RhoA/ROCK1在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)及臨床意義

吳春葉 羅友紅 蔣端鳳 何玉嬋 高彤彤 黃勃 王曉桃

1桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院（廣西桂林 541100）；2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（廣西桂林 541100）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種骨髓漿細(xì)胞異常增殖引起的廣泛浸潤(rùn)、難以治愈的疾?。?］，其骨質(zhì)進(jìn)行性破壞，臨床主要表現(xiàn)為骨髓瘤骨?。╩yeloma bone disease，MBD），常伴有嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松、骨痛、病理性骨折等骨相關(guān)事件［2］。目前MBD的主要發(fā)生機(jī)制是在骨髓微環(huán)境中，瘤細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)經(jīng)典途徑如細(xì)胞核因子NF?κB受體活化因子（receptor activator of nuclear factor?kappa B，RANK）/RANK 配基（RANK ligand，RANKL）/護(hù)骨素（osteprotegerin，OPG）、骨架蛋白Axin和非經(jīng)典途徑如巨噬細(xì)胞炎癥蛋白?1α（mac?rophage inflammatory protein 1?α，MIP?1α）等信號(hào)通路導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)和成骨細(xì)胞功能受抑制，造成溶骨性病變，阻礙新骨生成［3-4］。RhoA屬于Rho家族蛋白的重要成員，具有GTP酶活性，其下游Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho?associ?ated coild?protein kinase，ROCK）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有兩種同源性極高的異構(gòu)體ROCK1和ROCK2，ROCK1主要存在肝、脾、骨骼肌等非神經(jīng)組織中，是一種調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈活性的激酶，導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白收縮，這是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和骨質(zhì)破壞的基礎(chǔ)［5-6］。有研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK1參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞遷移等多種細(xì)胞功能［6-7］。而目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于RhoA/ROCK1在MM中的表達(dá)狀態(tài)及機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在明確MM患者中RhoA/ROCK1的表達(dá)及與臨床各指標(biāo)的關(guān)系，試圖探討其在MBD中發(fā)生、發(fā)展的作用，為MM的發(fā)生機(jī)制及臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年4～12月在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及第二附屬醫(yī)院住院治療的46例MM患者骨髓標(biāo)本作為實(shí)驗(yàn)組，其中男22例，女24例，年齡47～75歲，中位年齡61歲；其中初診患者13例，復(fù)發(fā)難治患者33例；免疫分型：IgG 20例，IgA 16例，λ輕鏈型 24例，κ輕鏈型20例；Durie?Salmon，（D?S）分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期 6例，Ⅲ期 36例）；國(guó)際分期體系（International staging system，ISS）分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期17例，Ⅲ期15例。入組的MM患者因多種原因未行熒光原位雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的Mayo危險(xiǎn)分層檢查。實(shí)驗(yàn)組的MM患者診斷符合國(guó)際骨髓工作組的標(biāo)準(zhǔn)（2014年修訂）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器疾病病史；（2）有其他惡性腫瘤病史；（3）合并嚴(yán)重代謝性或感染性疾病；所有MM患者均進(jìn)行全身或局部的X線檢查確定有無(wú)骨質(zhì)疏松或溶骨性破壞，若X線檢查為陰性者，用電子計(jì)算機(jī)斷層掃描、磁共振成像及全身骨掃描等檢查，以X線為標(biāo)準(zhǔn)將MM進(jìn)行分級(jí)［8］：1級(jí)10例（21.74%），2級(jí)6例（13.04%），3級(jí)30例（65.22%）。

選取同期住院初診的原發(fā)免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）20例患者骨髓標(biāo)本為對(duì)照組，其中男9例，女11例；年齡48～68歲，中位年齡58歲。對(duì)照組的診斷符合中華血液學(xué)分會(huì)血栓與止血學(xué)制定ITP診斷與治療中國(guó)專家共識(shí)的標(biāo)準(zhǔn)（2016年版），并常規(guī)行骨密度測(cè)定排除有骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)破壞的患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書，兩組患者年齡、性別資料具有可比性。校正血鈣值（αCa）＝血清鈣值＋（40-血清白蛋白測(cè)定值）×0.025 mmol/L。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）、RhoA ELISA試劑盒（ELabscience公司），ROCK1 ELISA試劑盒（上海酶研生物科技有限公司），總RNA提取試劑盒（DP419）、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（KR116）、SYBR GReen試劑盒（FP205）（北京天根生化科技有限公司），CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio?Rad公司），Thermo Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo公司），引物序列：RhoA上游：5′?GACTCGGATTCGTTGCCTGA?3′，下游：5′?TGGGAACTGGTCCTTGCTGA?3′，擴(kuò)增片段 116 bp；ROCK?1上游：5′?CTGCAACTGGAACTCAACCAA?GAA?3′，下游：5′?GCTGGCCAACTGCATCTGAA?3，擴(kuò)增片段138 bp；內(nèi)參β?actin上游：5′?TGGCACCC?AGCACAATGAA ?3′，下 游 ：5′?CTAAGT?CATAGTCCGCCTAGAAGCA?3′，擴(kuò)增片段 186 bp。引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 標(biāo)本收集及處理 肝素抗凝管分別收集符合要求的骨髓標(biāo)本3～5 mL，先加3 mL人外周血淋巴細(xì)胞分離液至15 mL離心管內(nèi)，再將等量的骨髓液沿管壁緩慢移至分離液之液面上，500×g離心25 min，取其上清液用于ELISA，提取中間單個(gè)核細(xì)胞層總RNA用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT?PCR）。

1.4 研究方法 ELISA定量檢測(cè)RhoA、ROCK1的蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照ELISA操作說(shuō)明書進(jìn)行，每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取均值。qRT?PCR檢測(cè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞RhoA、ROCK1的mRNA表達(dá)：（1）Trizol試劑提取單個(gè)核細(xì)胞總RNA；（2）cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；（3）SYBR GReen試劑盒（FP205）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：總反應(yīng)體系20 μL，95 ℃ 15 min（預(yù)變性）、95℃ 5 s（變性）、60℃ 20 s（退火）、72℃30 s（延伸），共40個(gè)循環(huán)。以β?actin表達(dá)量作為內(nèi)參，用2-△△Ct值表示mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以x±s表示，計(jì)數(shù)資料及等級(jí)資料以中位數(shù)M（min，max）表示，兩參數(shù)的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。兩因素相關(guān)分析計(jì)量資料采用pearson相關(guān)分析，等級(jí)資料采用Spearman分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 骨髓RhoA、ROCK1表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)組中RhoA和ROCK1蛋白與mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 RhoA、ROCK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白表達(dá)水平Tab.1 Relative expression of mRNA and protein expression levels of RhoA and ROCK1x±s

2.2 RhoA、ROCK1表達(dá)水平與骨質(zhì)破壞程度關(guān)系 將骨質(zhì)破壞程度分為早期（1、2級(jí)）、晚期（3級(jí)），其中早期骨質(zhì)破壞較輕，晚期骨質(zhì)破壞較重。方差分析表明骨質(zhì)破壞輕度組（1、2級(jí)）和嚴(yán)重組（3級(jí)）的RhoA蛋白與mRNA水平均高于對(duì)照組，且嚴(yán)重組的RhoA蛋白與mRNA水平均高于骨質(zhì)破壞輕度組（均P＜0.05）。骨質(zhì)破壞嚴(yán)重組的ROCK1蛋白與mRNA水平均高于對(duì)照組（P＜0.05）；事后經(jīng)LSD檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)破壞嚴(yán)重組ROCK1的mRNA水平高于骨質(zhì)破壞輕度組（P＜0.05），而蛋白的表達(dá)水平在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；骨質(zhì)破壞輕度組的ROCK1蛋白與mRNA水平與對(duì)照組相比有升高趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2和圖1。

表2 不同程度骨質(zhì)破壞組中RhoA、ROCK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白表達(dá)水平Tab.2 Relative expression of mRNA and protein expression levels of RhoA and ROCK1 in different degrees of bone destruction x±s

圖1 不同程度骨質(zhì)破壞組中RhoA、ROCK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及蛋白表達(dá)水平Fig.1 Relative expression of mRNA and protein expression levels of RhoA and ROCK1 in different degrees of bone destruction

2.3 RhoA和ROCK1的蛋白表達(dá)水平與MBD患者臨床參數(shù)的相關(guān)性 用Pearson與Spearman相關(guān)分析表明RhoA的蛋白表達(dá)水平與αCa、β2?微球蛋白（β2?microglobulin，β2?mg）、骨質(zhì)損害分級(jí)、ISS分期、D?S分期呈正相關(guān)，而與血紅蛋白（hemoglo?bin，Hb）呈負(fù)相關(guān)；ROCK1與αCa、β2?mg、骨質(zhì)損害分級(jí)呈正相關(guān)，而與Hb呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表3。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK1在乳腺癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤中被激活后呈高表達(dá)狀態(tài)，并與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)［9-10］。TAKESHITA等［11］在鼠的關(guān)節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號(hào)通路可改變關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞骨架，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞退變，而RhoA/ROCK信號(hào)通路的抑制劑可延緩關(guān)節(jié)炎的發(fā)生及緩解疼痛，這提示RhoA/ROCK1可能在MBD的發(fā)生、發(fā)展中有著重要的作用。

本研究通過(guò)提取MM患者骨髓上清液及單個(gè)核細(xì)胞中RhoA、ROCK1的蛋白與mRNA，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平高于對(duì)照組，這可能說(shuō)明在MM中骨髓瘤細(xì)胞促進(jìn)RhoA、ROCK1的分泌而呈高表達(dá)狀態(tài)。其機(jī)制可能是在MM中，瘤細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如白介素?6、MIP?1a、sclerostin、RANK/RANKL等促進(jìn)RhoA、ROCK1的分泌，有文獻(xiàn)報(bào)道在鼠源性骨髓瘤中瘤細(xì)胞分泌的MIP?1α可促使小分子G蛋白R(shí)as和Rho異戊稀化，從而導(dǎo)致骨髓瘤患者骨髓中的RhoA水平增高［4，12-14］，增高的RhoA與骨髓微環(huán)境中GTP酶結(jié)合而激活下游ROCK基因，并介導(dǎo)ROCK的下游底物如肌球蛋白輕鏈磷酸酶、磷酸肌醇 3-激酶等磷酸化而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［13，15］，從而形成惡性循環(huán)，這也說(shuō)明RhoA、ROCK1能反映瘤負(fù)荷水平。從臨床相關(guān)資料中發(fā)現(xiàn)RhoA與ISS分期、D?S分期、β2?mg呈正相關(guān)，ROCK1與β2?mg呈正相關(guān)。而ISS分期、D?S分期及β2?MG可很好地反映MM患者的瘤負(fù)荷水平。其機(jī)制可能是瘤細(xì)胞分泌的RhoA是通過(guò)羧基端與ROCK1緊密結(jié)合，ROCK1抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracel?lular signal?regulated kinase，Erk1/2）釋放，而Erk1/2的作用底物是Bax，Erk1/2抑制后下調(diào)Bax，抑制Erk1/2/Bax/Caspase信號(hào)通路，導(dǎo)致瘤細(xì)胞凋亡受阻，瘤負(fù)荷增加［9，13，16］。

表3 RhoA、ROCK1的蛋白水平與MBD患者臨床參數(shù)的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between protein levels of RhoA and ROCK1 and clinical parameters of patients with MBD

本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的MM患者RhoA蛋白與mRNA水平均高于對(duì)照組，骨質(zhì)破壞嚴(yán)重組中RhoA蛋白與mRNA水平高于骨質(zhì)破壞輕組，骨質(zhì)破壞嚴(yán)重組的MM患者ROCK1 mRNA水平高于骨質(zhì)破壞輕組，骨質(zhì)破壞輕組的MM患者ROCK1蛋白與mRNA水平均高于對(duì)照組，這些結(jié)果提示RhoA、ROCK1與骨質(zhì)破壞嚴(yán)重程度相關(guān)，參與了MBD的發(fā)生及發(fā)展。臨床相關(guān)資料也表明RhoA、ROCK1與aCa、骨質(zhì)損害分級(jí)呈正相關(guān)，而αCa、骨質(zhì)損害分級(jí)主要反映骨質(zhì)破壞情況，提示骨質(zhì)破壞越嚴(yán)重，RhoA、ROCK1表達(dá)水平越高，這與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移等報(bào)道一致［17］，當(dāng)骨質(zhì)破壞愈嚴(yán)重，破骨細(xì)胞因子如MIP?1a及RANK/RANKL增加，刺激瘤細(xì)胞增殖從而分泌更多的RhoA，RhoA參與細(xì)胞功能需通過(guò)與其下游效應(yīng)蛋白R(shí)OCK1的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)［3-4，6］。ROCK1 蛋白質(zhì)序列中含有Erk結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在MBD患者中，活化的ROCK1通過(guò)蛋白序列中Erk結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合Erk1/2，ROCK1又通過(guò)羧基端與細(xì)胞膜上的RhoA結(jié)合，ROCK磷酸化后激活磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路，隨后不僅誘導(dǎo)瘤細(xì)胞增殖、遷移、黏附、瘤細(xì)胞耐藥，而且能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、成熟、增加破骨細(xì)胞的數(shù)量和功能，導(dǎo)致溶骨性破壞［16，18-19］。值得一提的是骨質(zhì)破壞輕度組的MM患者ROCK1蛋白與mRNA水平較對(duì)照組相比有升高的趨勢(shì)，在骨質(zhì)破壞嚴(yán)重組的MM患者ROCK1蛋白水平較破壞輕組也有相同的趨勢(shì)，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能與以下原因有關(guān)：（1）MM患者的骨質(zhì)可能未達(dá)到骨質(zhì)疏松或破壞不明顯；（2）下游ROCK1因子可能尚未完全活化；（3）研究樣本數(shù)量少。

本研究還發(fā)現(xiàn)RhoA、ROCK1與Hb呈負(fù)相關(guān)，由于Hb是反映患者體能狀態(tài)的常用指標(biāo)之一，本身瘤細(xì)胞浸潤(rùn)骨髓、血黏度升高、反復(fù)感染、促紅細(xì)胞生成素減少等可直接抑制造血干細(xì)胞造血，而增殖的瘤細(xì)胞大量分泌RhoA、ROCK及高瘤負(fù)荷水平可間接抑制造血功能，從而導(dǎo)致患者貧血［20］。

綜上所述：RhoA/ROCK1在MM患者中呈高表達(dá)狀態(tài)，骨質(zhì)破壞越嚴(yán)重，其在骨髓中的表達(dá)水平越高，并與骨質(zhì)破壞程度和aCa、β2?mg、ISS分期等相關(guān)，這提示RhoA/ROCK1可能在MM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但其具體高表達(dá)機(jī)制有待下一步深入研究，以便為MBD的臨床治療提供新思路。