大黃活血化瘀作用的HPLC指紋圖譜分析*

李付玻 ，王奎鵬， 韓 立 ，郭曉娟 ，房 曉，何 棟

1. 河南省南陽市第一人民醫(yī)院西藥科(南陽 473000)，2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部(鄭州450000)， 3.南陽理工學院張仲景國醫(yī)國藥學院(南陽 473000)，4. 河南省開封市醫(yī)學科學研究所(開封 475000)

主題詞 大黃 活血祛瘀 色譜法, 高壓液相 @指紋圖譜

大黃為臨床常見中藥之一，源自蓼科植物大黃屬干燥根、根莖，以大黃素等蒽醌類衍生物為主要有效成分，發(fā)揮導瀉、解毒、化瘀、活血等作用[1]。近年來中醫(yī)藥質量控制成為研究熱點，對中藥大黃質量控制多依據蒽醌類衍生物含量，但實際上并非能對大黃整體特征反映[2]。目前指紋圖譜在中藥質量評估中發(fā)揮重要作用，通過信息采集技術及相關手段獲取中藥性質圖像、光譜等，能綜合性、整體性及量化鑒別分析中藥材與中成藥[3]。由于中藥成分復雜多樣，部分難以確定，中藥指紋圖譜“模糊性”與“整體性”特點相比單一或主要成分質量控制法更全面，更滿足中藥質量控制需求[4]。當下關于中藥指紋圖譜研究報道較多，但多集中于中藥材成分分析[5-6]，而關于其具體功效部位指紋圖譜分析研究較少?；诖?，本研究對中藥大黃活血化瘀作用部位進行指紋圖譜分析，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1 實驗主要試劑及儀器 甲醇(色譜純，天津市津東天正精細化學試劑廠)；純凈水(娃哈哈集團有限公司)；無水乙醇(分析純，深圳市宏遠強科技有限公司)；賽默飛Ultimate3000高效液相色譜儀(上海力晶科學儀器有限公司)；UV-9000波長可調紫外檢測器(上海技舟化工科技有限公司)；HH-S6恒溫水浴鍋(上?，斈醿x器設備有限公司)；電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)；80-2型離心機(上海醫(yī)療器械(集團)有限公司手術器械廠)。

1.1 對照品:大黃素、大黃酚及大黃酸對照品均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 提取物制備：選擇大黃1.6 kg，提取溶劑包括氯仿、正丁醇、50%乙醇與水，依次提取10倍量溶劑，提取2次，1次時間60 min，過濾、濃縮提取液，獲取相應溶劑提取部位。各部位均為棕褐色固體。臨用時按照7∶3比例的植物油、水進行研磨，超聲乳化下形成混懸液，將其作為生大黃各部位高劑量組、低劑量組，分別相當于10 g、5 g原生藥/kg，為人用劑量20倍、5倍，大鼠灌注用藥劑量1 ml/100 g。

2 方 法

2.1 大黃提取物對“血瘀”大鼠的活血化瘀作用：選擇SD清潔級大鼠100只，雌雄分別50只，體重平均(300±20)g，隨機分為空白對照組、模型對照組、大黃氯仿部位提取物高、低劑量組、大黃正丁醇部位提取物高、低劑量組、大黃50%乙醇部位提取物高、低劑量組、大黃水部位提取物高、低劑量組，每組10只。除空白對照組、模型對照組給予水油(7∶3)混懸液處理外，其他各組給予大黃不同部位提取物高、低劑量混懸液干預，給藥劑量均為1 ml、100 g，連續(xù)干預1周。最后1次用藥后除空白對照組外，其他各組通過大量注射腎上腺素與冰水浸泡構建“血瘀”大鼠模型，12 h后將大鼠股動脈剪開，取血，肝素抗凝，通過血液粘度儀測定各組大鼠全血粘度、紅細胞聚集率。

2.2 指紋圖譜建立：對照品溶液制備選擇合適劑量大黃酸、大黃素及大黃酚對照品，甲醇溶解后制作合適濃度的對照品儲備液；選擇上述儲備液合適容量到25 ml量瓶內，混合均勻，甲醇定容，形成16 μg/ml之標準混合對照品溶液，濾膜過濾后獲得續(xù)濾液。供試品溶液制備：選擇合適劑量的的大黃(大黃飲片，共10批，均源于四川省新荷花中藥飲片有限公司)，干燥、粉碎處理后過4號篩選擇藥材粉末2 g，氯仿、正丁醇、50%乙醇依次提取，相應處理后加甲醇到刻度，搖晃均勻，濾膜濾過后獲得供試品溶液。色譜條件：Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm)，0.1%磷酸甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)(82∶18)為流動相；流速1 ml/min，檢測波長254 nm。對大黃藥材供試品進行穩(wěn)定性實驗、精密度實驗及重復性實驗。

3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數據,計量資料以表示，行t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 大黃不同部位提取物對“血瘀”大鼠血液流變學的影響 見表1。 與空白對照組比較，模型對照組大鼠全血黏度、紅細胞聚集率均明顯高(P<0.05)，提示造模成功。與模型對照組比較，大黃正丁醇部位高、低劑量組、大黃50%乙醇部位高、低劑量組大鼠全血粘度、紅細胞聚集率均明顯低(P<0.05)，其他部位比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血液流變學指標比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05

2 HDLC指紋圖譜結果

2.1 穩(wěn)定性實驗：同一供試品溶液制備后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h測定，以主要色譜峰相對保留時間與相對峰面積一致性為觀察指標，結果顯示其相對標準偏差均<2%，提示供試品溶液24 h內較為穩(wěn)定。

2.2 精密度實驗： 對對照品混合液進行連續(xù)進樣，共5～6次，以主要色譜峰相對保留時間與相對峰面積一致性為觀察指標，結果顯示其相對標準偏差均<1%，提示儀器精密度較好。

2.3 重復性實驗：選擇大黃藥材5份按照方法中操作制備供試品溶液，以主要色譜峰相對保留時間與相對峰面積一致性為觀察指標，結果顯示其相對標準偏差均<2%，提示該方法重復性較好。

2.4 大黃活血化瘀有效部位指紋圖譜測定：選擇對照品混合溶液、供試品溶液分別15 μl，按照方法中色譜條件進樣，對對照品混合溶液、供試品溶液進行指紋圖譜測定記錄，見圖1-2。對10批大黃藥材藥品相關數據測定，并將其導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件中，計算獲取圖譜圖像，見圖3。10批大黃藥材相似度分別為0.978、0.995、0.980、0.956、0.975、0.991、0.970、0.974、0.966與0.993，可見樣品見相似度較高。

討 論

大黃在中醫(yī)用藥中使用較多，有清熱解毒、活血化瘀、導滯等多種功效。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，大黃還有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化等作用，其臨床應用價值大，受到廣大醫(yī)師的重視[7]。蔡惠芬等[8]研究發(fā)現(xiàn)大黃注射液能顯著降低血管搭橋術后犬血漿D-二聚體、纖溶酶原激活劑抑制物-1，且與用藥劑量相關，提示大黃注射液能明顯改善動物搭橋術后血液高凝，預防血栓形成，且呈現(xiàn)劑量依賴性特點。宋雨澤等[9]通過生物效價對生大黃、熟大黃、大黃炭活血化瘀作用測定，結果顯示其抗纖維蛋白原生物效價分別為1.4U、2.6U、1.6U，認為熟大黃的活血化瘀作用比其他高。動物實驗發(fā)現(xiàn)，大黃素能明顯改善膿毒癥后期大鼠血小板功能，且對P-選擇素下調以抗炎，進而發(fā)揮肝腎功能保護，減少病死率的目的[10]。為明確大黃活血化瘀功效及其作用部位，我們依據“血瘀”證患者血液流變學改變、寒邪等引發(fā)血瘀機理，通過注射大劑量腎上腺素、冰水浸泡構建“血瘀”大鼠。結果顯示模型對照組大鼠全血粘度、紅細胞聚集率比空白對照組均顯著增高，提示“血瘀”大鼠建模成功。同時本研究發(fā)現(xiàn)大黃正丁醇部位高、低劑量組、大黃50%乙醇部位高、低劑量組大鼠全血粘度、紅細胞聚集率比模型對照組均顯著低，而大黃氯仿部位、水部位高、低劑量組與模型對照組比較無顯著差異。提示大黃具有活血化瘀功效，且主要于正丁醇、乙醇提取部位表現(xiàn)。

中藥指紋圖譜以中藥基礎理論為依據，以現(xiàn)在信息提取技術為重要手段，對中藥材品種、質量進行整體分析，具有客觀性、“整體性”、“模糊性”特點。臨床評價不同中藥指紋圖譜以相似度為主要指標[11]，根據對照品、供試品指紋圖譜計算兩者之間的相似度，可參考“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件”(國家藥典委員會推薦)。通常情況相似度0.9～1.0間多為合格品。我們通過相關系數法計算大黃指紋圖譜相似度，相關系數分布在-1與1之間，-1提示2個圖譜變化完全相反，1提示2個圖譜變化趨勢完全一致[12]。竇志華等[13]以對照品指紋圖譜作為共有模式，結果發(fā)現(xiàn)不同批大黃飲片指紋圖譜相似度均在0.9～1.0之間，提示樣品間相似度較高，大黃飲片化學成分較為一致。本研究結果顯示10批大黃指紋圖譜相似度也在0.9～1.0間，可見本研究應用的提取方法、優(yōu)化色譜條件較為穩(wěn)定及可靠。同時本研究發(fā)現(xiàn)色譜指紋圖譜實驗方法穩(wěn)定性、精密度及重復性均較好。本研究篩查出大黃活血化瘀作用部位為乙醇提取物，結果顯示大黃活血化瘀作用部位HPLC指紋圖譜有7個峰。此外，有研究表明大黃不同飲片、不同產地、不同炮制品HPLC指紋圖譜存在差異[14-15]。本研究10批大黃飲片均購自同一廠家，可避免不同廠家對大黃活血化瘀作用HPLC指紋圖譜的影響。關于不用產地等大黃HPLC指紋圖譜分析有待日后通過多中心研究進一步分析。

綜上，大黃活血化瘀藥理作用部位主要為正丁醇與乙醇，本研究獲取指紋圖譜穩(wěn)定性、儀器精密度、重復性均良好，可作為大黃活血化瘀作用的特征指紋圖譜。