溶菌酶1在小鼠超數(shù)排卵前后孵化及休眠囊胚中差異表達的研究

盧文瑾，郭勇，胡新宇，張寅屏，黃啟震，劉迪，王力紅，田鳳，盛熙暉，齊曉龍，邢凱，倪和民，王相國*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206； 2. 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院生殖調(diào)控與生殖健康研究福建省高校重點實驗室，廈門 361102； 3. 中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)研究所，廣州 510030； 4. 北京市昌平區(qū)畜牧水產(chǎn)推廣站，北京 102200)

哺乳動物胚胎的著床以及發(fā)育過程一直是生殖領(lǐng)域研究的熱點，胚胎在發(fā)育過程中受多種激素、生長因子以及各種酶的影響。早在20世紀(jì)60年代，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)，哺乳動物胚胎發(fā)育到囊胚階段存在不立即著床的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象使動物的交配和妊娠的時間得以延長，從而最大限度地保證后代在適宜的環(huán)境里出生并成長[1]。胚胎發(fā)育到胚泡階段時暫時進入休眠狀態(tài)而并不立即著床的現(xiàn)象稱為延遲著床，處于延遲著床狀態(tài)的胚胎又稱休眠囊胚，此時胚胎在子宮中代謝速度變緩，停留時間延長。大鼠、小鼠、雪貂以及有袋動物均存在延遲著床現(xiàn)象。此外，無脊椎動物、植物、昆蟲也存在延遲著床現(xiàn)象[2]。研究者在蝙蝠中發(fā)現(xiàn)，雖然群體中母蝙蝠交配時間不盡相同，但群體中大部分雌性蝙蝠能保證同時分娩，讓幼崽在同一時間出生，這種同步化現(xiàn)象能擴大幼崽種群，保證種群的存活率，大大減少幼崽的死亡率，對于種群來說是進化優(yōu)勢的體現(xiàn)[3]。

溶菌酶1(lysozyme 1，LYZ1)是存在于哺乳動物體液中的一種小分子堿性酶，廣泛存在于哺乳動物的血液以及肝中，眼淚、尿液、唾液和乳汁中也有分布；在黏膜表面，其濃度可達到1 mg/mL；在巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等專業(yè)吞噬細(xì)胞中也有分布[4]。溶菌酶家族中所有成員都具有水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的能力，并且總體結(jié)構(gòu)相似。LYZ1是體液免疫中最為關(guān)鍵的第一道防御系統(tǒng)中的重要組成成分，對革蘭陽性菌以及部分革蘭陰性菌都有殺滅作用。細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖，是N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交織形成的多糖支架，他們之間依靠β-1,4-糖苷鍵相互交聯(lián)，N-乙酰胞壁酸分子上接四肽側(cè)鏈，肽鏈再相互連結(jié)，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成為支撐細(xì)菌細(xì)胞的基礎(chǔ)。LYZ1專一作用于多糖支架之間的β-1,4-糖苷鍵，細(xì)菌細(xì)胞壁將失去支撐作用，從而使細(xì)菌溶解，人及哺乳動物不含細(xì)胞壁，故溶菌酶對人體無毒害作用[5]。目前溶菌酶已被運用于多種研究領(lǐng)域，在食品行業(yè)可用做防腐劑，或去除酒中的沉淀[6]；在醫(yī)療行業(yè)常與其他抗菌藥物一起使用治療細(xì)菌感染；由于溶菌酶只對細(xì)胞壁有破壞作用，在生物工程行業(yè)上也常用于原生質(zhì)體的制備。但在生殖方面的功能少見報道，研究證實，處于延遲著床狀態(tài)的囊胚不含有透明帶，比正常孵化囊胚具有更強的抗逆性。本實驗室前期研究結(jié)果證明：經(jīng)過程序化冷凍的小鼠休眠囊胚解凍后存活率顯著高于正常孵化囊胚，顯示經(jīng)歷冷凍過程的休眠囊胚具有更好的抗凍潛力，而實驗室前期基因表達譜[7]結(jié)果發(fā)現(xiàn)：程序化冷凍處理前、后休眠胚胎中Apol8[8]基因在表達水平顯著差異，RhoA[9]、Hba-α[10]、C3[11]等基因與正常孵化囊胚相比也有差異。與此類似，前人在冷凍、超排以及休眠三個因素對小鼠胚胎差異表達基因進行分析，發(fā)現(xiàn)LYZ1基因在超排前后和休眠胚胎表達有明顯差異。

因此，研究LYZ1及其家族在生殖領(lǐng)域的作用潛力能進一步為闡明胚胎發(fā)育過程提供新的依據(jù)。本試驗通過研究超排和休眠因素對LYZ1蛋白在小鼠休眠囊胚與正常孵化囊胚中分布的影響，分析休眠囊胚具有更強發(fā)育潛力的原因，挖掘LYZ1基因在小鼠囊胚階段的潛在作用，探索哺乳動物胚胎著床過程中新的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級的性成熟ICR品系雌性小鼠50只，平均體重25～30 g，8～11周齡；SPF級的性成熟ICR品系雄性小鼠25只，平均體重35～40 g，9～12周齡，均來源于北京維通利華動物科技有限公司【SCXK(京)2014-0008】，試驗操作在北京農(nóng)學(xué)院屏障動物實驗室內(nèi)進行【SYXK(京)2015-0004】。

1.1.2 實驗試劑

芝麻油、孕酮購自Sigma，美國；兔抗LYZ1單克隆抗體，購自Abcam，貨號：ab108508；抗兔LYZ1抗體，購自Cell Signaling，貨號：7074P2；PMSG、hCG購自寧波三生有限公司；TBST (pH8.0，10 ×)，購自康為世紀(jì)，貨號：CW0043S；PVDF膜，購自索萊寶。

1.1.3 實驗儀器

光學(xué)顯微鏡，江南儀器廠；電子天平，Sartorius，BS124S，美國；顯微鏡BX51，Olympus，日本；蓋玻片、載玻片，江蘇世泰實驗器材有限公司；低溫高速離心機，Beckman Allegra Centrifuge 64R，美國；掌心離心機，Bratt，美國；超凈工作臺，上海智城分析儀器，ZHJH-1112B；激光共聚焦顯微鏡，Olympus，日本；脫色搖床，Qilinbeier TS-1000；凝膠成像儀，BIO-RAD，美國。

1.2 實驗方法

實驗分為4組：A為不超排-孵化；B為超排-孵化；C為不超排-休眠；D為超排-休眠。

1.2.1 超排處理

選擇陰門潮紅、處于發(fā)情期的雌鼠，于晚間18:00腹腔注射PMSG 0.1 mL(10 IU/只)，間隔46～48 h后，腹腔注射hCG 0.1 mL(10 IU/只)，注射后立即合籠(公母比為1∶1)，次日上午08:00點之前檢查陰道栓，檢出陰道栓雌鼠用于獲取超排孵化囊胚和超排休眠胚胎，將此天記為胎齡第1天(day 1)。

1.2.2 孵化囊胚的獲取

于見栓第5天(day 5)上午08:00頸椎脫臼法處死見栓雌鼠，摘取母鼠雙側(cè)子宮，除去系膜，使用PBS工作液多次沖洗雙側(cè)子宮角收集囊胚，經(jīng)PBS洗滌3次，儲存在-80℃保存?zhèn)溆?。見栓?天(day 4)上午08:00麻醉見栓雌鼠，將雌鼠雙側(cè)卵巢從背部摘除，保留輸卵管并縫合，此后，每天早晨08:00于小鼠頸部皮下注射0.1 mL孕酮(0.2 mg/mL)，連用3 d，在次日上午(day 8)08:00沖洗雙側(cè)子宮收集休眠胚胎?；厥盏呐咛ソ?jīng)PBS洗滌3次，儲存在-80℃冰箱備用。

1.2.3 休眠胚胎的獲取

見栓第4天(day 4)上午08:00麻醉見栓雌鼠，摘除雌鼠雙側(cè)卵巢，小心操作以保留輸卵管，隨后連續(xù)3 d早晨08:00在小鼠頸部皮下濃度為0.1 mL孕酮(0.2 mg/mL)，次日上午(day 8)08:00用PBS工作液沖洗雙側(cè)子宮收集休眠胚胎?；厥盏呐咛ソ?jīng)PBS洗滌3次，儲存在-80℃冰箱備用。

1.2.4 共聚焦顯微鏡術(shù)檢測LYZ1蛋白在各組胚胎上的分布

①固定：胚胎于PBS中充分洗滌，此后，室溫條件下置于4%多聚甲醛中固定30 min；②清洗：固定后的胚胎置于0.1% BSA-PBS液滴中室溫清洗6次，每次8 min；③通透：清洗后的胚胎室溫條件下置于2.5% Tween 20-PBS中通透5 min；④清洗：用0.1% BSA-PBS洗滌6次，每次8 min；⑤LYZ1抗體孵育：4℃條件下，胚胎置于LYZ1抗體(1∶2000)中過夜孵育；⑥清洗：先后采用0.2% Triton X-100，0.1% BSA-PBS各清洗6 次，每次8 min；⑦二抗孵育：37℃條件下，胚胎在置于稀釋好的抗LYZ1抗體熒光二抗(1∶1500)中避光孵育1.5 h；⑧清洗：先后采用0.2% Triton X-100，0.1% BSA-PBS各清洗6次，每次8 min；⑨染核：將胚胎置于PI染核液中染核5 min，再將胚胎置于0.1% BSA-PBS液滴中洗去染核液，重復(fù)3次，每次10 min；⑩壓片：洗凈后將胚胎置于在載玻片中央，用少量凡士林支撐起蓋玻片四角，在輕輕蓋上蓋玻片，緩慢操作，以免將胚胎擠壓變形；封片：蓋玻片四周用透明快干指甲油封住，在暗室條件下，盡快放入Confocal顯微鏡中成像。

1.2.5 LYZ1蛋白在各組胚胎間差異表達變化

①從-80℃冰箱中將凍存有胚胎的離心管取出，置于冰上，每100枚胚胎中加入10 μL裂解液，短時渦旋震蕩后，冰上孵育30 min，充分使其裂解；②12 000 r/min，4℃離心5 min，獲取上清液，等體積加入2× protein loading buffer；③沸水浴5 min，待冷卻備用；④配制濃度為12% SDS-PAGE分離膠，15% SDS-PAGE濃縮膠，室溫靜止，待凝膠凝聚后上樣，電泳1.5 h，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上；⑤室溫條件下，將PVDF膜完全浸入封閉液中，搖床封閉2 h；⑥4oC條件下，將PVDF膜置于LYZ1抗體(1∶1500)中過夜孵育；⑦用1×TBST洗滌未結(jié)合到膜上的抗體，3次，10 min/次；⑧37oC條件下，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至抗LYZ1抗體的熒光二抗(1∶1000)中搖床孵育1.5 h；⑨孵育后用1×TBST洗去未結(jié)合到PVDF膜上的熒光二抗；⑩ECL化學(xué)顯色后，凝膠成像儀成像。

1.2.6 圖像分析

用Image J軟件對凝膠成像系統(tǒng)所得圖片進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 孵化囊胚和休眠囊胚形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

孵化囊胚與休眠囊胚均已完全孵化，無透明帶(圖1a和1b)。從圖1中可以看出，兩種胚胎內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，邊緣清晰，可用于后續(xù)實驗。

圖1 小鼠休眠囊胚和孵化囊胚(bar=80 μm)Figure 1 Dormant and hatched mouse blastocysts (scale bar: 80 μm)

2.2 LYZ1蛋白在超數(shù)排卵前后孵化囊胚和休眠胚胎中的分布情況

LYZ1蛋白在超排前后的小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中的滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團中均有分布，但進行超數(shù)排卵過程后的休眠胚胎中的LYZ1蛋白明顯集中于內(nèi)細(xì)胞團中。見圖2。

2.3 LYZ1蛋白在超數(shù)排卵前后孵化囊胚和休眠胚胎中的差異表達分析

各組胚胎蛋白中看家基因β-actin表達穩(wěn)定，可用于后續(xù)實驗。用Image J軟件對凝膠成像系統(tǒng)圖片進行灰度值分析(見圖3a)。SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果如圖3b所示：超數(shù)排卵前后的小鼠正常孵化囊胚和休眠胚胎均能檢測到LYZ1蛋白的表達；且超排前后孵化囊胚(A組、B組)中LYZ1蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)；而超排-休眠囊胚(D組)LYZ1蛋白表達差異極顯著高于超排-孵化組(B組)和不超排-休眠的囊胚(C組)；同時休眠后的不超排囊胚(C組)與休眠前不超排孵化囊胚(A組)相比，差異無顯著性(P>0.05)。

注：A.不超排-孵化囊胚；B.超排-孵化囊胚；C.不超排-休眠囊胚；D.超排-休眠囊胚。綠色熒光表示LYZ1蛋白分布區(qū)域；紅色熒光表示細(xì)胞核。圖2 LYZ1蛋白在各組胚胎中分布情況Note: A) Hatched blastocysts, no superovulation; B) hatched blastocysts, superovulation; C) dormant blastocysts, no superovulation; D) dormant blastocysts, superovulation. Green fluorescence represents LYZ1 protein, and red fluorescence represents nuclei.Figure 2 Localization of LYZ1 protein in the embryos of each group

注：a. Western Blot 檢測LYZ1蛋白在各組胚胎間的相對表達量。b. Western Blot檢測LYZ1蛋白相對表達量分析圖: A.不超排-孵化囊胚；B.超排-孵化囊胚；C.不超排-休眠囊胚；D.不超排-休眠囊胚。上標(biāo)相同字母表示差異無顯著性(P>0.05)；不同字母表示差異有極顯著性(P<0.01)。圖3 LYZ1 蛋白在各組胚胎中差異表達分析Note: a. Western blot analysis of relative LYZ1 protein expression in the embryos; b. western blot analysis of relative LYZ1 expression in: A. hatched blastocysts, no superovulation; B. hatched blastocysts, superovulation; C. dormant blastocysts, no superovulation; and D.dormant blastocysts, superovulation. The same letterindicates no significance (P>0.05), while different letters indicate significance (P<0.01).Figure 3 Differential expression analysis of LYZ1 protein in the embryos of each group

3 討論

廣泛分布于體液中的溶菌酶作為免疫反應(yīng)中的重要成員參與了體內(nèi)多種免疫反應(yīng)，其水解細(xì)菌細(xì)胞壁的出色能力賦予了溶菌酶在非特異性免疫中的重要地位。它可改善和增強巨噬細(xì)胞吞噬消化功能，識別細(xì)菌脂多糖，滅殺細(xì)菌，增強機體抵抗力，由于水解作用的專一性，細(xì)菌很少對溶菌酶產(chǎn)生抗性。有報道顯示，經(jīng)放射線照射后的家兔血清中溶菌酶含量呈現(xiàn)下降趨勢[12]，因此血清中溶菌酶的含量或可作為衡量機體放射損傷的一項指標(biāo)來反映機體的損傷程度[13]。

與正常孵化囊胚相比，休眠囊胚細(xì)胞的代謝率低，與周圍環(huán)境的能量交換過程較少。滯育期間，胚胎細(xì)胞將進入一種維持自身較低的能量及代謝的狀態(tài)。正常孵化囊胚經(jīng)歷短暫“窗口期”就會著床，與母體子宮建立緊密聯(lián)系。而胚胎滯育期間，子宮不具有容受性，經(jīng)過微量雌激素刺激，胚胎才會開始著床，因此相比于能量代謝旺盛、與母體子宮發(fā)生信息與物質(zhì)聯(lián)結(jié)的正常孵化囊胚相比，休眠囊胚能更好的抵抗外界各種刺激。這與本研究發(fā)現(xiàn)的LYZ1蛋白在超排后休眠囊胚中的表達顯著高于孵化囊胚基本一致。

蛋白表達定位結(jié)果顯示，LYZ1蛋白在四組胚胎的內(nèi)細(xì)胞團中均有表達，而休眠囊胚中表達量明顯高于孵化囊胚，說明LYZ1蛋白在早期胚胎發(fā)育過程中具有重要作用，并且主要在內(nèi)細(xì)胞團內(nèi)發(fā)揮作用以維持細(xì)胞的穩(wěn)定狀態(tài)。蛋白相對表達水平結(jié)果研究表明，超排后休眠囊胚中LYZ1蛋白的表達極顯著上調(diào)，說明休眠囊胚與正常孵化囊胚在抵御不利環(huán)境下的機制有很大不同。LYZ1為保護胚胎免受外界影響而在此時上調(diào)，高水平LYZ1蛋白可能有利于胚胎在相對不利條件下存活，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。超排-孵化組的LYZ1蛋白在滋養(yǎng)層細(xì)胞中有分布，其余三組的LYZ1蛋白主要集中在內(nèi)細(xì)胞團中表達。而內(nèi)細(xì)胞團比滋養(yǎng)層細(xì)胞具有更少的線粒體，所以其能量代謝水平比滋養(yǎng)層細(xì)胞更低，所以在內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞中自噬活動較少，細(xì)胞能量代謝處于靜止?fàn)顟B(tài)[14]。Lee等[15]發(fā)現(xiàn)，小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞中的自噬比內(nèi)細(xì)胞團中的高。LYZ1在胚胎內(nèi)細(xì)胞團和滋養(yǎng)層細(xì)胞中的廣泛分布，是胚胎在面對不利環(huán)境時提高存活能力的表現(xiàn)，這也是休眠囊胚抗逆性強于正常孵化囊胚的另一種體現(xiàn)。

胚胎休眠期間，有許多基因和蛋白在休眠時期有差異表達[16]。然而，盡管休眠小鼠囊胚中的DNA合成和有絲分裂停止，代謝率下降，但仍滿足了胚胎存活的最低營養(yǎng)需要[17]。造成此差異的原因是在滯育期間小鼠胚胎提供代謝需求的機制與孵化囊胚有很大不同[18]。有證據(jù)表明，延長的休眠周期與休眠胚胎的數(shù)量呈負(fù)相關(guān)[14]，雌激素停藥后激活自噬，誘發(fā)延遲著床，而自噬在休眠囊胚延長存活的過程中持續(xù)存在。Weitlauf[18]發(fā)現(xiàn)延遲著床的胚胎再激活時，雖然細(xì)胞整體自噬總體水平并無下降，但內(nèi)細(xì)胞團中的自噬體數(shù)量有下降的趨勢。延遲著床期間，細(xì)胞能通過自噬作用溶解少量細(xì)胞，被消化成碎片的細(xì)胞可以作為胚胎細(xì)胞中重要的營養(yǎng)物質(zhì)被溶酶體-高爾基體消化，重新循環(huán)合成滯育期間需要的蛋白質(zhì)。溶菌酶也是一種溶酶體酶，自噬發(fā)生時，自噬小泡與溶酶體將融合形成自噬吞噬體，從而影響溶菌酶的分泌過程。Starling[14]認(rèn)為自噬途徑分泌溶菌酶是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的。很可能當(dāng)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到干擾，蛋白質(zhì)運輸、分揀系統(tǒng)出現(xiàn)壓力或應(yīng)激時，溶菌酶將進入自噬運轉(zhuǎn)系統(tǒng)，被雙層囊泡結(jié)構(gòu)包裹著運輸至相應(yīng)部位參與調(diào)節(jié)。

Sae-Kwang等[19]在對小鼠構(gòu)建敗血癥模型后，發(fā)現(xiàn)術(shù)后第5天，患敗血癥小鼠全部死亡，但對患病鼠體內(nèi)注射溶菌酶5 d后能將小鼠存活率提高到20% ～30%。這是因為在機體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，血管內(nèi)皮蛋白C受體(EPCR)會脫落成為可溶性的血管內(nèi)皮蛋白C受體(s EPCR)，而s EPCR是血管受損的標(biāo)志之一，脫落的EPCR刺激體內(nèi)免疫系統(tǒng)，引起炎癥反應(yīng)，而血管上皮中的溶菌酶能抑制血管內(nèi)皮蛋白C受體的脫落，表明溶菌酶在炎癥反應(yīng)發(fā)生時能維持血管完整性。2012年，Kaizu等[20]用RNA干擾技術(shù)造成溶菌酶在對蝦體內(nèi)缺失，以此分析溶菌酶在對蝦體內(nèi)的功能。結(jié)果顯示，缺失溶菌酶的對蝦在5 d內(nèi)全部死亡，死亡原因是對蝦淋巴中的血細(xì)胞數(shù)量大量減少和體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著增加。Lapcharoen對感染瘧原蟲的按蚊進行了溶菌酶基因敲除實驗[21]，結(jié)果顯示敲除該基因后，瘧原蟲卵囊數(shù)量顯著減少。原因是當(dāng)瘧原蟲入侵按蚊體內(nèi)，激活了按蚊的先天性免疫防御反應(yīng)，按蚊腸上皮會分泌出一些蛋白酶和表面蛋白，其中就含有溶菌酶，這些蛋白經(jīng)過一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，最終生成黑色素和毒性物質(zhì)，此過程稱為黑化包被反應(yīng)，按蚊通過此機制抵御和消滅入侵體內(nèi)的瘧原蟲[22]。這些都顯示出溶菌酶在胚胎發(fā)育過程中是至關(guān)重要的，缺失將會導(dǎo)致生物致死或?qū)纳x卵囊發(fā)育產(chǎn)生消極影響，在遭遇不利條件時又能上調(diào)使機體維持穩(wěn)態(tài)。

在小鼠孵化囊胚中，LYZ1蛋白少量分布在整個透明帶滋養(yǎng)層細(xì)胞中，在孵化和休眠囊胚中，LYZ1集中分主要分布在胚胎細(xì)胞的內(nèi)細(xì)胞團中。發(fā)育至囊胚階段的胚胎，在經(jīng)歷短暫的“窗口期”后進行胚胎著床，在母-胎進行營養(yǎng)與物質(zhì)交換的胎盤中，以及乳汁中均含有溶菌酶，預(yù)示從孵化囊胚時期開始，LYZ1已在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮一定的作用。囊胚的休眠過程延長了囊胚在子宮隱窩中停留的時間，子宮外環(huán)境和胚胎自身主動調(diào)節(jié)代謝速度變緩，來保證胚胎存活，胚胎代謝減緩到能維持其生存的最低水平，在這種情況下，母體子宮的免疫系統(tǒng)調(diào)動一系列激素與酶參與休眠過程，以此保證胚胎的正常代謝和存活。

目前LYZ1的功能研究主要集中在免疫系統(tǒng)和非特異性免疫中，本研究發(fā)現(xiàn)其在胚胎發(fā)育中同樣有著至關(guān)重要的作用。由此可見，LYZ1基因?qū)τ谀遗咴诔瑪?shù)排卵和休眠雙重因素下有著不可忽視的作用。下一步研究將繼續(xù)檢測LYZ1在小鼠不同妊娠階段的表達以及分布，將有助于進一步了解LYZ1在胚胎不同發(fā)育階段的分布和功能，能更完整地詮釋該基因在生殖方面的功能。