化學(xué)灼燒法大鼠口腔潰瘍動(dòng)物模型對(duì)照優(yōu)化的研究

陳吉莉，袁盛夢(mèng)，陳芳園，陳薈宇，韓沛豐，王福

(大連醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，大連 116044)

人類口腔黏膜潰瘍類疾病以復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、白塞病、放射性口炎最為常見(jiàn)。臨床多表現(xiàn)為潰瘍形成，即指口腔黏膜上皮的局限性組織缺損、結(jié)締組織暴露，其內(nèi)含有神經(jīng)血管，潰瘍形成后疼痛異常，極大影響患者精神狀態(tài)、飲食及正常生活[1-3]。臨床上常用的治療方法主要分為抗菌療法、抗炎療法、免疫調(diào)節(jié)治療、麻醉及另類療法等幾大類，通過(guò)藥膏、貼劑、含片、漱口水、外敷等方法局部給藥[4-5]，但療效均不顯著。因此建立一個(gè)穩(wěn)定可靠的口腔潰瘍動(dòng)物模型將為研究口腔潰瘍的有效臨床治療提供良好的基礎(chǔ)。

目前有關(guān)口腔黏膜潰瘍動(dòng)物模型的制備有多種方法，常見(jiàn)有免疫法[6]、化療法、化學(xué)燒灼法[7-11]、氧自由基法[12]、細(xì)菌感染誘導(dǎo)法[13]、創(chuàng)傷法[14]及放射法[15-16,20]等，所選動(dòng)物有兔[7]、大鼠、豚鼠及金黃地鼠等[17-18]?；瘜W(xué)灼燒法因方法簡(jiǎn)便可靠在研究中使用最多，常用的試劑為冰醋酸和氫氧化鈉[8-11]。然而，關(guān)于化學(xué)灼燒法建立口腔潰瘍模型的報(bào)道中，化學(xué)試劑、濃度、處理部位不一，同一部位能否連續(xù)建立潰瘍還不清楚。因此本研究采用控制變量法研究不同化學(xué)試劑、濃度、處理部位及同一部位建立潰瘍次數(shù)對(duì)潰瘍模型的影響，以期得到操作方法簡(jiǎn)便安全、能夠標(biāo)準(zhǔn)化、模型結(jié)果穩(wěn)定可靠、處理部位便于后續(xù)操作的口腔潰瘍模型建立方法，為進(jìn)一步研究口腔潰瘍的有效臨床治療及給藥方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，體重約180～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供【SCXK(遼)2013-0003】并飼養(yǎng)，在室溫22～25℃，濕度50% ～60%,12 h明暗交替條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)操作在大連醫(yī)科大學(xué)SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK(遼)2013-0006】。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào)：L2014035)。

冰醋酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，中國(guó))，制成40%、50%、60%濃度冰醋酸；NaOH晶體(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，中國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 化學(xué)灼燒法建立口腔潰瘍模型

首先將50只SD大鼠按體重大小編號(hào)1～50，在統(tǒng)計(jì)分析軟件中指定某一特定的種子數(shù)后產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的50個(gè)隨機(jī)數(shù)，按隨機(jī)數(shù)的大小順序?qū)?0只大鼠均勻地分為5組，每組10只，分別以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后固定于操作臺(tái)上，1～4組為下切牙牙槽骨唇側(cè)黏膜(以下簡(jiǎn)稱唇側(cè)黏膜)處理組(圖1 A)：用無(wú)菌棉球干燥SD大鼠唇側(cè)黏膜，并用無(wú)菌棉球隔濕，后將3 mm × 3 mm正方形濾紙片分別置于40%、50%及60%濃度冰醋酸5 s后取出，立即放置于干燥后的唇側(cè)黏膜上，或?qū)? mm × 3 mm的NaOH晶體置于唇側(cè)黏膜，維持30 s后取下濾紙片或NaOH晶體，用含生理鹽水無(wú)菌棉球蘸拭處理部位，去除殘余醋酸或NaOH，觀察記錄處理部位即刻反應(yīng)。第5組：采用50%濃度冰醋酸于SD大鼠單側(cè)頰黏膜處建立潰瘍模型(圖1B)。二次灼燒組：對(duì)唇側(cè)黏膜50%濃度冰醋酸處理組，待口腔潰瘍愈合后，于原部位采用50%濃度冰醋酸再次處理30 s，觀察同一部位二次化學(xué)燒灼法建立口腔潰瘍模型的效果。

注: A.下切牙牙槽骨唇側(cè)黏膜處理區(qū)；B. 頰側(cè)黏膜處理區(qū)。圖1 標(biāo)準(zhǔn)藥物浸透濾紙片化學(xué)燒灼法建立口腔潰瘍模型方法Note. (A) Lower labial gingival mucosa. (B) Buccal mucosa.Figure 1 Chemicals-soaked paper application for establishing an oral ulcer model in rats

1.2.2 肉眼觀察

術(shù)后48 h，觀察記錄潰瘍形成情況，包括形成潰瘍的出現(xiàn)率、潰瘍變化、外形是否均一規(guī)則、炎癥充血情況，是否符合人類口腔潰瘍的臨床特征。觀察記錄潰瘍愈合情況及愈合時(shí)間，愈合標(biāo)準(zhǔn)為黏膜上皮重新完全覆蓋潰瘍凹陷。

1.2.3 組織學(xué)觀察

術(shù)后48 h，于每組隨機(jī)選取兩只形成潰瘍的SD大鼠，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后切取潰瘍部位邊緣組織，4%多聚甲醛固定液中固定48 h后，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(7 μm)行HE染色，顯微鏡下觀察每張切片潰瘍部位視野的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況、上皮及血管變化情況，是否符合人類口腔潰瘍鏡下特征。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同化學(xué)灼燒同一部位建立潰瘍模型的出現(xiàn)率、肉眼觀、愈合時(shí)間及鏡下表現(xiàn)

不同化學(xué)灼燒形成潰瘍模型的出現(xiàn)率及愈合時(shí)間的基本數(shù)據(jù)如表1，可以看出唇側(cè)黏膜50%、60%濃度冰醋酸處理組建立潰瘍的出現(xiàn)率100%(表1，圖2 A)，與40%濃度冰醋酸組及NaOH處理組相比差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，說(shuō)明不同化學(xué)灼燒建立潰瘍的出現(xiàn)率并無(wú)太大差別，均可用于潰瘍模型的建立。不同濃度冰醋酸處理組，唇側(cè)黏膜即刻反應(yīng)相似，肉眼觀差異無(wú)顯著性，皆表現(xiàn)為輕微發(fā)紅，表面變粗糙。相比之下，NaOH處理組黏膜傷害較大，黏膜表面破潰出血，即刻形成不規(guī)則點(diǎn)狀凹陷，周圍黏膜發(fā)紅。

唇側(cè)黏膜化學(xué)燒灼法48 h后，各組皆有出現(xiàn)潰瘍，其中不同濃度冰醋酸處理組均表現(xiàn)為中央凹陷、假膜覆蓋、潰瘍邊緣紅腫、刺激疼痛反應(yīng)強(qiáng)烈。從潰瘍形狀看，50%濃度冰醋酸處理組潰瘍基本均呈規(guī)則圓形，平均直徑約為5～6 mm，而40%濃度冰醋酸組、60%濃度冰醋酸組形成的潰瘍形狀不均一，呈不規(guī)則圓形，直徑分別約為4～5 mm和6～8 mm。NaOH處理組潰瘍不規(guī)則，中央凹陷，直徑約為8～10 mm，潰瘍邊緣紅腫較為嚴(yán)重，刺激疼痛反應(yīng)更為強(qiáng)烈(圖2B)。

潰瘍的愈合時(shí)間是藥物治療有效性的關(guān)鍵指標(biāo)，根據(jù)表1我們進(jìn)一步可以看出50%濃度冰醋酸處理組潰瘍平均愈合時(shí)間與40%和60%濃度冰醋酸處理組相比差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，接近人類口腔潰瘍愈合時(shí)間，但明顯低于NaOH處理組(圖2C)，差異均具有顯著性(P< 0.05)。

化學(xué)燒灼法48 h后，HE染色示：40%、50%和60%冰醋酸處理的唇側(cè)黏膜區(qū)鏡下特點(diǎn)相似，表現(xiàn)為中央黏膜上皮脫落形成潰瘍，表面炎性滲出物覆蓋，周邊黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間水腫，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，上皮內(nèi)及血管周圍有密集炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主(圖2D)。40%、50%和60%冰醋酸處理的唇側(cè)黏膜區(qū)潰瘍愈合類似，肉眼觀潰瘍凹陷重新由黏膜上皮覆蓋，黏膜表面光滑，黏膜顏色較周圍黏膜稍偏淺，質(zhì)地稍偏韌，有小面積瘢痕形成，約半月后潰瘍部位黏膜顏色及質(zhì)地恢復(fù)正常。NaOH處理組潰瘍愈合后有較大面積瘢痕形成，潰瘍區(qū)黏膜恢復(fù)正常需更長(zhǎng)的時(shí)間。

表1 各組潰瘍出現(xiàn)率與愈合時(shí)間對(duì)比Table 1 Comparison of ulcer formation rate and healing time of the

注： 出現(xiàn)率比較：50%a(lm)與二次灼燒相比P< 0.05，與其他組相比P> 0.05；愈合時(shí)間比較：50%a(lm)與40%a(lm)、60%a(lm)相比P> 0.05，與其他組相比P< 0.05。a，冰醋酸；lm，唇黏膜；bm，頰黏膜。

Note. Formation rate: 50% acetic acid lower labial gingival mucosa [a(lm)] group versus the second burn group (P< 0.05) and the other groups (P> 0.05). Healing time: 50% a(lm) group versus the 40% a(lm) and 60% a(lm) groups (P> 0.05) and the other groups (P< 0.05). bm, buccal mucosa.

注：A. NaOH、40%、50%和60%冰醋酸(a)處理唇側(cè)黏膜的潰瘍出現(xiàn)率；B. NaOH、40%、50%和60%冰醋酸處理48 h后潰瘍區(qū)肉眼觀；C. NaOH、40%、50%和60%冰醋酸處理后潰瘍平均愈合時(shí)間；D. 50%冰醋酸處理48 h后潰瘍區(qū)的組織學(xué)改變(左×10、右×40)，標(biāo)尺=200 μm/50 μm。圖2 不同化學(xué)灼燒法形成潰瘍比較Note. Sodium hydroxide pellets, and 40%, 50%, and 60% acetic acid, were applied to the lower labial gingival mucosa of Sprague Dawley rats. (A) Ulcer formation rate. (B) Ulcer appearance after 48 h at the lower labial gingival mucosa. (C) Healing time. (D) Histological presentation of the ulcer area (HE stainning). Scale bars=200 μm, 50 μm.Figure 2 Comparison of the ulcer formation induced by different doses of chemicals

2.2 相同化學(xué)灼燒法不同部位建立潰瘍模型的出現(xiàn)率、肉眼觀、愈合時(shí)間及鏡下特點(diǎn)

50%濃度冰醋酸處理頰黏膜潰瘍出現(xiàn)率要比唇側(cè)黏膜低，但兩者相比其差異無(wú)顯著性(P> 0.05)(見(jiàn)表1和圖3 A)，說(shuō)明50%濃度冰醋酸處理頰黏膜也可用于潰瘍模型的建立。頰黏膜酸處理后即刻反應(yīng)與唇側(cè)黏膜相似，處理48 h后潰瘍不規(guī)則，中央凹陷，假膜覆蓋、潰瘍邊緣略紅腫、刺激疼痛反應(yīng)強(qiáng)烈，直徑約為2.5～3 mm(圖3B)。頰黏膜區(qū)域潰瘍平均愈合時(shí)間高于50%濃度冰醋酸處理唇側(cè)黏膜組，差異有顯著性(P< 0.05)(表1和圖3C)，頰黏膜潰瘍組織鏡下特點(diǎn)與唇側(cè)黏膜潰瘍類似，如前所述(圖3D)。

2.3 二次化學(xué)灼燒法同一部位建立潰瘍模型的出現(xiàn)率、肉眼觀及愈合時(shí)間統(tǒng)計(jì)分析

唇側(cè)黏膜二次化學(xué)灼燒法潰瘍出現(xiàn)率極低(圖4A)，與第一次相比，差異具有顯著性(P< 0.05)(見(jiàn)表1)。即使形成潰瘍，形狀也不規(guī)則，潰瘍面積較小(直徑約為2 mm)，邊緣黏膜略紅腫，刺激疼痛反應(yīng)輕微(圖4B)，平均愈合時(shí)間僅4 d，與第一次相比差異具有顯著性(P< 0.05)(表1和圖4C)，說(shuō)明該區(qū)域短時(shí)間內(nèi)不適合連續(xù)建立潰瘍模型。

3 討論

動(dòng)物模型是研究疾病病因、機(jī)制、轉(zhuǎn)歸及治療等的重要方法和手段。國(guó)內(nèi)外對(duì)口腔潰瘍動(dòng)物模型的建立也做了大量的研究、探究和論證[19]。免疫法誘導(dǎo)口腔潰瘍動(dòng)物模型的機(jī)理可能是特異性蛋白作為抗原進(jìn)入機(jī)體，產(chǎn)生了特異性抗體從而引發(fā)口腔黏膜免疫反應(yīng)。該方法的缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)，方法較復(fù)雜，口腔潰瘍出現(xiàn)的部位不固定，不適用于均一化的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，但適用于研究復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制?；煼ń⒖谇粷儎?dòng)物模型的表現(xiàn)與臨床接近，具有一定的代表性，但在口腔潰瘍的發(fā)生部位、發(fā)生時(shí)間、動(dòng)物選擇、藥物種類、給藥劑量及途徑等方面還要進(jìn)一步摸索。氧自由基法誘導(dǎo)口腔潰瘍動(dòng)物模型的最大缺點(diǎn)是動(dòng)物全身毒性反應(yīng)較重，在給藥劑量方面需根據(jù)不同動(dòng)物而選擇合適的劑量，在藥物篩選實(shí)驗(yàn)時(shí)需適當(dāng)擴(kuò)大樣本量。細(xì)菌感染誘導(dǎo)法建立口腔潰瘍動(dòng)物模型常用于口腔內(nèi)細(xì)菌、真菌感染性疾病及抗菌藥物評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型，不適合用于口腔潰瘍治療方法的研究[21]。

本實(shí)驗(yàn)潰瘍模型的建立選用化學(xué)灼燒法，與其他方法相比具有試劑便取、方法簡(jiǎn)單、結(jié)果可控、操作安全的優(yōu)點(diǎn)，且有采用NaOH和冰醋酸成功建立口腔潰瘍的文獻(xiàn)報(bào)道[8-11,18]。模型動(dòng)物選用SD大鼠較兔更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，體型便于控制。在化學(xué)試劑的選用上，本實(shí)驗(yàn)表明冰醋酸較為溫和，處理SD大鼠形成的口腔潰瘍模型基本符合人類口腔潰瘍的臨床特征及病理特征，而NaOH處理后黏膜出血嚴(yán)重，傷害較大，且愈后形成瘢痕樣組織較多，異于正常潰瘍的愈合轉(zhuǎn)歸，可能是由于創(chuàng)傷過(guò)大而出現(xiàn)較重的創(chuàng)傷反應(yīng)。我們的結(jié)果還證實(shí)40%濃度冰醋酸及60%濃度冰醋酸組潰瘍模型欠規(guī)則，面積計(jì)算較為困難，不適合用于潰瘍的治療方法等療效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)研究，而50%濃度是相對(duì)理想的濃度，形成的潰瘍更規(guī)則，便于比較。40%濃度冰醋酸組潰瘍形狀不規(guī)則，可能與其濃度較低，受唾液的影響較大，對(duì)組織損傷較小有關(guān)；而60%濃度冰醋酸可能由于其濃度較高，處理過(guò)程中濾紙片上的冰醋酸更易擴(kuò)散到周圍黏膜組織，周圍組織被灼傷形成潰瘍而導(dǎo)致邊界不規(guī)則。在處理部位上，本實(shí)驗(yàn)選用了靠近牙齦的角化黏膜和其下方的非角化黏膜組成的下切牙牙槽骨唇側(cè)黏膜和由非角化黏膜組成頰黏膜。雖然人類口腔潰瘍多發(fā)生于頰、舌等非角化黏膜上，但也可見(jiàn)于牙齦等角化黏膜上，其臨床表現(xiàn)和病理表現(xiàn)相似，且發(fā)生于人類口腔不同部位潰瘍的治療方法并無(wú)太大差異，因此下切牙牙槽骨唇側(cè)黏膜潰瘍模型也可用于潰瘍治療方法的研究。且下切牙牙槽骨唇側(cè)黏膜組相比于頰黏膜組具有潰瘍形狀規(guī)則，視野暴露佳，方便操作，視覺(jué)誤差最小等優(yōu)點(diǎn)，便于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)測(cè)量潰瘍面積、獲取影像資料等操作。而頰黏膜形成的潰瘍不規(guī)則可能與頰黏膜容易變形，暴露不佳等影響實(shí)驗(yàn)操作有關(guān)。

此外我們發(fā)現(xiàn)SD大鼠潰瘍區(qū)愈合后短期再次使用冰醋酸處理，潰瘍形成率極低，且形成的潰瘍形態(tài)不規(guī)則，面積小，愈合時(shí)間短，肉眼可見(jiàn)有瘢痕樣組織出現(xiàn)，原因不清，可能是由于潰瘍愈合后短時(shí)間內(nèi)該區(qū)形成的新組織耐受性較高，提示同一區(qū)域短期內(nèi)不適合連續(xù)二次建立潰瘍模型。

當(dāng)然，化學(xué)燒灼造成的黏膜潰瘍與臨床復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的形成機(jī)制不同，該模型不適合用于復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍的機(jī)制研究，但形成的潰瘍表現(xiàn)類似，可用于治療效果的評(píng)價(jià)?？傊?，本實(shí)驗(yàn)表明化學(xué)灼燒法建立口腔潰瘍與試劑、部位及處理次數(shù)相關(guān)，潰瘍模型的穩(wěn)定性與試劑、部位及冰醋酸的濃度有關(guān)聯(lián)，冰醋酸的濃度過(guò)高或過(guò)低均不能獲得穩(wěn)定的潰瘍模型。SD大鼠下切牙牙槽骨唇側(cè)黏膜處采用50%濃度冰醋酸處理30 s的方法獲得的口腔潰瘍，具有形狀規(guī)則、愈合時(shí)間穩(wěn)定及方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作等優(yōu)點(diǎn)，是用于評(píng)價(jià)口腔潰瘍治療效果的理想模型方案。