不同發(fā)酵方式下甘藍(lán)泡菜中有機(jī)酸的HPLC分析

王芮東,衛(wèi)博慧,李 楠,楊金菊

(1.運(yùn)城學(xué)院 理科實(shí)驗(yàn)中心,山西 運(yùn)城 044000;2.運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系,山西 運(yùn)城 044000)

泡菜是利用濃度較低的鹽水來腌漬新鮮蔬菜,并通過乳酸菌厭氧發(fā)酵制成的具有咸酸口味的浸漬品[1-4],其營養(yǎng)豐富,含有較高的碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸和維生素等營養(yǎng)成分[5-6],并且具有抗突變活性、抗癌以及抗衰老等作用[7-9]。泡菜的發(fā)酵方式主要包括傳統(tǒng)發(fā)酵和純種發(fā)酵2種方式,家庭、小作坊等生產(chǎn)以傳統(tǒng)發(fā)酵方式為主,在蔬菜中按一定比例加入鹽水、自制泡菜菌水以及老泡菜水等進(jìn)行自然發(fā)酵,如:自然發(fā)酵、自制泡菜菌發(fā)酵和老泡菜水發(fā)酵等;大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)主要應(yīng)用純種發(fā)酵方式,在蔬菜中加入鹽水后接入一定的乳酸菌菌種來進(jìn)行發(fā)酵[10-11]。

有機(jī)酸是形成泡菜特色酸性風(fēng)味的物質(zhì),泡菜中含有多種有機(jī)酸,分別來源于新鮮蔬菜、泡菜發(fā)酵過程和食品添加劑[12]。泡菜質(zhì)量檢測的重要指標(biāo)之一是有機(jī)酸含量的檢測,目前對于泡菜中有機(jī)酸含量測定的文獻(xiàn)較少,王冉等[13]用反相高效液相色譜(reversed-phasehigh performance liquid chromatography,RP-HPLC)法測定泡菜中的有機(jī)酸;張坤等[14]用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)同時(shí)測定泡椒中的6種有機(jī)酸;鄒輝等[15]以白菜為原料自然腌制泡菜,采用高效液相色譜法和分光光度法,測定腌制過程中有機(jī)酸的種類及含量、亞硝酸鹽的含量,并進(jìn)行有機(jī)酸對亞硝酸鹽降解實(shí)驗(yàn),研究了泡菜中有機(jī)酸及其對亞硝酸鹽含量的影響。

本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對自然發(fā)酵、純種發(fā)酵、自制泡菜菌發(fā)酵和老泡菜水發(fā)酵4種不同發(fā)酵方式制作的甘藍(lán)泡菜中的有機(jī)酸進(jìn)行測定,比較不同發(fā)酵方式生產(chǎn)的泡菜中各有機(jī)酸種類和含量的差異,以期為泡菜生產(chǎn)工藝的深入研究提供一定數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍(lán)(卷心菜):運(yùn)城市佳緣超市;泡菜乳酸菌發(fā)酵粉:北京川秀科技有限公司制造;高粱酒(53%vol):山西省春玉酒業(yè)有限公司;磷酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉(均為分析純)、甲醇(色譜純):天津市大茂化學(xué)試劑廠;草酸、檸檬酸、丙酸、琥珀酸、DL-蘋果酸、乳酸、酒石酸、乙酸、抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品:美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC1200型高效液相色譜儀、Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm):美國Agilent公司;FHS-3C型pH計(jì):上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;TDL6M型大型離心機(jī):長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;TG16MW型臺式高速離心機(jī):湖南赫西儀器裝備有限公司;JJ/2型組織搗碎勻漿機(jī):江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;KQ-300GDV型數(shù)控超聲波清洗儀:昆山市超聲儀器有限公司;FA1604型電子天平:上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 泡菜制作

甘藍(lán)經(jīng)挑選、整理、清洗、瀝干、切分后裝入泡菜壇中,按照下列不同操作方式分別進(jìn)行自然發(fā)酵、純種發(fā)酵、自制泡菜菌發(fā)酵和老泡菜水發(fā)酵。

自然發(fā)酵:按甘藍(lán)與食鹽水(食鹽水質(zhì)量濃度為6g/100mL,下同)質(zhì)量比1∶2的比例裝入泡菜壇,密封、室溫發(fā)酵。

純種發(fā)酵:按甘藍(lán)與食鹽水質(zhì)量比1∶2的比例裝入泡菜壇,同時(shí)加入總質(zhì)量0.3%的泡菜乳酸菌發(fā)酵粉,密封、室溫發(fā)酵。

自制泡菜菌發(fā)酵:將高粱酒(53%vol)與食鹽水按體積比1∶20混合,然后加入總質(zhì)量5%的青椒,密封、室溫發(fā)酵5～6 d,待青椒變黃后,自制泡菜發(fā)酵菌制成。按甘藍(lán)與自制泡菜菌液質(zhì)量比1∶2的比例裝入泡菜壇,密封、室溫發(fā)酵。

老泡菜水發(fā)酵:使用以前自然發(fā)酵制作泡菜的老泡菜水,按甘藍(lán)與老泡菜水質(zhì)量比1∶2的比例加入到泡菜壇,密封、室溫發(fā)酵。

1.3.2 樣品處理

參照楊君等[15-16]的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取發(fā)酵第7天的甘藍(lán)泡菜和汁液各50.0g,一起放入組織搗碎機(jī)搗碎成漿,將其作為有機(jī)酸、總酸度、pH值等測定的儲備樣品使用。稱取上述儲備樣品5.00g于離心管中,以轉(zhuǎn)速為4 000r/min離心15 min,準(zhǔn)確吸取上清液15 mL加入10 mL超純水,于75℃超聲波處理20min,再以12000r/min離心15min,上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾至2 mL進(jìn)樣瓶中待色譜測定。

1.3.3 有機(jī)酸測定

(1)色譜條件

Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);檢測器:可變波長掃描紫外檢測器(variable-wavelength ultraviolet detector,VWD);流動相:甲醇-0.01 mol/L磷酸二氫鉀(3∶97,V/V)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.8);檢測波長:分別對9種有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描(190～400nm),確定樣品的檢測波長;進(jìn)樣量:10μL;流速:1mL/min;柱溫:室溫。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密稱取草酸、抗壞血酸各18 mg,酒石酸75 mg,蘋果酸、檸檬酸、乳酸、乙酸各300 mg,琥珀酸700 mg,丙酸3 000 mg,用流動相溶解并定容至50 mL的容量瓶中,得到0.36 mg/mL的草酸、抗壞血酸,6 mg/mL蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸,1.5mg/mL酒石酸,14 mg/mL琥珀酸,60 mg/mL丙酸的混合有機(jī)酸母液。將母液用流動相稀釋為2、4、6、8、10、12倍,得到不同濃度梯度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:草酸、抗壞血酸(0.18mg/mL、0.09mg/mL、0.06mg/mL、0.045mg/mL、0.036 mg/mL、0.03 mg/mL)、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸(3 mg/mL、1.5 mg/mL、1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.6 mg/mL、0.5 mg/mL)、酒石酸(0.75 mg/mL、0.375 mg/mL、0.25 mg/mL、0.188 mg/mL、0.15 mg/mL、0.125 mg/mL)、琥珀酸(7 mg/mL、4.25mg/mL、2.33mg/mL、1.75mg/mL、1.4mg/mL、1.167mg/mL)、丙酸(30 mg/mL、15mg/mL、10mg/mL、7.5mg/mL、6mg/mL、5mg/mL),經(jīng)0.22μm濾膜過濾至2mL進(jìn)樣瓶中,進(jìn)樣,以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)求標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

(3)樣品測定

將處理后的樣液進(jìn)行HPLC分析,進(jìn)樣量為10μL,采用外標(biāo)法進(jìn)行定量。

1.3.4 總酸度測定

采用酸堿滴定法測定總酸(以乳酸計(jì))含量[17],準(zhǔn)確稱取上述儲備樣品10 g于250 mL容量瓶中定容,過濾后取濾液50 mL,用0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,每個(gè)樣液平行3次,求平均值。

1.3.5 pH值測定

采用精密pH計(jì)測定[18],準(zhǔn)確稱取上述儲備樣品50.0 g,加入10mL蒸餾水,攪拌均勻后進(jìn)行測定,每個(gè)樣液平行3次,求平均值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

在Agilent ChemStion工作站,根據(jù)色譜圖中樣品的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間比對進(jìn)行定性分析,根據(jù)各有機(jī)酸的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)酸測定結(jié)果

2.1.1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)混合液HPLC分析

在上述色譜條件下,有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖見圖1。

由圖1可知,9種有機(jī)酸分離效果良好,保留時(shí)間分別為草酸3.306 min、酒石酸3.737 min,D-蘋果酸4.693 min、乳酸5.179 min、抗壞血酸5.445 min、乙酸5.808 min、L-蘋果酸8.036 min、檸檬酸8.973 min、琥珀酸9.240 min、丙酸12.826 min。

圖1 有機(jī)酸混合標(biāo)樣的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed organic acid standards

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

將不同濃度梯度的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC分析,對測得值進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析和線性回歸分析,結(jié)果見表1。

由表1可知,9種有機(jī)酸分別在其線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)(R2)均＞0.991,結(jié)果表明各有機(jī)酸的峰面積與質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性良好,在此條件下可以很好地測定有機(jī)酸的含量。

表1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程,相關(guān)系數(shù)及線性范圍Table1 Regression equations,correlation coefficients and linear range of standard curves of organic acids

2.1.3 精密度試驗(yàn)

將稀釋10倍的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)進(jìn)樣6次,根據(jù)所得峰面積分別計(jì)算精密度,結(jié)果見表2。由表2可知,9種有機(jī)酸的峰面積測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)范圍為0.004 2%～0.161 2%,表明該方法的精密度良好。

表2 測定方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table2 Results of precision tests of the method(n=6)

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取純種發(fā)酵方式的泡菜樣品6份,按1.3.1節(jié)方法處理后,按上述色譜條件進(jìn)樣分析,測得各有機(jī)酸的峰面積,結(jié)果見表3。由表3可知,測定結(jié)果重復(fù)性RSD范圍為0.503%～5.687%,表明該方法的重復(fù)性均達(dá)到分析的要求。

表3 測定方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table3 Results of repeatability tests of the method(n=6)

續(xù)表

2.1.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取以純種發(fā)酵方式制作的泡菜和汁液各50.0g,按1.3.2方法制備樣品儲備液。測定每種有機(jī)酸樣品儲備液4份,其中1份作為本底,另3份分別添加低、中、高3個(gè)水平有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別預(yù)處理后進(jìn)行色譜分析,其中低、中、高3水平每個(gè)水平進(jìn)行3次平行測定,結(jié)果見表4。由表4可知,9種有機(jī)酸的回收率在94.2%～105.4%之間,說明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表4 有機(jī)酸測定的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of adding recovery rate tests of the organic acids

2.1.6 甘藍(lán)泡菜樣品中有機(jī)酸的測定結(jié)果

在上述色譜條件下,對四種不同發(fā)酵方式的甘藍(lán)泡菜樣品進(jìn)行測定,四種不同發(fā)酵方式的泡菜樣品的色譜圖分別見圖2,有機(jī)酸測定結(jié)果見表5。

圖2 自然發(fā)酵(A),純種發(fā)酵(B),自制泡菜發(fā)酵菌發(fā)酵(C)及老泡菜水發(fā)酵(D)泡菜中有機(jī)酸分析的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of organic acid of pickles made by natural fermentation(A),pure-culture fermentation(B),homemade pickles fermentation(C)and aged pickles water(D)

表5 四種不同發(fā)酵方式的甘藍(lán)泡菜中有機(jī)酸含量Table5 Organic acids contents in cabbage pickles by four fermentation methods

由表5可知,自然發(fā)酵和純種發(fā)酵方式的泡菜中9種有機(jī)酸均被檢出,老泡菜水發(fā)酵方式的泡菜檢出8種,琥珀酸未被檢測出;自制泡菜發(fā)酵菌泡菜檢出7種,琥珀酸和檸檬酸未被檢測出;四種發(fā)酵方式的泡菜中有機(jī)酸總量從大到小順序?yàn)?純種發(fā)酵＞老泡菜水發(fā)酵＞自制發(fā)酵菌發(fā)酵＞自然發(fā)酵,四種發(fā)酵方式泡菜中共有的有機(jī)酸有:草酸、酒石酸、DL-蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、丙酸,各主要有機(jī)酸含量大小順序均為:草酸＞乳酸＞抗壞血酸＞酒石酸＞DL-蘋果酸,這與王冉等[21-23]的研究的結(jié)果相似。草酸、抗壞血酸含量高主要是由于蔬菜原料卷心菜本身含有大量的草酸和抗壞血酸,乳酸含量高是由于乳酸菌為泡菜的主要發(fā)酵菌,通過乳酸發(fā)酵會使乳酸含量增加[24];泡菜中的每種有機(jī)酸呈現(xiàn)的酸味特征不同,但均為泡菜的特色風(fēng)味物質(zhì),單一的有機(jī)酸口味比較平淡,多種有機(jī)酸的共同作用能夠賦予泡菜更加可口的風(fēng)味[25]。

2.2 泡菜樣品總酸度及pH值測定結(jié)果

采用酸堿滴定法和pH計(jì)對四種不同發(fā)酵方式的泡菜樣品中總酸度和pH值進(jìn)行測定,結(jié)果見表6。

表6 四種不同發(fā)酵方式的泡菜總酸度和pH值Table6 Total acidity and pH value of cabbage pickles made by four fermentation methods

由表6可知,四種不同發(fā)酵方式的泡菜總酸度在0.76～0.92 g/100 mL范圍內(nèi),從大到小順序?yàn)?純種發(fā)酵＞老泡菜水發(fā)酵＞自制泡菜菌發(fā)酵＞自然發(fā)酵,這與柳建華等[26]研究結(jié)果一致,這是由于汁液是泡菜中乳酸菌發(fā)酵的主環(huán)境,純種發(fā)酵的乳酸菌是經(jīng)過篩選的具有耐酸能力的菌種,老泡菜水是經(jīng)過較長時(shí)間篩選的泡菜水[27],兩者的乳酸菌總數(shù)均高于其他兩種發(fā)酵方式的乳酸菌總數(shù),且乳酸菌代謝活動比較旺盛,酸的生成速率較快[28]。

四種不同發(fā)酵方式的泡菜pH值范圍在3.95～4.73,由大到小順序?yàn)?自然發(fā)酵＞自制泡菜菌發(fā)酵＞老泡菜水發(fā)酵＞純種發(fā)酵,這是由于純種發(fā)酵泡菜的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)M1產(chǎn)酸能力強(qiáng),生長繁殖快,對pH的耐受能力強(qiáng),而自然發(fā)酵泡菜中發(fā)酵啟動慢,原料自身攜帶的發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)酸能力弱所致[29]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用AgilentTC-C18色譜柱,經(jīng)過精密度(0.0042%～0.161 2%)、重復(fù)性(0.503%～5.687%)、回收率(94.2%～105.4%)等方法學(xué)的考察,建立了一種HPLC同時(shí)測定四種不同發(fā)酵方式泡菜中9種有機(jī)酸的分析方法,該方法具有簡便、快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用此方法測定出四種不同發(fā)酵方式泡菜中共有的有機(jī)酸有7種:草酸、酒石酸、DL-蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、丙酸,各主要有機(jī)酸含量大小順序?yàn)?草酸＞乳酸＞抗壞血酸＞酒石酸＞DL-蘋果酸,不同發(fā)酵方式的泡菜中總有機(jī)酸量從大到小依次為:純種發(fā)酵＞老泡菜水發(fā)酵＞自制發(fā)酵菌發(fā)酵＞自然發(fā)酵。