源有兩部分:①容量瓶體積的不確定度,100mL容量允差為±0.10 mL[20],按照矩形分布換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.10=0.0577 mL;②容量瓶和溶液的溫度與矯正時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度,假設(shè)溫差為3℃,對(duì)水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1,則置信概率(P=1.96)時(shí)體積變化的區(qū)間為±100×3×2.1×10-4=±0.063 mL,轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.063/1.96=0.032 1 mL。

以上兩項(xiàng)合成得體積V的不確定度為u(V100)==0.58 mL。

2.2.2 校準(zhǔn)曲線的不確定度

4種有機(jī)酸含量的線性方程見表3,方程采用線性最小二乘法擬合曲線得到。因使用線性最小二乘法擬合曲線程序的前提是假定了橫坐標(biāo)的量的不確定度遠(yuǎn)小于縱坐標(biāo)的量的不確定度,所以,浸出液中有機(jī)酸含量ρi不確定度計(jì)算程序僅僅與峰面積有關(guān),而與校準(zhǔn)溶液不確定度無關(guān),也不與從同一溶液中逐次稀釋產(chǎn)生必要的相關(guān)性。4種有機(jī)酸的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度足夠小以至可以忽略。

因此,工作曲線變動(dòng)性引起4種浸出液中有機(jī)酸含量ρi的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為(7)、(8),計(jì)算結(jié)果見表3。

式中:S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)差;b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;P為試液的測(cè)量次數(shù),6;n為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的測(cè)量次數(shù),5;ρ為被測(cè)浸出液中有機(jī)酸的質(zhì)量濃度,mg/L;cˉ為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中有機(jī)酸質(zhì)量濃度的平均值,mg/L;ci為標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中有機(jī)酸含量質(zhì)量濃度,mg/L。

表3 浸出液中有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果的不確定度Table3 Uncertainty of determination results of organic acids content in leach liquid

由表3可知,標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度中4種有機(jī)酸大致相當(dāng),區(qū)別僅在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度。標(biāo)準(zhǔn)曲線變動(dòng)性引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度差別均較大,從大到小依次是丁酸、乙酸、乳酸、己酸,其中丁酸的相對(duì)不確定度遠(yuǎn)大于其他3種,這主要由含量差別所導(dǎo)致。

2.3 浸出液體積V的不確定度

2.3.1 鮮窖泥中水分含量不確定度

參考HJ613—2011《土壤干物質(zhì)和水分的測(cè)定重量法》對(duì)鮮泥中水分相對(duì)偏差要求＜5%[21],則當(dāng)鮮窖泥中水分含量為37.6%時(shí),絕對(duì)差值為1.88%。因乃有2次獨(dú)立重復(fù)的測(cè)量要求,按照極差法來評(píng)定不確定度,評(píng)定公式[16]如下:

通過查找JJG1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表不》中4.3.2.3的表1可知,當(dāng)n=2時(shí),極差系數(shù)C為1.13。故水分測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

則水分相對(duì)不確定度urel(水分)為0.031 3。

2.3.2 乙醇溶液的體積V'的不確定度

加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液的體積為90.6mL。采用100mL量出式量筒加入90.6mL,由于量筒最小分量為1mL,后面0.6 mL為估讀,誤差在±0.5 mL。所以量筒不確定度來源有三部分:①估讀誤差,按照矩形分布換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.29mL;②量筒體積不確定度,量筒允差為±1.0mL,按照矩形分布換算成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.577 mL;③量筒和溶液的溫度與矯正時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度,假設(shè)溫差為3℃,對(duì)水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1,則置信概率(P=1.96)時(shí)體積變化的區(qū)間為±90.6×3×2.1×10-4=±0.057 1 mL,轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.057 1/1.96=0.029 1 mL。

2.4 浸出液稀釋系數(shù)d的不確定度

本實(shí)驗(yàn)中,窖泥浸出液稀釋了200倍,即d=200。稀釋引起的不確定度由0.5 mL分度移液管和100 mL容量瓶的不確定度決定。

(1)0.5 mL分度移液管

0.5 mL分度移液管的標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要包括兩部分:①分度移液管體積的不確定度,按制造商給定分度移液管允差為誤差為±0.010mL,按照均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0033 mL;②分度移液管和溶液的溫度與校正時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度,假設(shè)溫差為3℃,對(duì)水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1,則95%置信概率(P=1.96)時(shí)體積變化的區(qū)間為±0.5×3×2.1×10-4=±0.000 3 mL,轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.000 3/1.96=0.000 2 mL。

以上兩項(xiàng)合成得出:

(2)100 mL容量瓶不確定度

100 mL容量瓶的不確定度已在2.2.1節(jié)進(jìn)行了評(píng)定,直接引用結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V100)=0.58 mL。

因此,稀釋系數(shù)d的相對(duì)不確定度計(jì)算公式如下:

2.5 質(zhì)量m的不確定度

窖泥稱量為25 g,采用百分之一的天平,經(jīng)過查看該天平檢定證書,其誤差為±0.02 g。天平測(cè)量兩次(一次空盤調(diào)零,一次稱樣),按照矩形分布,質(zhì)量m的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(m)=20.023 g,相對(duì)不確定度為ur(elm)=0.023/25=0.000 92。

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度

窖泥中4種有機(jī)酸含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式如下:

取擴(kuò)展因子k=2(近似95%的置信概率),則4種有機(jī)酸的擴(kuò)展不確定度計(jì)算公式如下:

表4 不確定度分量一覽表Table4 Component list of uncertainty

續(xù)表

由表4可知,4種有機(jī)酸含量不確定度主要且共同貢獻(xiàn)來自重復(fù)性和水分含量不確定度,而乙酸和丁酸含量的不確定度貢獻(xiàn)還有來自標(biāo)準(zhǔn)曲線變動(dòng)性不確定度,尤其丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線變動(dòng)性不確定度貢獻(xiàn)突出,這可能跟所測(cè)含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)上位置有一定關(guān)系。4種有機(jī)酸含量的其他不確定度分量均小于最大不確定度的三分之一,可以忽略。

2.7 分析結(jié)果報(bào)告

離子色譜測(cè)定窖泥中4種有機(jī)酸含量的結(jié)果為:

ω乳酸=(536±42)mg/100 g,k=2包含概率約95%

ω乙酸=(403±32)mg/100 g,k=2包含概率約95%

ω丁酸=(143±16)mg/100 g,k=2包含概率約95%

ω己酸=(535±42)mg/100 g,k=2包含概率約95%

3 結(jié)論

本研究對(duì)離子色譜法測(cè)定鮮窖泥中4種有機(jī)酸含量的不確定度進(jìn)行了評(píng)定。通過評(píng)定分析確定影響乳酸和己酸不確定度的主要因素是重復(fù)性和水分含量,而影響乙酸和丁酸不確定度的主要因素是重復(fù)性、水分含量和標(biāo)準(zhǔn)曲線。這要求鮮窖泥在取樣后應(yīng)注意樣品保藏并盡快測(cè)定,且在4種有機(jī)酸含量測(cè)定時(shí),應(yīng)重點(diǎn)控制重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)曲線誤差影響,即需要操作人員水平高,樣品均勻性好,儀器性能佳。本研究結(jié)果為窖泥中開展有機(jī)酸進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)技術(shù)支撐。