二肽基肽酶-IV抑制活性酵母篩選與鑒別

王世博,李平蘭,張金蘭*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

糖尿病是慢性、全身性的代謝疾病,表現(xiàn)為糖代謝紊亂,可能會(huì)導(dǎo)致血栓、動(dòng)脈硬化等血管病變[1],危害人體健康,減損壽命。糖尿病的發(fā)病率在近年來伴隨著肥胖癥狀的增加而升高[2],2000年時(shí)全球有1.51億糖尿病患者,2010年時(shí)達(dá)到2.85億人[3],預(yù)計(jì)在2030年全球的糖尿病患者將達(dá)到3.66億人[4]。二型糖尿病(type2 diabetes,T2D)也稱非胰島素依賴型糖尿病(noninsulin-dependent diabetesmellitus,NIDDM)。據(jù)推算我國的糖尿病患者中絕大部分為二型糖尿病,一型糖尿病的患者乃有不到5%[3]。

二肽基肽酶-IV(dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)抑制劑是一類新興的二型糖尿病治療藥物,通過抑制DPP-IV對腸泌素(incretin)的降解,維持或延長血液中腸泌素的降血糖效果,從而達(dá)到控制血糖的效果[5-6]。目前市場上已有的DPP-IV抑制藥物價(jià)格昂貴,且存在一定的副作用,因此越來越多的研究著手于尋找天然食品來源(如魚類、蛋類、乳類、大米)的DPP-IV抑制劑[7-11]。

本研究對酒醅中的酵母菌進(jìn)行分離,對菌株的發(fā)酵上清液成分和胞內(nèi)提取物成分的DPP-IV抑制活性進(jìn)行了測定,篩選其中的DPP-IV抑制活性菌株,并對菌株進(jìn)行生理生化試驗(yàn)和26SrDNA提取及鑒定,以期得到較高DPP-IV抑制活性的酵母菌菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅:某酒廠提供;瓊脂粉(生化試劑):北京酷來搏科技有限公司;酵母粉(生化試劑):英國Oxoid公司;蛋白胨(生化試劑):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;酵母脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)小量提取試劑盒:美國Omega公司;DPP-IV抑制劑篩選試劑盒:美國Sigma公司;金牌 Mix(green)Golden Star T6 Super PCRMix(1.1×):北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖(生化試劑):法國Biowest公司。

馬鈴薯葡萄糖肉湯(potatodextrosebroth,PDB)培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextroseagar,PDA)培養(yǎng)基的配制:每1L馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中加入20g瓊脂粉,煮沸溶解,121℃滅菌20min,備用。

磷酸鹽緩沖液-葡萄糖溶液的配制:配制磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)(稱取8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4溶于1 000 mL蒸餾水),每100mL磷酸鹽緩沖溶液中加入2g葡萄糖,充分溶解,121℃滅菌20 min,備用。

酵母浸出物培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptonedextrose,YPD):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LEGEND MICRO 17臺(tái)式高速離心機(jī):美國Thermo Scientific公司;EF28 pH計(jì):梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MQD-S3 R恒溫培養(yǎng)箱:上海晏泉儀器有限公司;FA1004電子分析天平:上海天平儀器廠;L9600D聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction,PCR)儀:萊普特科學(xué)儀器(北京)有限公司;Synergy HT多功能酶標(biāo)儀:美國BioTek公司;BG-subMIDI多用途水平電泳儀:北京百晶生物技術(shù)有限公司;Tanon 1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng):上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅中酵母菌的分離

在無菌水中加入酒醅樣品,振蕩制成懸液,進(jìn)行梯度稀釋。選取合適稀釋度涂布于PDA培養(yǎng)基平板,于30℃培養(yǎng)72 h。根據(jù)菌落形態(tài)和菌體形態(tài)挑取酵母菌單菌落,接種于馬鈴薯葡糖肉湯培養(yǎng)基,于30℃搖床培養(yǎng)72h。將酵母菌保存于瓷珠菌種保存管,-20℃冰箱貯存待用。

1.3.2 酵母菌發(fā)酵上清液的制備

將活化的酵母菌接種在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,取菌液95℃水浴5 min滅活,4 000×g離心5 min,收集菌體,使用PBS洗滌3遍,懸浮于PBS-葡萄糖溶液,在30℃條件下培養(yǎng)2 h,4 000×g離心5 min,取上清液備用。

1.3.3 酵母菌胞內(nèi)提取物的制備

將活化的酵母菌接種在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,取菌液95℃水浴5 min滅活,4 000×g離心5 min,收集菌體,使用PBS洗滌3遍,使用超聲破碎30 min(超聲條件:功率30%,工作3 s停5 s),12 000×g離心5 min,取上清液備用。

1.3.4 生理生化試驗(yàn)

發(fā)酵糖類試驗(yàn):使用杜氏管,管中加入10 mL試驗(yàn)糖濃度為50 mmol/L的酵母浸出物培養(yǎng)基(每1 L水中加入5 g酵母粉),接種100μL菌液,于25℃培養(yǎng)7 d。若最終杜氏管的小試管中有氣體產(chǎn)生,則試驗(yàn)結(jié)果為陽性,無氣體則為陰性。試驗(yàn)糖為葡萄糖、D-半乳糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、纖維二糖。

碳源同化試驗(yàn):在試管中加入10 mL使用試驗(yàn)碳源替換葡萄糖的YPD培養(yǎng)基(每1 L水中加入10 g酵母粉、20 g蛋白胨、20 g試驗(yàn)碳源),接種100μL菌液,于25℃培養(yǎng)7 d。若酵母菌能夠正常生長,則試驗(yàn)結(jié)果為陽性,不能生長則為陰性。試驗(yàn)碳源為:D-半乳糖、L-山梨糖、D-核糖、D-木糖、L-鼠李糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、乳糖、菊糖、棉子糖、D-甘露糖、海藻糖、檸檬酸。

1.3.5 26SrDNA鑒定

采用酵母DNA小量提取試劑盒提取酵母基因組。提取后的DNA可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物采用NL-1(5'-gcatatcaataagcggaggaaaag-3')、NL-4(5'-ggtccgtgtttcaagacgg-3')[12],PCR反應(yīng)使用即用型快速PCR預(yù)混液,反應(yīng)體系(50μL)為:預(yù)混液45μL、引物NL-12μL、引物NL-42μL、模板1μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?98℃、2 min;98℃、10 s,62℃、10 s,72℃、10 s,36個(gè)循環(huán);72℃、5 min,4℃保溫。PCR產(chǎn)物由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果使用美國國家生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)網(wǎng)站基本本地比對搜索工具(basic local alignment search tool,BLAST)與GenBank中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,下載近緣物種菌株的26SrDNA序列,使用MAGA 10.0.4軟件中ClustalW工具件進(jìn)行匹配排列,之后利用MEGA軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[13],進(jìn)而確定酵母菌株的種屬。

1.3.6 DPP-IV抑制活性測定

DPP-IV抑制活性使用DPP-IV抑制劑篩選試劑盒進(jìn)行測定,反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測定樣品的熒光值(FLU)(輸出波長λex=360 nm/輸入λem=460 nm)。其中樣品加入DPP-IV和底物;陰性對照采用試劑盒中的緩沖液代替樣品;陽性對照不加入樣品同時(shí)加入DPP-IV抑制劑;空白對照采用緩沖液代替DPP-IV。各組的反應(yīng)體系如表1所不。

表1 DPP-IV抑制活性測定體系Table1 System of DPP-IV inhibitory activity determination μL

樣品的DPP-IV抑制率計(jì)算公式如下:

式中:FLU樣品為樣品的熒光值,FLU樣品空白對照為樣品空白對照的熒光值,FLU陽性對照為陽性對照的熒光值,FLU陽性空白對照為陽性空白對照的熒光值,FLU陰性對照為陰性對照的熒光值,FLU陰性空白對照為陰性空白對照的熒光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌株DPP-IV抑制率

本實(shí)驗(yàn)中共檢測了28株酵母菌(編號(hào)J1～J28)發(fā)酵上清液與胞內(nèi)提取物的DPP-IV抑制活性。菌株的DPP-IV抑制率如表2所不。DPP-IV抑制率數(shù)值越大,表明菌株對DPP-IV的抑制活性越強(qiáng);抑制率數(shù)值為負(fù)值表不該菌株非但不能對DPP-IV有抑制作用,反而會(huì)促進(jìn)DPP-IV催化底物的反應(yīng)。

表2 不同菌株發(fā)酵上清液與胞內(nèi)提取物的DPP-IV抑制活性Table2 DPP-IV inhibitory activity of the fermentation supernatant and intracellular extract from different strains

由表2可知,菌株J6發(fā)酵上清液DPP-IV抑制率最高,為9.37%;菌株J8胞內(nèi)提取物DPP-IV抑制率最高,為16.04%。

2.2 菌株鑒定

菌株J6及J8的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 菌株J6及J8的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Colony morphology and cell morphology of strain J6 and J8

由圖1可知,菌株J6菌落圓形,邊緣整齊,表面光滑有光澤,呈乳白色,不透明;細(xì)胞呈卵圓形。菌株J8菌落圓形,中央凸起,邊緣稍呈波狀,表面粗糙無光澤,成白色,邊緣半透明;菌株J8菌落呈圓形,邊緣整齊,呈乳白色,細(xì)胞呈卵圓形。

通過生理生化反應(yīng),菌株J6與菌株J8對不同糖類的發(fā)酵情況如表3所不,對不同碳源的同化情況如表4所不。

表3 糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of sugar fermentation test

表4 碳源同化試驗(yàn)結(jié)果Table4 Results of carbon source assimilation test

由表3和表4的結(jié)果,根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》初步判斷菌株J6為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),菌株J8屬于酵母屬(Saccharomyces sp.)。

通過試劑盒提取酵母菌菌株J6與J8的基因組。通過引物NL-1與引物NL-4對基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖2所不。

圖2 菌株J6、J8 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PCR amplified products of strain J6 and J8

由圖2可知,2株菌在500～750 bp之間有明顯的條帶,長度約為600 bp。經(jīng)過測序,菌株J6的26SrDNA序列長度為618bp,菌株J8的26SrDNA序列長度為607 bp。通過BLAST比對,從GenBank獲取近緣物種的26SrDNA序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖3所不。

圖3 基于26S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequence

由圖3可知,菌株J6與Saccharomyces cerevisiae strain NS-G-52、S.cerevisiae strain A48存在較高同源性(96%～97%),應(yīng)同為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae);菌株J8與菌株Wickerhamomycesanomalus isolate HN1、W.anomalus strain H4、W.anomalus strain NS-G-34、W.anomalus strain A4存在較高同源性(95%～97%),應(yīng)同為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。

3 結(jié)論

在本研究中,得到兩株對DPP-IV有抑制活性的酵母菌:菌株J6為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),菌株J8為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)。在某些微生物體內(nèi),如乳桿菌[14]、雙歧桿菌[15]中,也發(fā)現(xiàn)有天然的DPP-IV抑制劑存在,這些微生物可以作為益生菌或工程菌投入生產(chǎn),開發(fā)具有降血糖作用的藥物或功能食品。在本研究中,發(fā)現(xiàn)在酵母菌的發(fā)酵上清液與胞內(nèi)提取物中存在DPP-IV抑制活性,此發(fā)現(xiàn)在國內(nèi)外尚屬首次。酵母菌在食品工業(yè)中有廣泛的用途,在饅頭、面包等主食、酒類、醬油、食醋等食品的生產(chǎn)過程有重要的作用。在近年來隨著糖尿病發(fā)病率的上升,開發(fā)新型降血糖功能食品逐漸成為一種趨勢[16]。在食品的生產(chǎn)過程中使用有DPP-IV抑制活性的酵母菌菌株作為功能性酵母進(jìn)行發(fā)酵,或在食品中添加提取自酵母DPP-IV抑制活性的提取物,有助于開發(fā)有降血糖作用的功能食品[17]。

目前已有的研究表明,來自膳食中蛋白質(zhì)的數(shù)種肽可以作為DPP-IV的競爭性抑制劑產(chǎn)生DPP-IV抑制活性[18]。在乳桿菌中,胰蛋白酶處理后的細(xì)菌上清液DPP-IV抑制活性特異性增加,表明其DPP-IV抑制活性物質(zhì)是肽[19]。據(jù)此推測在酵母菌中,發(fā)揮DPP-IV抑制作用的也是肽。本研究表明,酵母菌存在DPP-IV抑制活性,菌株J6與菌株J8的抑制活性較高。在之后的研究中,將會(huì)對DPP-IV抑制活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化,研究活性物質(zhì)在人體消化吸收過程中的變化,并選育具有更高DPP-IV抑制活性的酵母菌菌株,為開發(fā)具有高DPP-IV抑制活性的功能性酵母菌奠定基礎(chǔ)。