沉默F(xiàn)BI?1基因?qū)θ橄侔㎝CF?7細胞周期和凋亡的影響

陳茂劍 王麗 楊偉萍 覃慶洪 譚啟杏 練斌 韋長元

1廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科（南寧 530021）；2柳州市人民醫(yī)院乳腺外科（廣西柳州 545006）

人類免疫缺陷病毒短轉(zhuǎn)錄誘導物連接因子1（factor that binds to the inducer of short transcripts of human immunodeficiency virus?1，F(xiàn)BI?1）是一種具有原癌基因活性的轉(zhuǎn)錄抑制因子，它可調(diào)控多種腫瘤相關基因的轉(zhuǎn)錄，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的上游關鍵基因［1-2］。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)FBI?1參與乳腺癌MCF?7細胞的增殖：在MCF?7細胞中，F(xiàn)BI?1較正常乳腺上皮MCF?10A細胞表達增高，而沉默F(xiàn)BI?1能顯著抑制MCF?7細胞增殖［3］。本研究進一步探討FBI?1沉默對MCF?7細胞周期和凋亡的影響及其可能機制，為尋找治療乳腺癌的策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人乳腺癌MCF?7細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.1.2 藥品及試劑 胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)基（Bioind公司）；細胞周期試劑盒（聯(lián)科生物）；細胞凋亡試劑盒（BD公司）；逆轉(zhuǎn)錄和qRT?PCR試劑盒（Takara公司）。引物合成由廣州艾基生物技術(shù)有限公司完成；FBI?1抗體（Abcam公司）；p53、p21和GAPDH抗體（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF?7細胞用含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒構(gòu)建 FBI?1沉默重組慢病毒顆粒及陰性對照慢病毒顆粒由蘇州吉瑪基因股份有限公司構(gòu)建，Polybrene由蘇州吉瑪基因股份有限公司提供。從所構(gòu)建的3條序列中選擇1條沉默效率最高的序列進入本實驗，其shRNA?FBI?1序列為GCAGCTGGACCTTGTAGATCA，shRNA?NC序列為TTCTCCGAACGTGTCACGT。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 細胞轉(zhuǎn)染步驟參考本課題組前期發(fā)表的文獻［3］，轉(zhuǎn)染成功后收集各組細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 分別收集各組細胞，用胰蛋白酶消化后制備單細胞懸液，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行，300目尼龍網(wǎng)過濾后采用流式細胞儀檢測細胞周期情況。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 分別收集各組細胞，用胰蛋白酶消化后制備單細胞懸液，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行，300目尼龍網(wǎng)過濾后采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 qRT?PCR檢測mRNA表達 采用qRT?PCR法，F(xiàn)BI?1和GAPDH引物參考文獻［3］，p53和p21引物參考文獻［4］。反應條件為95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；72℃，30 s；第2步至第4步進行40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，用2?△△CT法計算目的基因的相對表達量。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達 取各組細胞，嚴格按試劑盒說明進行操作，F(xiàn)BI?1一抗1∶10 000稀釋，p53、p21和GAPDH一抗1∶1 000稀釋，ECL系統(tǒng)顯影。使用Image J軟件進行灰度分析，GAPDH蛋白條帶為內(nèi)參照。

1.2.8 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，實驗進行3次重復，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA?FBI?1慢病毒感染MCF?7細胞對FBI?1表達的影響 qRT?PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與 shRNA?NC 組比較，shRNA?FBI?1 組 FBI?1 mRNA（圖1A，1.00±0.00vs.0.33±0.01，P＜0.01）及蛋白（圖1B，1.05±0.05vs.0.59±0.02，P＜0.01）表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 shRNA?FBI?1慢病毒感染MCF?7細胞對FBI?1 mRNA（A）及蛋白（B）表達的影響Fig.1 The expressions of FBI?1 mRNA（A）and protein（B）in MCF?7 cells infected with shRNA?FBI?1

2.2 沉默F(xiàn)BI?1對MCF?7細胞周期的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與shRNA?NC組比較，shRNA?FBI?1組G0/G1期細胞數(shù)明顯增加［（60.21± 0.80）%vs.（72.99±0.40）%，P＜0.01］，S期和G2/M期細胞數(shù)顯著減少［（27.28±0.21）%vs.（21.64±0.67）%，P＜ 0.05；（12.51±0.70）%vs.（5.37 ± 0.27）%，P＜0.01］，可見細胞被阻滯于G0/G1期。見圖2。

2.3 沉默F(xiàn)BI?1對MCF?7細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，與shRNA?NC組比較，shRNA?FBI?1組細胞凋亡率顯著增加［（2.84± 0.22）%vs.（5.14±0.48）%，P＜0.01］，差異有統(tǒng)計學意義。見圖3。

2.4 沉默F(xiàn)BI?1對MCF?7細胞p53和p21 mRNA表達的影響 qRT?PCR結(jié)果顯示，與shRNA?NC組比較，shRNA?FBI?1組p53和p21 mRNA的表達明顯上調(diào)（1.00±0.00vs.1.72±0.21，P＜0.01；1.00±0.00vs.1.51±0.13，P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。見圖4。

2.5 沉默F(xiàn)BI?1對MCF?7細胞p53和p21蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果顯示，與shRNA?NC組比較，shRNA?FBI?1組p53和p21蛋白的表達顯著增加（0.60±0.04vs.1.12±0.09，P＜0.01；0.71±0.06vs.1.01±0.02，P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義。見圖5。

圖2 沉默F(xiàn)BI?1對MCF?7細胞周期的影響Fig.2 The effect of silencing FBI?1 on cell cycle of MCF?7 cells

圖3 沉默F(xiàn)BI?1對MCF?7細胞凋亡的影響Fig.3 The effect of silencing FBI?1 on apoptosis of MCF?7 cells

圖4 沉默F(xiàn)BI?1對MCF?7細胞p53和p21 mRNA表達的影響Fig.4 The effect of silencing FBI?1 on the mRNA levels of p53 and p21 in MCF?7 cells

3 討論

圖5 沉默F(xiàn)BI?1對MCF?7細胞p53和p21蛋白表達的影響Fig.5 The effect of silencing FBI?1 on the protein levels of p53 and p21 in MCF?7 cells

乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移是一個多階段的、多基因參與的復雜過程，目前其機制尚未完全闡明。隨著免疫學和基因技術(shù)的發(fā)展進步，腫瘤在基因治療方面取得了巨大進步，如何選擇治療性基因是腫瘤基因治療中最關鍵的問題。研究［5-7］發(fā)現(xiàn)FBI?1不僅在細胞分化和機體發(fā)育等多種重要生命活動中扮演著重要角色，而且與肝癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌和鼻咽癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關。FBI?1基因敲除小鼠胚胎均在胚胎期致死［8］。敲除FBI?1的鼠胚胎成纖維細胞（embryo fibroblasts，MEFs）失去了轉(zhuǎn)化和癌變的能力，而過表達FBI?1的MEFs則轉(zhuǎn)化能力增強，癌變速度加快［8］。LIN等［9］通過體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，沉默F(xiàn)BI?1明顯抑制肝癌細胞的增殖。YUAN等［10］研究發(fā)現(xiàn)，給grp 170?FBI?1復合體處理的肺癌小鼠，其腫瘤的生長受到明顯的抑制，并且小鼠的存活時間明顯延長。然而FBI?1對乳腺癌細胞的影響及機制目前尚不明確。筆者前期研究已發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)BI?1后，乳腺癌MCF?7細胞增殖能力明顯下降［3］。本研究繼續(xù)探討FBI?1與MCF?7細胞周期和細胞凋亡變化的關聯(lián)性。結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)BI?1表達后，MCF?7細胞周期被阻滯于G0/G1期，并且S期和G2/M期的細胞數(shù)明顯減少，細胞凋亡率顯著增高，提示沉默F(xiàn)BI?1抑制乳腺癌增殖很可能與其阻滯細胞于G0/G1期以及誘導細胞凋亡有關，F(xiàn)BI?1可能成為治療乳腺癌的潛在靶點。

p53是目前研究最廣泛的抑癌基因，作為一個重要的調(diào)控因子，p53在誘導細胞周期阻滯、凋亡、DNA修復或細胞衰老等過程中發(fā)揮重要作用［11］。大量研究［12-13］表明，p53的抗腫瘤作用與其阻滯細胞周期和誘導細胞發(fā)生凋亡密切相關。季玉連等［14］在研究FBI?1抑制胃癌細胞凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BI?1可抑制p53的表達。FENG 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BI?1過表達使肝癌細胞G2/M期細胞數(shù)明顯增多，p53和其下游因子p21表達下調(diào)，而沉默F(xiàn)BI?1可減少G2/M期細胞數(shù)，上調(diào)p53和p21表達。細胞依賴性激酶抑制劑家族的重要成員p21是p53信號通路下游因子，在DNA復制和損傷修復、細胞分化、衰老、周期調(diào)控、凋亡及腫瘤形成和發(fā)展等過程也發(fā)揮重要作用，p21可以通過細胞周期調(diào)控作用間接參與細胞凋亡進而抑制腫瘤細胞的生長［15-16］。本研究結(jié)果顯示，沉默F(xiàn)BI?1基因的表達后，MCF?7細胞p53和p21表達顯著增加，表明沉默F(xiàn)BI?1可能通過調(diào)控p53?p21途徑進而阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡。

本研究結(jié)果表明，沉默F(xiàn)BI?1可阻滯乳腺癌MCF?7細胞周期進程和促進細胞凋亡，從而起到抑癌作用，其機制可能與上調(diào)p53和p21表達有關。但本研究僅是FBI?1體外實驗的初探，并且機制研究深度不夠，F(xiàn)BI?1能否作為乳腺癌防治新靶點尚需后續(xù)相關動物體內(nèi)實驗及具體分子機制研究來進一步證實，以期為以FBI?1為靶點的新藥開發(fā)及乳腺癌臨床防治提供更多的理論與實驗依據(jù)。