當(dāng)歸根系土壤有機(jī)磷降解菌的分離鑒定及其生長(zhǎng)特性的研究

陳 娟,王治業(yè)*,杜津昊,曾 楊,彭軼楠,季 彬,鞏曉芳,祁宏山

(1.甘肅省科學(xué)院 生物研究所,甘肅 蘭州 730000;2.甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000)

自20世紀(jì)60年代以來,許多國(guó)家開始禁止或限制使用有機(jī)氯農(nóng)藥,高效、低成本的有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides,Ops)作為有機(jī)氯的取代物[1]迅速在國(guó)內(nèi)外大量生產(chǎn)或使用,并逐步發(fā)展成為一類高效、廣譜的農(nóng)藥產(chǎn)品[2]。有機(jī)磷農(nóng)藥的廣泛使用大大促進(jìn)了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[3],但由于其大多屬于中高毒性農(nóng)藥,且多具有內(nèi)吸毒性,在環(huán)境中殘留量大,難以自然降解,因此在保護(hù)農(nóng)作物的同時(shí),也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染,己經(jīng)給生態(tài)環(huán)境和人體健康造成了巨大的危害和深遠(yuǎn)的影響。因此迫切需要建立一種有效的方法消除或減少機(jī)磷農(nóng)藥的污染[4]。

目前,降解有機(jī)磷農(nóng)藥的方法主要有物理降解、化學(xué)降解和生物降解[5]。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法成本高,并可能產(chǎn)生新的污染物,且作用相對(duì)較慢。利用微生物或生物產(chǎn)品來降解污染物的生物修復(fù)法[6]是指在微生物作用下使農(nóng)藥的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致農(nóng)藥的化學(xué)和物理性質(zhì)改變的過程,通過將農(nóng)藥從大分子化合物降解為小分子化合物,最后成為H2O與CO2,實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境的無害化降解。與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法相比,微生物降解法是一個(gè)新的農(nóng)藥降解途徑,其優(yōu)勢(shì)在于投入低、無毒、無殘留、無二次污染,治理效果也相對(duì)明顯[7]。隨著農(nóng)藥殘留問題的日益突出和人們環(huán)保意識(shí)的提高,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于降解無機(jī)磷的菌株研究較多[8-10],而對(duì)于以卵磷脂和植酸磷為惟一磷源的有機(jī)磷降解菌的篩選則研究比較少[11-12]。

此研究選擇以植酸鈣和卵磷脂為唯一磷源,從當(dāng)歸根系土壤中分離篩選有機(jī)磷高效降解菌,分離篩選出一株或幾株能夠高效廣譜降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株,并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化特性、分子生物學(xué)鑒定及生長(zhǎng)特性的研究,以期為降解土壤有機(jī)磷的微生物肥料提供高效穩(wěn)定的生產(chǎn)菌種,為后續(xù)研制具有降解土壤有機(jī)磷功效的生物有機(jī)肥提供高效、穩(wěn)定的菌種及基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土樣采集

2014年9月,利用對(duì)角線布點(diǎn)法,從岷縣麻子川鄉(xiāng)當(dāng)歸試驗(yàn)田采集當(dāng)歸根系土壤樣品,4℃保存。

1.1.2 對(duì)照菌株

巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)1.223:由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供,是解磷微生物肥料生產(chǎn)的常用菌種。

1.1.3 培養(yǎng)基

植酸鈣固體培養(yǎng)基:葡萄糖10.0 g,(NH4)2SO40.2 g,MgCl2·6H2O 5.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.1 g,植酸鈣2.0 g,瓊脂15～18 g,蒸餾水1 L。用該培養(yǎng)基篩選得到的菌株為植酸鈣降解菌。

蒙金娜固體培養(yǎng)基:葡萄糖10.0 g,(NH4)2SO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,NaCl 0.3g,KCl 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·4H2O 0.03 g,CaCO35.0 g,蛋黃卵磷脂1.0 g,瓊脂15～18 g,蒸餾水1 L。用該培養(yǎng)基篩選得到的菌株為卵磷脂降解菌。

1.2 儀器與設(shè)備

AS型干燥箱:北京科偉永興儀器有限公司;LBH-300T多功能粉碎機(jī):永康科徠爾有限公司;SKY-100C恒溫?fù)u床:上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司;島津UV-120-02紫外可見分光光度計(jì):杭州庫(kù)侖科技有限公司;MJ-150Ⅱ培養(yǎng)箱:上海一恒科技有限公司;ZRN-PH-D型臺(tái)式pH計(jì):北京中瑞能儀表技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 解磷菌的初篩

菌株初篩采用稀釋平板涂布分離法。準(zhǔn)確稱取10 g過100目篩的土樣,加入無菌水100 mL,再加入適量玻璃珠,振蕩30 min,按10倍稀釋法配制土壤懸液,取三個(gè)稀釋度(10-4～10-6)的土壤懸液,接種于有機(jī)磷平板培養(yǎng)基上,接種量為0.1 mL,設(shè)置3個(gè)重復(fù),在28℃的恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)7 d,觀察記錄具有透明圈的菌落。

1.3.2 解磷菌的分離純化

將具有解磷圈的菌落分離純化,進(jìn)一步在有機(jī)磷分離培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,測(cè)量解磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)。

將D/d＞1.5的菌株進(jìn)一步通過劃線法純化[13],直至得到純菌株之后,轉(zhuǎn)至牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上,30℃條件下靜置培養(yǎng)24 h,于4℃冰箱保存,作為后續(xù)試驗(yàn)用菌株。

1.3.3 解磷菌的復(fù)篩

將初篩獲得的解磷菌及菌株1.223菌懸液按照接種量2%(V/V)接種至植酸鈣液體培養(yǎng)基中,以培養(yǎng)基中加入等體積的無菌水作為對(duì)照,每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù),28℃、120r/min條件下振蕩培養(yǎng)8 d,分析菌株對(duì)有機(jī)磷的降解率。

1.3.4 分析檢測(cè)[14]

采用鉬銻抗比色法分別測(cè)定其培養(yǎng)前后總磷和無機(jī)磷含量,再計(jì)算出培養(yǎng)前后有機(jī)磷含量的變化情況,從而得出菌株對(duì)有機(jī)磷的降解率。有機(jī)磷含量、菌株對(duì)有機(jī)磷的降解率的計(jì)算公式如下:

1.3.5 細(xì)菌16SrDNA的擴(kuò)增與測(cè)序

(1)細(xì)菌總脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)的提取

參照文獻(xiàn)[15]采用十六烷基三乙基溴化銨(cetyltriethylammonium bromide,CTAB)法提取細(xì)菌總DNA。

(2)引物

采用細(xì)菌16SrDNA[16]通用引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechain reaction,PCR)擴(kuò)增,其引物序列:

(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件

97℃預(yù)變性5 min;96℃變性1 min,56℃退火1 min,76℃延伸2 min,30個(gè)循環(huán);76℃再延伸10 min。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物純化回收后,送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。

1.3.6 菌株最適生長(zhǎng)條件的研究

(1)最適pH的測(cè)定

用1 mol/L HCl和1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)有機(jī)磷培養(yǎng)基的初始pH[17],使培養(yǎng)基的初始pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),接種量為5%,接種后在28℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h,測(cè)定OD600nm值[18],以確定其生長(zhǎng)的最適pH。

(2)最適溫度的測(cè)定

設(shè)置培養(yǎng)溫度分別為(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃),接種量為5%,200r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h[19],每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),測(cè)定OD600nm值,以確定其生長(zhǎng)的最適溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的初篩

圖1 植酸鈣平板培養(yǎng)條件下菌株w-1,w-2,w-3分解有機(jī)磷的能力Fig.1 Organophosphorus-degrading ability of strain w-1,w-2 and w-3 on calcium phytate plate

從使用過有機(jī)磷農(nóng)藥的當(dāng)歸生地育苗土壤采集被農(nóng)藥污染的土樣,利用富集培養(yǎng)的方法,通過篩選、分離,共獲得3株生長(zhǎng)良好的土壤有機(jī)磷降解菌,命名為菌株w-1、w-2、w-3。這3株有機(jī)磷降解菌都是植酸鈣降解菌,未分離得到卵磷脂降解菌,其產(chǎn)生透明圈見圖1。由圖1可知,菌株w-1、w-2、w-3在植酸鈣固體培養(yǎng)基上均有明顯的透明圈產(chǎn)生,表明得到的菌株為植酸鈣降解菌,將其分別接種于牛肉膏蛋白胨斜面上成斜面菌種,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 有機(jī)磷降解菌在植酸鈣固體平板上的解磷特性

通過上一步的初篩,獲得了3株植酸鈣降解菌,因此本研究采用含植酸鈣的固體平板培養(yǎng)基測(cè)定分離菌株的解磷能力,利用菌落周圍產(chǎn)生的透明圈大小(直徑D)和菌落本身大小(直徑d)比值來初步判斷細(xì)菌的解磷能力,結(jié)果見表1。由表1可知,菌株w-1、w-2、w-3的D/d值分別為1.39、1.47、1.72,篩選出D/d＞1.5的解有機(jī)磷菌株1株(菌株w-3)。

表1 不同解磷細(xì)菌菌株的特征Table1 Characteristics of different phosphate-degrading bacteria

2.3 解磷菌的復(fù)篩

將初篩獲得的菌株w-3及菌株1.223的菌懸液按照接種量2%(V/V)接種至植酸鈣液體培養(yǎng)基中,以植酸鈣液體培養(yǎng)基中加入等體積的無菌水作為對(duì)照,探討菌株w-3對(duì)植酸鈣的解磷能力,其測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 基于植酸鈣液體培養(yǎng)基法測(cè)定菌株w-3的有機(jī)磷降解能力Table2 Organophosphorus-degrading ability of strain w-3 by calcium phytate fluid medium method

由表2可知,菌株w-3的有機(jī)磷降解率為69.82%,高于對(duì)照菌株1.223的30.81%,是菌株1.223的2.27倍。結(jié)果表明,菌株w-3具有較強(qiáng)的分解植酸鈣的能力。

2.4 菌株w-3的形態(tài)特征及生理生化特性

圖2 菌株w-3的菌落(A)和細(xì)胞(B)形態(tài)Fig.2 Colonial(A)and cell(B)morphology of strain w-3

菌株w-3的形態(tài)特征及生理生化特性見圖2。由圖2A可知,菌株w-3在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)48h后可形成較大菌落。菌落邊緣不整齊,表面有褶皺、隆起,粗糙不透明,呈污白色或微黃色,濕潤(rùn)易挑起,單菌落一般呈圓形狀。由圖2B可知,經(jīng)革蘭氏染色觀察,菌株w-3為革蘭氏陽(yáng)性菌。

表3 菌株w-3的生理生化特征Table3 Physiological and biochemical characteristics of strain w-3

2.5 16SrDNA的擴(kuò)增與測(cè)序

以細(xì)菌16SrDNA通用引物對(duì)菌株w-3進(jìn)行PCR擴(kuò)增16SrDNA基因序列見圖3。

圖3 菌株w-3的16S rDNA序列Fig.3 16S rDNA sequence of strain w-3

由圖3可知,獲得了1.5 kb左右的16SrDNA片段。將測(cè)序序列利用Genbank DNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST相似性比較,利用MEGA6.0軟件構(gòu)建菌株w-3系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖4。由圖4可知,菌株w-3的16SrDNA序列和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性都在99%以上,依據(jù)細(xì)菌分類學(xué)家普遍認(rèn)可的原則:當(dāng)16SrDNA全序列同源性＞97%為屬內(nèi)同一種,93%～95%為屬外成員。因此,菌株w-3被鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

圖4 菌株w-3基于16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain w-3 based on 16S rDNA gene sequence

2.6 菌株最適生長(zhǎng)條件的研究

2.6.1 最適初始pH的測(cè)定

pH值是菌種生長(zhǎng)的環(huán)境因子,對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物的積累有重要的影響,不同的微生物類群生長(zhǎng)對(duì)pH的要求不同。一般而言,細(xì)菌適合在中性偏堿的情況下生長(zhǎng),而真菌則喜好微酸環(huán)境。有機(jī)磷降解菌是利用有機(jī)磷降解酶降解有機(jī)磷,因此確定合適的pH,有利于提高有機(jī)解磷酶的活性,從而提高降解有機(jī)磷的效率。不同pH條件下菌株w-3的生長(zhǎng)狀況見圖5。

圖5 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)菌株w-3生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of initial pH value of medium on the growth of strain w-3

由圖5可知,菌株w-3對(duì)生長(zhǎng)pH的要求并不是很嚴(yán)格,在廣泛的pH值4.0～10.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好,在pH 8.0的生長(zhǎng)環(huán)境下,該細(xì)菌的生長(zhǎng)最旺盛。因此,選擇pH 8.0作為培養(yǎng)基最適初始pH值。

2.6.2 最適溫度的測(cè)定

溫度對(duì)微生物的影響突出,影響酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、微生物生長(zhǎng)速率等,溫度過高微生物無法生存,溫度過低微生物的活性受到抑制,因此合理控制溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)非常的重要。不同溫度條件下,菌株w-3的生長(zhǎng)狀況結(jié)果見圖6。

圖6 溫度對(duì)菌株w-3生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of temperature on the growth of strain w-3

由圖6可知,在考察的7個(gè)溫度梯度中,菌株w-3在15～35℃的生長(zhǎng)量隨著溫度的升高而增大,在35℃時(shí)生長(zhǎng)量最高,OD600nm值達(dá)到2.530;溫度為40℃時(shí),OD600nm值為2.189,略低于35℃時(shí)的生長(zhǎng)量;當(dāng)溫度再升高至45℃時(shí),生長(zhǎng)量急劇下降,OD600nm值為0.878。因此,確定菌株w-3的最適生長(zhǎng)溫度為35℃。

3 結(jié)論

從當(dāng)歸生地育苗土壤中分離得到降解有機(jī)磷菌株w-3,其對(duì)植酸鈣有較強(qiáng)的降解能力,其解磷率可達(dá)到69.82%;通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征及16SrDNA同源性比較,鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

本實(shí)驗(yàn)所分離得到的有機(jī)磷降解菌w-3有較廣的pH值的適應(yīng)范圍,可在pH4.0～10.0條件下生長(zhǎng)良好,其最適pH值為8.0;溫度對(duì)w-3活性影響較大,最適宜的生長(zhǎng)溫度為35℃。

菌株w-3于2017年06月15日保藏在甘肅省工業(yè)微生物菌種保藏中心,保藏號(hào)為GSCII 32901。本實(shí)驗(yàn)所分離篩選的菌株w-3對(duì)植酸磷具有良好的解磷效果,達(dá)到了實(shí)驗(yàn)篩選有機(jī)磷降解菌的目的。菌株w-3溶磷能力指標(biāo)的相關(guān)性還有待進(jìn)一步研究。

枯草芽孢桿菌降解有機(jī)磷農(nóng)藥具有重要意義,不僅可以達(dá)到為植物生長(zhǎng)提供磷源的目的,而且能夠在一定程度上消除農(nóng)藥污染。以此實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),通過對(duì)菌株的開發(fā)可以加工成微生物菌肥,以基肥、準(zhǔn)肥等形式施用到農(nóng)田中,這樣既可以改善土壤缺磷狀況又能夠降解土壤中殘留的農(nóng)藥,為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供保障。