石蘆清金顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究*

蒙麥俠,陳志永,楊智峰, 崔小敏

陜西省中醫(yī)藥研究院(西安 710003)

主題詞 @石蘆清金顆粒 麻黃堿 色譜法, 高壓液相

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD，簡(jiǎn)稱慢阻肺)是一種以氣流受限為特征的疾病，其氣流受限不完全可逆，呈進(jìn)行性發(fā)展。隨全球環(huán)境的日趨惡劣，COPD的發(fā)生率及死亡率不斷升高，據(jù)WHO預(yù)計(jì)到2020年，COPD將躍升至易患疾病的第5位，常見(jiàn)死因第3位。COPD急性發(fā)作期病情嚴(yán)重，單純西醫(yī)激素及各類氣管擴(kuò)張藥物治療效果不理想，而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)對(duì)此病認(rèn)識(shí)源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，認(rèn)為COPD屬于中醫(yī)“喘證”、“肺脹”等范疇。COPD急性加重期多因外邪犯肺，郁而化熱，熱傷肺津，煉液成痰，或素有宿痰，內(nèi)蘊(yùn)日久化熱，痰與熱結(jié)，痰瘀互結(jié)，壅阻與肺，肺失宣降所致；或因脾虛生痰，或痰熱素盛，加之感受外邪，外邪與痰熱相合，郁遏肺氣，故見(jiàn)發(fā)熱，氣急咳喘，痰熱壅肺，氣滯不通，故見(jiàn)胸悶脹滿等。

石蘆清金顆粒由炙麻黃、生石膏、姜半夏、蘆根、冬瓜仁、地龍、金蕎麥、黃芩、薏苡仁等十三種藥味組成，該方是國(guó)家名老中醫(yī)劉華為教授治療慢性阻塞性肺病多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，具有宣肺平喘、清熱化痰之功[1-4]，用于慢性阻塞性肺病急性發(fā)作期的痰熱癰肺型具有很好的療效，但是該藥臨床一直以傳統(tǒng)湯劑形式應(yīng)用，湯劑具有煎煮繁瑣、難于保存、攜帶不便及服用量大等缺點(diǎn)，因此為了提高患者用藥依從性，結(jié)合患病人群特點(diǎn)，將其制成了無(wú)糖型顆粒劑；為了評(píng)價(jià)該顆粒劑制備工藝的穩(wěn)定和可控性，擬建立其質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)系統(tǒng)研究，建立了黃芩、薏苡仁、甘草、知母和地龍的薄層鑒別和臣藥炙麻黃中止咳平喘有效成分鹽酸麻黃堿的含量測(cè)定方法。

材料與方法

1 儀 器 LC-2010A HT型島津高效液相色譜儀；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器；賽多利斯BT25S電子分析天平。

2 試劑與試藥 鹽酸麻黃堿對(duì)照品，批號(hào)：171241-201508；薏苡仁油對(duì)照提取物，批號(hào)：111750-201102；苦杏仁苷，批號(hào)：110820-201305；黃芩對(duì)照藥材，批號(hào)：120955-201309；甘草對(duì)照藥材，批號(hào)：120904-201318；芒果苷，批號(hào)：111607-200402；蘆根對(duì)照藥材，批號(hào)：110855-201412；地龍對(duì)照藥材，批號(hào)：120987-201107；上述對(duì)照品及對(duì)照藥材來(lái)自中國(guó)藥物生物制品鑒定所；石蘆清金顆粒為陜西省中醫(yī)醫(yī)院自制，批號(hào)：171110、171115、171120；甲醇、乙腈為色譜純，丙酮、乙酸乙酯及磷酸等均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

3 方 法

3.1 薄層色譜鑒別：陰性樣品制備按照原有處方分別去除黃芩、薏苡仁、甘草、知母、地龍和炙麻黃后，按照制備工藝制得相應(yīng)陰性樣品。

3.1.1 供試品溶液制備依次稱取三批石蘆清金顆粒4 g、3 g、8 g、3 g、7 g，順次加入乙酸乙酯-甲醇(3∶1)的混合溶液25 ml、石油醚25 ml、正丁醇25 ml、30%丙酮20 ml和三氯甲烷25 ml，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)来渭尤爰状?、石油醚、正丁醇?0%丙酮和三氯甲烷各2 ml，得黃芩供試品溶液、薏苡仁供試品溶液、甘草供試品溶液、知母供試品溶液和地龍供試品溶液。

3.1.2 陰性樣品和對(duì)照藥材溶液制備：照供試品溶液處理方法，制成黃芩、薏苡仁、甘草、知母和地龍陰性樣品溶液，黃芩、甘草、地龍對(duì)照藥材溶液。

薄層色譜鑒別方法照中國(guó)藥典2015版四部0502薄層色譜法進(jìn)行。

3.1.3 黃芩TLC鑒別[5]：吸取黃芩3批供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性樣品溶液各2 μl，照操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用乙酸乙酯-甲苯-甲醇-甲酸(3∶10∶1∶2)混合溶液展開(kāi)，取出晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)Rf值處，有相同顏色斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1A。

3.1.4 薏苡仁TLC鑒別[6]：取薏苡仁油對(duì)照提取物，加石油醚(60～90℃)制成每1ml含2mg的溶液，作為對(duì)照提取物溶液。吸取薏苡仁3批供試品溶液、陰性樣品溶液和薏苡仁對(duì)照提取物溶液各2μl，照操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶1∶0.1)混合溶液展開(kāi)，取出晾干，均勻噴以5%香草醛硫酸乙醇溶液(需臨用現(xiàn)配)，置105 ℃加熱至色譜斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照提取物色譜相應(yīng)Rf值處，顯相同顏色的藍(lán)色斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1B。

3.1.5 甘草TLC鑒別[6]：吸取甘草3批供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性樣品溶液各2μl，照操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用三氯甲烷-甲醇(8∶2)的混合溶液展開(kāi)，取出晾干，均勻噴以10%硫酸乙醇溶液，置105℃加熱至色譜斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)Rf值處，顯相同顏色的黃色斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1C。

3.1.6 知母TLC鑒別[6]： 取芒果苷對(duì)照品適量，制成每1 ml含0.5 mg的稀乙醇溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取知母3批供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性樣品溶液各5μl，照操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用乙醇-水(1∶1)的混合溶液展開(kāi)，取出晾干。置365 nm的紫外光燈下觀察，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)Rf值處，顯相同顏色的黃色熒光斑點(diǎn)；或均勻噴以1%的三氯化鐵乙醇溶液，日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)Rf值處，顯相同顏色藍(lán)色斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1D、E。

3.1.7 地龍TLC鑒別[6]：吸取地龍3批供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和陰性樣品溶液各2μl，照操作方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用丙酮-甲苯(1∶9)的混合溶液展開(kāi)，取出晾干。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)Rf值處，顯相同顏色的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾，結(jié)果見(jiàn)圖1F。

A.黃芩；B.薏苡仁；C.甘草；D.知母熒光、E.知母日光；F.地龍1、2、3-供試樣品；4-對(duì)照藥材或?qū)φ掌罚?-陰性樣品

3.2 含量測(cè)定[7-9]:流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液(1.2∶3∶95.8)；色譜柱：Inertsil ODS-3 C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；流速：1.0 ml/min；理論塔板數(shù)：以鹽酸麻黃堿計(jì)不低于3000。

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取適量鹽酸麻黃堿，制成每1 ml含0.0438 mg的甲醇溶液，即得。

3.2.2 供試品溶液的制備：取石蘆清金顆粒約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 ml 1.44%的磷酸甲醇溶液，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用上述溶液補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液用0.45 um的微孔濾膜過(guò)濾，即得。

3.2.3 陰性樣品溶液的制備：取炙麻黃陰性樣品約1 g，精密稱定，同供試品處理方法處理，得炙麻黃陰性樣品溶液。

3.2.4 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：分別精密吸取三種溶液10 μl，注入液相色譜儀，按色譜條件檢測(cè)，記錄色譜圖。由圖譜可知，在鹽酸麻黃堿對(duì)照品出峰位置，供試品溶液有相應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)，與其相鄰色譜峰分離度良好；陰性樣品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品色譜圖主峰位置，無(wú)對(duì)應(yīng)色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明樣品中其余組分對(duì)鹽酸麻黃堿含量測(cè)定無(wú)干擾(圖2)。

A:標(biāo)準(zhǔn)品; B:供試品;C:陰性樣品;1:鹽酸麻黃堿

3.2.5 線性范圍考察：精密稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品適量，制成每1 ml含0.1028 mg的甲醇溶液；精密吸取上述溶液2、4、6、8、10、12 μl，按色譜條件測(cè)定，并以鹽酸麻黃堿含量和峰面積進(jìn)行回歸分析，結(jié)果表明鹽酸麻黃堿在0.2056～1.2336 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=2170691x+25111(r=0.9997)。

3.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)：精密連續(xù)吸取鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)溶液6次，每次10 μl，按色譜條件測(cè)定，計(jì)算鹽酸麻黃堿峰面積和變異系數(shù)，結(jié)果RSD為1.55%，表明儀器精密度良好。

3.2.7 提取方法考察：取供試品5份，每份約1.0 g，精密稱定，置磨口三角瓶中，分別精密加入1.44%的磷酸甲醇溶液25 ml，稱定重量，其中1至4份超聲提取相應(yīng)時(shí)間，第5份加熱回流提取30 min，提取后，放冷，再次稱定重量，用1.44%的磷酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的量，濾過(guò)，取續(xù)濾液用0.45 um的微孔濾膜濾過(guò)，即得。結(jié)果表明：加熱回流提取30 min，樣品中鹽酸麻黃堿提取率為最高，故確定提取方式為回流提取30 min，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 提取完全性試驗(yàn)結(jié)果

3.2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn):取同一批號(hào)的石蘆清金顆粒，按供試品溶液制備方法平行制備6份樣品，按色譜條件測(cè)定6份樣品中鹽酸麻黃堿含量，結(jié)果6份樣品平均含量為1.30 mg/g，RSD為1.91%，表明操作過(guò)程重現(xiàn)性良好。

3.2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn): 分別于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取同一供試品溶液10 μl，進(jìn)樣測(cè)定，考察鹽酸麻黃堿峰面積積分值在24 h內(nèi)的變化，結(jié)果表明在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD為0.85%。

3.2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn):精密稱取已知含量的石蘆清金顆粒6份，每份0.5g，再分別精密加入鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液(濃度：0.1534 mg/ml)5 ml和 1.44%的磷酸甲醇溶液20 ml。按供試品溶液制備方法制成加樣供試品溶液，測(cè)定鹽酸麻黃堿含量，計(jì)算回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.11 樣品含量測(cè)定:分別稱取3批樣品各約1 g，精密稱定，按照供試品溶液制備方法制成供試品溶液，照色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品中鹽酸麻黃堿含量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 三批樣品測(cè)定結(jié)果

討 論

薏苡仁薄層鑒別時(shí)，先選用現(xiàn)行版藥典薏苡仁項(xiàng)下展開(kāi)系統(tǒng)石油醚(60～90 ℃)-乙醚-冰醋酸(83∶17∶1)，結(jié)果需檢出薄層斑點(diǎn)Rf值偏大，調(diào)整為石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(10∶1∶0.1)時(shí)Rf值適中，故標(biāo)準(zhǔn)中采納。知母薄層鑒別時(shí)，以知母皂苷BⅡ標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，以正丁醇-冰醋酸-水(4∶1∶5)的上層溶液為展開(kāi)劑，香草醛硫酸試液顯色，結(jié)果陰性對(duì)照有干擾；參考文獻(xiàn)方法，供試樣品處理時(shí)加適量鹽酸水解后，以甲苯-丙酮(9∶1)為展開(kāi)劑，噴以5%的香草醛硫酸乙醇溶液，置紫外光燈(365 nm)下檢視，未發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的熒光斑點(diǎn)；在以芒果苷標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，聚酰胺薄膜為固定相，乙醇-水(1∶1)為展開(kāi)劑時(shí)，結(jié)果在紫外燈(365 nm)下檢視供試品色譜中與芒果苷對(duì)照品處有相對(duì)應(yīng)的薄層斑點(diǎn)出現(xiàn)，且陰性樣品無(wú)干擾，此方法采納。桃仁[10-11]中的苦杏仁苷因遇熱不穩(wěn)定，蘆根[12]在薄層鑒別中與金蕎麥相互有干擾，故三者的薄層鑒別方法經(jīng)試驗(yàn)研究未能建立。

生石膏為方中君藥，現(xiàn)行版藥典規(guī)定用酸堿滴定法測(cè)定含水硫酸鈣的含量，因中藥成分復(fù)雜，復(fù)方提取液顏色較深，滴定過(guò)程中指示劑顏色變色很難準(zhǔn)確判定，故以臣藥炙麻黃中有效成分鹽酸麻黃堿為含量控制指標(biāo)，經(jīng)方法學(xué)考察和對(duì)三批樣品的測(cè)定，同時(shí)考慮中藥材批次之間的差異性，最終確定石蘆清金顆粒中含炙麻黃以鹽酸麻黃堿計(jì)每克不得少于1.04 mg。