模擬艦船火災(zāi)煙霧吸入致急性肺損傷大鼠模型的建立與評(píng)估

宋立成，程浩，奐劍波，陳麗娜，韓志海

(中國(guó)人民解放軍海軍總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100048)

煙霧吸入性肺損傷是戰(zhàn)時(shí)或平時(shí)火災(zāi)中常見(jiàn)的致命性的損傷因素，是燒傷病人的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，特別是在表面燒傷面積大于50%的病人中，其預(yù)計(jì)死亡率比不伴有吸入性損傷的病人高20%，如果繼發(fā)肺炎，死亡率超過(guò)60%[1]。雖然近年來(lái)針對(duì)煙霧吸入性損傷的機(jī)制研究及治療取得許多進(jìn)展，但是由于艦船火災(zāi)現(xiàn)場(chǎng)的復(fù)雜環(huán)境、不同類型材料燃燒形成的不同種類的煙霧成分、合并傷情的區(qū)別及煙霧吸入時(shí)間的長(zhǎng)短等因素的差別，需要進(jìn)一步研究探討，特別是隨著艙室內(nèi)建筑材料的日益豐富，燃燒產(chǎn)生的煙霧成分多達(dá)上百種，單純木材、棉花等模擬的煙霧損傷模型已難以模擬真實(shí)世界的傷情特點(diǎn)。既往的煙霧吸入導(dǎo)致肺損傷模型中，研究者曾采用多種類型動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，包括成年犬、綿羊、豬、兔、嚙齒類動(dòng)物等[2-3]，大鼠具有操作簡(jiǎn)便、易獲取、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，可以模擬大批煙霧吸入性肺損傷傷情特點(diǎn)的分析，是目前各種類型肺損傷中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[4-5]。本研究構(gòu)建等比例模擬艦船艙室，以成年SD大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以艦船火災(zāi)常見(jiàn)的7種復(fù)合材料作為燃燒物，模擬真實(shí)世界艦船火災(zāi)發(fā)生后煙霧吸入情況，通過(guò)建立穩(wěn)定的恒溫?zé)熿F吸入性肺損傷模型，為進(jìn)一步研究室內(nèi)火災(zāi)的真實(shí)情況奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

PierceTMBCA 蛋白檢測(cè)試劑盒(Thermo，23225)，抗-IL6 抗體(Abcam，ab9324)，抗-IL10 抗體(Abcam，ab9969)，抗-TNF α抗體 (Abcam，ab6671), 抗-Myeloperoxidase抗體(Abcam，ab208670), 抗-p38抗體[M138] (Abcam，ab31828), 抗-Erk1/2抗體(Abcam，ab50011), 抗-NF-kB p65抗體(Abcam，ab16502), 山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor? 568) (Abcam，ab175471)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

電泳儀(DYY-5D型，中國(guó))，離心機(jī)(Thermo Pico17，美國(guó))，電熱恒溫干燥箱(上海上邁電子儀器有限公司，中國(guó))，恒溫水浴鍋(XMTD-7000型，中國(guó))，水平空氣搖床(北京市沃德生物醫(yī)學(xué)儀器公司，中國(guó))，倒置熒光顯微鏡(Olympus IX73, 日本)，血?dú)夥治鰞x (ABL800 Radiometer, 丹麥)，全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼庫(kù)爾特AU680，美國(guó))，可燃有毒有害氣體探測(cè)儀(瑞凱雷PNT400，中國(guó))。

④ 按照以上方法，7×0.5表示怎樣的含義？7×0.1，15×0.1呢？此環(huán)節(jié)設(shè)計(jì)的目的是讓學(xué)生學(xué)會(huì)用乘法分配律的性質(zhì)將小數(shù)運(yùn)算變形，進(jìn)而去理解小數(shù)乘法多方面的意義.同時(shí)習(xí)得此方法，將其運(yùn)用到任意的小數(shù)乘法.

1.2 方法

1.2.1 自制煙霧產(chǎn)生裝置

(1)裝置的組成及原理：本次實(shí)驗(yàn)采用自行研制的密封性良好的產(chǎn)煙裝置和實(shí)驗(yàn)裝置一體化的集成系統(tǒng)，主要組成部分為煙霧生成單元(不銹鋼材質(zhì)，內(nèi)含1個(gè)控溫電磁爐、4個(gè)排風(fēng)扇、1個(gè)溫度檢測(cè)器，一個(gè)煙霧成分檢測(cè)器)，動(dòng)物染毒單元(艦船艙室模擬箱，不銹鋼材質(zhì)，包含一個(gè)水循環(huán)冷卻系統(tǒng)，可控制箱內(nèi)溫度20～25℃，1個(gè)溫度檢測(cè)器，一個(gè)煙霧成分檢測(cè)器，單側(cè)箱體為玻璃材質(zhì)，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)箱內(nèi)動(dòng)物活動(dòng)狀態(tài))。兩個(gè)單元通過(guò)聯(lián)通管道連接。

(2)煙霧吸入方案：經(jīng)本課題組現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查研究，目前艦船內(nèi)裝常見(jiàn)的易燃材料有：聚雙馬泡沫材料、發(fā)泡橡塑絕熱制品、阻燃白膠、阻尼材料、無(wú)鹵電纜、硅丙乳膠漆、裝飾板這7種。將發(fā)煙材料研磨成粉等比例混合(各20 g)后，置于電磁爐上方的托盤(pán)中，控制電磁爐溫度為300℃，待產(chǎn)煙箱中煙霧充盈后用排風(fēng)機(jī)將煙霧通過(guò)管道排入試驗(yàn)箱中，同時(shí)用煙氣檢測(cè)儀檢測(cè)箱內(nèi)氣體的濃度，各種氣體控制范圍為：CO 400～550 ppm，H2S 10～15 ppm,O218% ～20%，上述成分的含量通過(guò)控制排風(fēng)機(jī)進(jìn)行維持。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)

(1)不同煙霧吸入時(shí)間組：80只大鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組20只，煙霧吸入15 min組20只，煙霧吸入30 min組20只，煙霧吸入50 min組20只，觀察7 d，記錄每組的生存情況，計(jì)算生存曲線。

(2)穩(wěn)定煙霧吸入時(shí)間組：以煙霧吸入30 min為實(shí)驗(yàn)組，120只大鼠于煙霧吸入后根據(jù)存活時(shí)間(T=1，6，24 h)隨機(jī)分為3組，每組各30只，對(duì)照組大鼠30只，在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，用戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉后進(jìn)行標(biāo)本采集。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)

抽取動(dòng)脈血?dú)夂蟮拇笫蠓叛滤?，從大鼠胸正中線開(kāi)胸后分離并夾閉氣管，剝離大血管，完整取出全肺，結(jié)扎右主支氣管，取長(zhǎng)4 cm、22 g硅膠管行氣管插管灌注冷無(wú)菌生理鹽水行左肺灌洗，1 mL注入，緩慢回抽3次，回收0.4～0.6 mL，其中抽取10 μL滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余灌洗液先以1500 r/min離心3 min，沉淀進(jìn)行細(xì)胞分類，上清液再次以3000 r/min 4℃離心10 min。BALF中的蛋白質(zhì)含量通過(guò)微量BCA蛋白試劑盒測(cè)定。

1.3.2 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western blot，WB)檢測(cè)

將液氮中的肺組織取出后進(jìn)行低溫下研磨，使用RIPA 裂解肺組織研磨液，冰上孵育30 min后，收集裂解細(xì)胞的液體， 4℃離10 min，留取上清，蛋白定量至5 g/L，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，封閉液孵育2 h后，加入MPO單抗、IL-6單抗、IL-10單抗、TNF-α單抗、ERK 1/2單抗、P38單抗或P65單抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜，與二抗室溫孵育1 h，3，3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.3.3 免疫熒光

液氮中的肺組織經(jīng)冰凍切片后，用5%的胎牛血清封閉，分別用ERK 1/2、P38、P65作為一抗染色1 h；然后用山羊抗鼠IgG (H+L) Alexa Fluor 568染色1 h；細(xì)胞核用DAPI進(jìn)行染色；用熒光顯微鏡捕捉圖像。

1.3.4 血?dú)夥治?/p>

將大鼠麻醉后，暴露腹主動(dòng)脈用血?dú)忉樳M(jìn)行采血，檢測(cè)指標(biāo)為PH、氧分壓、二氧化碳分壓、碳氧血紅蛋白、乳酸。

1.3.5 病理?yè)p傷評(píng)估

對(duì)右肺主支氣管進(jìn)行結(jié)扎后，收集右肺下葉于4%的甲醛中，48 h后進(jìn)行石蠟包埋，然后進(jìn)行切片，厚度為6 μm，脫蠟后進(jìn)行蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，H&E)染色，通過(guò)單盲法由兩名病理科醫(yī)生光鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。我們采用了美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(American Thoracic Society，ATS)制定的肺損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，參數(shù)包括肺泡內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺泡間隔內(nèi)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、透明膜形成與否、肺泡腔內(nèi)是否殘存蛋白質(zhì)、肺泡間隔的厚度。每個(gè)病理醫(yī)生對(duì)每張切片至少選取20個(gè)隨機(jī)高倍視野(400× total magnification) 進(jìn)行評(píng)分。

1.3.6 肝腎功能評(píng)估

對(duì)照組和煙霧吸入后1，6，24 h的各組大鼠通過(guò)腹主動(dòng)脈收集全血1 mL至檸檬酸鈉抗凝管中(血液與抗凝劑比例為9∶1)。全血于4℃中離心10 min(3000 r/min)，收集血漿，通過(guò)全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、總膽紅素、白蛋白、球蛋白、血肌酐、尿素氮。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同煙霧吸入時(shí)間對(duì)生存率的影響

煙霧吸入15 min(A組)、30 min(B組)、50 min(C組)各20只大鼠，觀察時(shí)間段為48 h。A組總體生存率為84.21%；B組總體生存率為25%，其中煙霧吸入后的前6 h內(nèi)生存率變化最顯著(43.75%)；C組現(xiàn)場(chǎng)死亡17只，煙霧吸入后1 h死亡2只，3 h死亡一只，總體生存率為0(圖1)。

圖1 不同煙霧吸入時(shí)間對(duì)24 h生存率的影響Figure 1 Survival rate for different smoke inhalation times at 24 h recovery

2.2 動(dòng)脈血?dú)夥治龅淖兓?/h3>

對(duì)煙霧吸入30 min組進(jìn)行進(jìn)一步分析，煙霧吸入后的1 h，氧分壓下降，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)，6 h氧分壓繼續(xù)下降，24 h逐漸回升；碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin，COHB)于煙霧吸入后立即升高，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)，6 h已出現(xiàn)顯著下降，24 h時(shí)與對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性。二氧化碳分壓的變化與氧分壓變化的趨勢(shì)相同。動(dòng)脈血乳酸于煙霧吸入后1 h內(nèi)顯著增高，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)，在6 h及24 h基本恢復(fù)正常，與對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。(表1)

表1 煙霧吸入后不同時(shí)間組血?dú)獾淖兓闆rTable 1 Changes in blood gas parameters after smoke n=10)

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05.

2.3 外周血白細(xì)胞變化

外周血白細(xì)胞于煙霧吸入后1 h內(nèi)較對(duì)照組出現(xiàn)顯著升高(P< 0.01)，于6 h達(dá)到高峰，24 h逐漸下降，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)；中性粒細(xì)胞于煙霧吸入后第6 h達(dá)到最高值, 與對(duì)照組相比P< 0.01，此時(shí)中性粒細(xì)胞比例也達(dá)到最高值。(圖2)

注：A. 煙霧吸入后外周血白細(xì)胞(WBC)、中性粒細(xì)胞(neu)、淋巴細(xì)胞(lym)、單核細(xì)胞(mon)計(jì)數(shù)的變化情況；B. 煙霧吸入后中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞比例的變化情況。與對(duì)照組相比，**P< 0.01，*P< 0.05。圖2 煙霧吸入后外周血白細(xì)胞數(shù)量及比例變化情況Note. A. Counts of circulating white blood cells, neutrophil, lymphocytes, and monocytes after smoke inhalation. B. Percentages of circulating neutrophils, lymphocytes, and monocytes after smoke inhalation. **P < 0.01, *P < 0.05, compared with the control group.Figure 2 Changes in cell counts and proportion of peripheral blood leukocytes after smoke inhalation

2.4 BALF中白細(xì)胞及蛋白含量變化

通過(guò)測(cè)定BALF中白細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類和蛋白含量來(lái)評(píng)估肺損傷嚴(yán)重程度。結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，煙霧吸入后BALF中白細(xì)胞總數(shù)顯著增高，煙霧吸入后不同時(shí)間組之間差異無(wú)顯著性；白細(xì)胞分類結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞分類以巨噬細(xì)胞為主，而煙霧吸入后，隨著時(shí)間變化，巨噬細(xì)胞比例先降低再升高；中性粒細(xì)胞于煙霧吸入6 h后其比例達(dá)到最高，此后逐漸降低。(圖3)

注：A. 煙霧吸入后BALF內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)的變化情況；B. 煙霧吸入后BALF內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比例的變化情況。與對(duì)照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。圖3 煙霧吸入后BALF內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)及比例的變化情況Note. A. White blood cell counts in BALF after smoke inhalation. B. Percentages of neutrophils, lymphocytes, and macrophages in BALF after smoke inhalation. **P < 0.01, *P < 0.05， compared with the control group.Figure 3 Changes in cell counts and leukocyte ratio in the BALF after smoke inhalation

2.5 煙霧吸入后組織病理學(xué)變化

煙霧吸入后，BALF內(nèi)蛋白含量顯著升高；肺組織病理切片提示煙霧吸入后1 h內(nèi)出現(xiàn)彌漫性肺泡內(nèi)水腫，伴有巨噬細(xì)胞廣泛聚集；6 h肺泡內(nèi)出血明顯加重，中性粒細(xì)胞逐漸增加；24 h可見(jiàn)肺泡內(nèi)水腫液逐漸減少，肺泡間隔明顯增厚，中性粒細(xì)胞比例下降，巨噬細(xì)胞比例開(kāi)始升高。肺損傷評(píng)分顯示，煙霧吸入后1 h內(nèi)出現(xiàn)顯著肺損傷，一直持續(xù)至24 h，與肺損傷最嚴(yán)重的第6 h相比，差異有顯著性(P值均小于0.01)。(圖4、5)

注：A. 煙霧吸入后BALF內(nèi)蛋白濃度的變化情況；B. 煙霧吸入后肺損傷評(píng)分的變化情況。與對(duì)照組相比，**P< 0.01。圖4 煙霧吸入后BALF內(nèi)蛋白濃度及肺損傷評(píng)分的變化Note. A. Protein concentrations in BALF after smoke inhalation. B. Lung injury scores after smoke inhalation. **P < 0.01 compared with the control group.Figure 4 Changes in protein concentrations in the BALF and lung injury scores after smoke inhalation

注：A-D分別為對(duì)照組肺組織、煙霧吸入后1、6、24 h肺組織的H&E染色。圖5 煙霧吸入后肺組織病理學(xué)變化(×400)Note. A-D. The groups of control, and 1, 6, and 24 h post smoke inhalation.HE stainingFigure 5 Histopathology of the lung tissues after smoke inhalation (×400)

圖6 免疫熒光顯示煙霧吸入后通路信號(hào)分子P42/44 MAPK、P38 MAPK、NF-κB P65隨時(shí)間變化表達(dá)情況Figure 6 Expression of P42/44 Mitogen-activated protein kinase (MAPK), P38 MAPK, and nuclear factor -kappaB (NF-κB) P65 after smoke inhalation by immunofluorescence assay

2.6 三條主要信號(hào)通路蛋白的變化

western blot及免疫熒光結(jié)果顯示，煙霧吸入后，ERK、P65、P38在肺泡I型、II型上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等部位均有廣泛的表達(dá)，第6 h表達(dá)最顯著，第24 h后表達(dá)量逐漸降低。(圖6、7)

2.7 炎癥因子表達(dá)的變化

Western blot結(jié)果顯示，煙霧吸入后1 h即可出現(xiàn)IL-6的升高，IL-10、TNF-α及MPO在6 h出現(xiàn)顯著升高，各炎癥因子均在6 h升高最為顯著，24 h略有下降。(圖7)

2.8 肝腎功能變化

煙霧吸入后第1 h，谷丙轉(zhuǎn)氨酶出現(xiàn)一過(guò)性升高，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P< 0.05)，第6 h及第24 h逐漸恢復(fù)，與對(duì)照組相比，差異無(wú)顯著性；總膽紅素在對(duì)照組和煙霧吸入后各組之間無(wú)顯著性差異；總蛋白在煙霧吸入后1 h顯著增高，第6 h稍降低，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P< 0.01)；白蛋白及球蛋白的變化與總蛋白呈相同的趨勢(shì)；腎功能在煙霧吸入前后均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(表2，3)

3 討論

無(wú)論是森林火災(zāi)、室內(nèi)火災(zāi)煙霧還是其他類型的煙霧，其成分是復(fù)雜多樣的[6-8]，致傷因素也各不相同。艦船火災(zāi)是威脅艦艇及船員生命力的極其重要因素，而由于存在空間密閉、狹小，可燃物多，毒性大等現(xiàn)實(shí)情況，肺損傷的嚴(yán)重程度及病理生理變化需要進(jìn)一步探討。

煙霧吸入后產(chǎn)生強(qiáng)烈的復(fù)雜的炎癥反應(yīng)，局部表現(xiàn)包括支氣管、血管痙攣、支氣管粘液溢、肺泡淹溺、支氣管滲出、支氣管內(nèi)鑄型、通氣血流失衡。氣管內(nèi)大量的液體滲出造成有效循環(huán)量的降低[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，伴有吸入性損傷的燒傷病人，所需的液體復(fù)蘇量較不伴有吸入性損傷的病人顯著增高[10]。

圖7 煙霧吸入后通路信號(hào)分子P42/44 MAPK、P38 MAPK、NF-κB P65及炎癥因子IL-6、IL-10、MPO、TNF-α隨時(shí)間變化表達(dá)情況Figure 7 Expression of interleukin-6(IL-6), IL-10, TNF-α, P42/44 MAPK, P38 MAPK, Myeloperoxidase (MPO), and NF-κB P65 after smoke inhalation detected by Western blot

表2 煙霧吸入后不同時(shí)間組肝功能的變化情況Table 2 Changes in liver function after smoke n=10)

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05.

Note. TBil, total bilirubin；ALT, alanine aminotransferase；TP, total protein；ALB，albumin, GLB, globulin. Compared with the control group，*P< 0.05.

表3 煙霧吸入后不同時(shí)間組腎功能的變化情況Table 3 Changes in renal function

注：與對(duì)照組比較，P>0.05.

Note. CRE, creatinine; BUN, blood urea nitrogen. Compared with the control group，P>0.05.

我們通過(guò)對(duì)不同煙霧吸入時(shí)間的比較發(fā)現(xiàn)，短期煙霧吸入與長(zhǎng)期煙霧吸入生存率存在顯著差別，提示煙霧吸入后應(yīng)盡早脫離煙霧環(huán)境能顯著降低死亡率。對(duì)煙霧吸入后的早期死亡大鼠(6 h內(nèi)死亡)進(jìn)行解剖，結(jié)果提示，早期死亡最重要的因素是大量水腫液溢出導(dǎo)致的大氣道阻塞，以及肺泡的淹溺使大鼠窒息死亡。因此，如何在早期通過(guò)藥物或機(jī)械手段有效緩解煙霧吸入急性期的肺水腫或通暢氣道，避免大量水腫液淹溺肺泡及阻塞氣道是急性期治療的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages，AM)是肺組織重要組成部分，外源性刺激物及病原體可以引起AM表型和功能的改變[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入初期巨噬細(xì)胞仍有較高比例，隨著氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的發(fā)展，中性粒細(xì)胞向肺泡內(nèi)的分泌逐漸增多。煙霧吸入后存在顯著的巨噬細(xì)胞為優(yōu)勢(shì)的BALF向中性粒細(xì)胞為優(yōu)勢(shì)的BALF的轉(zhuǎn)變，可以導(dǎo)致后期的免疫失衡、感染蔓延[13]。但后期由于肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡以及間質(zhì)內(nèi)肺泡巨噬細(xì)胞的補(bǔ)充，導(dǎo)致隨時(shí)間發(fā)展呈先降低后升高的趨勢(shì)，其中巨噬細(xì)胞表型變化、吞噬及分泌功能的改變是我們下一步建立在此模型基礎(chǔ)上的研究的重點(diǎn)。對(duì)M1/M2平衡在肺部炎癥性疾病中具體機(jī)制的研究，有利于臨床發(fā)現(xiàn)潛在的藥物作用靶點(diǎn)。

對(duì)肺內(nèi)炎癥細(xì)胞及肺損傷評(píng)分等分析發(fā)現(xiàn)本模型損傷最嚴(yán)重的時(shí)間點(diǎn)是煙霧吸入后第6 h，故本模型總體采用煙霧吸入后1、6、24 h作為急性期研究的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，同時(shí)對(duì)煙霧吸入導(dǎo)致體內(nèi)多種炎性細(xì)胞激活后釋放出的TNF-a、IL-10、IL-6、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extra-cellular signal-regulated kinases, ERKs)、P38及髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)等在內(nèi)的多種炎性介質(zhì)及信號(hào)通路進(jìn)行研究[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)上述通路在煙霧吸入后顯著表達(dá)，而這些通路在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，并且與M1相關(guān)的IL-6及與M2相關(guān)的IL-10也存在過(guò)表達(dá)的現(xiàn)象，這些均提示巨噬細(xì)胞的活化參與肺損傷調(diào)節(jié)的過(guò)程。具體機(jī)制是我們下一步的研究重點(diǎn)。

MPO主要由活化的中性粒細(xì)胞分泌，而且是中性粒細(xì)胞中含量最高的蛋白[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，煙霧吸入后肺組織中MPO出現(xiàn)明顯的升高，并且與BALF中中性粒細(xì)胞變化趨勢(shì)相同，外周血中性粒細(xì)胞于煙霧吸入后也呈現(xiàn)出顯著升高的趨勢(shì)，這與其他煙霧吸入模型中中性粒細(xì)胞大量聚集的趨勢(shì)相同[17]，因此，如何降低中性粒細(xì)胞聚集造成的損傷是煙霧吸入性肺損傷治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

本次實(shí)驗(yàn)的另一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)是煙霧吸入急性期不伴有實(shí)質(zhì)性的腎功能損害。肌酐與尿素氮檢測(cè)提示煙霧吸入后24 h內(nèi)與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，而肝功能檢測(cè)提示，總蛋白、白蛋白、球蛋白及ALT于煙霧吸入后1 h顯著升高，此后逐漸降低并恢復(fù)正常，總膽紅素?zé)o顯著改變，考慮到煙霧吸入后出現(xiàn)嚴(yán)重肺水腫，大量循環(huán)中的液體滲入肺實(shí)質(zhì)中[18]，所以上述物質(zhì)急性期的升高很可能與循環(huán)血量迅速降低導(dǎo)致的血液濃縮有關(guān)，隨著大鼠自行進(jìn)食、進(jìn)水，及肺水腫的自行吸收，上述指標(biāo)可很快恢復(fù)，故本研究認(rèn)為煙霧吸入急性期并不引發(fā)肝腎功能的損害。

本模型存在燃燒成分、染毒空間等方面的不同，對(duì)動(dòng)物造成的損傷接近真實(shí)世界艦艇火災(zāi)現(xiàn)場(chǎng)情況，并且本模型重復(fù)性好，監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)全面，可以作為煙霧吸入肺損傷機(jī)制研究的平臺(tái)。