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    AKT/FOXO1信號(hào)通路在心力衰竭小鼠骨骼肌萎縮中的作用

    2018-11-01 08:12:28張聰聰陳博雅程乃萱
    心肺血管病雜志 2018年1期
    關(guān)鍵詞:前肌肌纖維骨骼肌

    張聰聰 陳博雅 程乃萱 杜 杰

    心力衰竭(heart failure, HF)是多種心血管疾病(高血壓、心肌梗死、先天性心臟病、瓣膜病等)導(dǎo)致的心臟病理性重構(gòu)的結(jié)果。HF患者會(huì)感到疲勞、乏力、嗜睡和身體活動(dòng)能力下降, 及包括呼吸肌在內(nèi)的多種骨骼肌功能異常的表現(xiàn)。身體80%的蛋白質(zhì)由骨骼肌儲(chǔ)存,骨骼肌萎縮會(huì)導(dǎo)致全身性的營養(yǎng)不良,骨骼肌萎縮的程度能夠作為HF導(dǎo)致死亡的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)[1-2]。因此,HF時(shí)骨骼肌蛋白分解代謝的研究具有重要意義。本研究采用主動(dòng)脈弓橫向結(jié)扎(transverse aortic constriction, TAC)8周,復(fù)制小鼠HF動(dòng)物模型[3]。采用實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(realtime-PCR) 和Western blot 技術(shù),檢測(cè)HF小鼠脛骨前肌內(nèi)Atrogin-1 和MuRF1的mRNA及蛋白表達(dá)變化,并采用Western blot 技術(shù),檢測(cè)其上游轉(zhuǎn)錄因子FOXO1以及激酶AKT的磷酸化水平和總蛋白水平進(jìn)行測(cè)定,比較磷酸化蛋白表達(dá)與總蛋白的比率。通過觀察骨骼肌組織中上述指標(biāo)的變化,從而探討HF時(shí)骨骼肌萎縮的可能分子機(jī)制,并為有效的多靶點(diǎn)干預(yù)提供理論依據(jù)。

    材料與方法

    1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6J小鼠20只,雄性,10周齡,體質(zhì)量20~23g,由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供。購自北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2014-0004,使用許可證號(hào): SCXK(京)2015-0023。小鼠隨機(jī)分為兩組: 對(duì)照組(10只) 和HF模型組(10只)。

    2. 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,美國),realtime-PCR試劑盒(TaKaRa,日本),Atrogin-1,MuRF1一抗(Abcam,美國),F(xiàn)OXO1,p-FOXO1,AKT, p-AKT一抗(Cell Signaling Technology,美國),GAPDH一抗(中杉金橋,中國),DyLight 800標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(LI-COR,美國)。

    3. TAC誘導(dǎo)心力衰竭模型制備 HF組小鼠使用1%戊巴比妥麻醉(70mg/kg體質(zhì)量),從頸部剪開皮膚,游離甲狀腺,剪開胸骨,游離胸腺及主動(dòng)脈弓周圍結(jié)締組織,充分暴露主動(dòng)脈弓。使用5~0棉線結(jié)扎主動(dòng)脈弓,以27號(hào)針為墊針結(jié)扎。結(jié)扎后撤出27號(hào)針頭,縫合胸骨和皮膚。對(duì)照組小鼠僅麻醉后剪開頸部皮膚剪開胸骨并暴露主動(dòng)脈弓后進(jìn)行縫合。所有小鼠均普通飲食飼養(yǎng),自由進(jìn)食、進(jìn)水。分別于術(shù)前,術(shù)后1周,2周,4周,8周進(jìn)行小鼠稱重。術(shù)后1周,通過小動(dòng)物超聲(VIVO,美國)檢測(cè)主動(dòng)脈弓流速,以流速≥2 500mm/s為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后8周,測(cè)量心功能之后收取小鼠心臟組織,用10%中性甲醛固定后用于病理分析。同時(shí)無創(chuàng)游離小鼠雙側(cè)脛骨前肌,并進(jìn)行稱重,一側(cè)用10%中性甲醛固定后用于病理分析,另一側(cè)用液氮凍存用于mRNA和蛋白的提取。

    4. 小鼠心功能測(cè)定 于TAC術(shù)后8周,通過小動(dòng)物超聲進(jìn)行小鼠心功能測(cè)定,主要檢測(cè)指標(biāo)如下:室間隔厚度(interventricular septum,IVS)、左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPW)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension, LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic dimension, LVEDS)、左心室舒張末期容積(left ventricular end-diastolic volume, LVESV)、左心室收縮末期容積(left ventricular end-systolic volume, LVEDV)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

    5. 心臟組織、骨骼肌組織病理切片的制備方法同前[4]。取出已固定的心臟組織和脛骨前肌,常規(guī)石蠟包埋,4μm切片。HE染色:切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水,蘇木素染色3min,自來水沖洗;鹽酸乙醇分化30s;自來水返藍(lán)5min;置伊紅染色液2min;常規(guī)脫水,透明,封片。WGA染色:切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水,檸檬酸緩沖液(pH=6.0)抗原修復(fù)90s,1 x PBS緩沖液洗3遍,羊血清封閉液室溫封閉30min,WGA工作液(10ug/mL, Sigma,美國)37℃,孵育60min,1 x PBS緩沖液洗3遍,DAPI封片。使用電子熒光顯微鏡(Nikon,日本)進(jìn)行病理圖像采集,使用NIS Br 3.0軟件進(jìn)行圖像分析。

    6. realtime-PCR檢測(cè)小鼠脛骨前肌組織中Atrogin-1和MuRF1的mRNA水平 取相同質(zhì)量50 mg 的脛骨前肌放入勻漿器內(nèi),加入1 mL Trizol(Invitrogen,美國)提取RNA,用Nanodrop 2 000測(cè)定RNA 的濃度和OD260 /280 比值。各樣本均按5μg RNA 相對(duì)應(yīng)的體積(n μL) 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)錄體系為20 μL 體系,將混合好的液體放置在PCR儀中,反應(yīng)條件為42℃, 60min;95℃, 5min。將反轉(zhuǎn)好的cDNA按照realtime-PCR 說明書進(jìn)行半定量PCR,使用Bio-RAD CFX Connect進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件為95℃, 2min;95℃,15s;60℃, 30min(40個(gè)循環(huán));60℃, 5s,每個(gè)循環(huán)增加0.5℃~95℃。以GAPDH作為內(nèi)參?;虻谋磉_(dá)水平以得到的相應(yīng)的Ct 值用2 (Ct GAPDH-Ct 目標(biāo)基因)法進(jìn)行計(jì)算。引物序列分別為: Atrogin-1∶5’- CGGGCTTCCTTGAGTGTCTT-3’(上游),5’- GGCTCTCCTAAGGTCCCAGA-3’(下游);MuRF-1∶5’- AAACTTGTGGA GACCGCCAT-3’(上游),5’- TCTTGATGAGCTGCTTGGCA-3’(下游);GAPDH:5’- CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3’(上游),5’-GCGGCACGTCAGATCCA-3’(下游)。

    7. Western blot 測(cè)定小鼠脛骨前肌組織中相關(guān)蛋白的表達(dá) 取50mg脛骨前肌用300μL T-PER組織裂解液(含1x 0.5M EDTA, 1x蛋白酶抑制劑,1x磷酸酶抑制劑)(Thermo,美國)進(jìn)行裂解,12 000r/min,離心15min,后吸取上清。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品總蛋白濃度。將100μg蛋白與5x蛋白上樣緩沖液進(jìn)行混合后,100℃變性5 min。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,用5%脫脂奶粉溶液封閉2h,再依次孵育稀釋后的一抗Atrogin-1(兔多抗,1∶1 000),MuRF1(兔多抗,1∶1 000),F(xiàn)OXO1(兔多抗,1∶1 000),p-FOXO1(兔多抗,1∶1 000),AKT(兔多抗,1∶1 000), p-AKT(兔多抗,1∶1 000),GAPDH (鼠單抗,1∶1 000),4℃孵育過夜。洗滌。敷二抗(1∶1 000稀釋),室溫孵育1小時(shí),稍洗。使用Odyssey 儀器進(jìn)行熒光掃描,并分析條帶灰度。

    8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1.HF 模型的結(jié)果 (1)體質(zhì)量變化:TAC 術(shù)前和術(shù)后2周,4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的平均體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,TAC 6周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組小鼠(P<0.05),TAC 8周時(shí)實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組(P<0.01),且體質(zhì)量下降已超過預(yù)計(jì)值的10%,出現(xiàn)營養(yǎng)不良改變。結(jié)果見圖1。

    圖1 小鼠體質(zhì)量變化 注:與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01

    (2)心功能變化:TAC術(shù)后8周時(shí)使用小動(dòng)物超聲檢測(cè)兩組心功能各項(xiàng)指標(biāo),其中HF組的EF值和FS值較對(duì)照組顯著下降(P<0.01,表1)。

    (3)心臟組織形態(tài)學(xué)改變:心臟組織HE染色可見HF組小鼠心臟室壁厚度較對(duì)照組增加,心室內(nèi)徑增加。WGA染色觀察心肌細(xì)胞的面積發(fā)現(xiàn)HF組心肌細(xì)胞的面積大于對(duì)照組(P<0. 01,圖2)。

    表1 兩組小鼠心功能比較

    注:LVM:左心室質(zhì)量

    圖2 小鼠心肌病理檢測(cè) A:HE染色(放大倍數(shù)40X,標(biāo)尺500μm);A心動(dòng)衰竭組:心臟左心室室壁厚度的測(cè)量數(shù)據(jù),與對(duì)照組相比,*P<0.05;B:WGA染色(放大倍數(shù)400X,標(biāo)尺50μm),B心動(dòng)衰竭組:根據(jù)WGA染色心肌細(xì)胞的橫截面面積,與對(duì)照組相比,** P<0.01

    (4)骨骼肌組織形態(tài)學(xué)觀察:HF組脛骨前肌重量和脛骨長度比顯著低于對(duì)照組。HE染色可見HF組肌纖維橫截面積較對(duì)照組減小,經(jīng)過WGA染色統(tǒng)計(jì)分析肌纖維面積可見HF組肌纖維橫截面面積顯著小于對(duì)照組,每高倍鏡視野下肌纖維數(shù)量計(jì)數(shù)顯著高于對(duì)照組。提示HF組骨骼肌發(fā)生萎縮。見圖3~4。

    圖3 小鼠脛骨前肌和脛骨長度比值, 與對(duì)照組相比,**P<0.01

    圖4 小鼠脛骨前肌肌纖維病理分析 A:WGA染色(放大倍數(shù)X400,標(biāo)尺50μm);B:每高倍視野(HPF)中肌纖維數(shù)量的統(tǒng)計(jì);C:肌纖維面積的統(tǒng)計(jì)結(jié)果注:與對(duì)照組相比,**P<0.01

    2.脛骨前肌中Atrogin-1和MuRF1 的mRNA 和蛋白表達(dá)變化 脛骨前肌realtime-PCR的結(jié)果顯示,HF組脛骨前肌中Atrogin-1的mRNA水平較對(duì)照組增加約3.8倍 (P<0.01); HF組脛骨前肌中MuRF1的mRNA水平較對(duì)照組增加7.2倍 (P<0.01,圖5)。Western Blot的結(jié)果顯示,Atrogin-1 的蛋白相對(duì)表達(dá)量HF組較對(duì)照組明顯增加,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01); MuRF1 的蛋白表達(dá)HF組較對(duì)照組增加(P<0.05,圖6)。

    圖5 兩組小鼠脛骨前肌中Atrogin-1和MuRF-1的mRNA表達(dá)水平 注:與對(duì)照組相比,**P<0.01

    圖6 兩組小鼠脛骨前肌中Atrogin-1和MuRF-1的蛋白表達(dá)水平 注:與對(duì)照組相比,**P<0.01

    3.脛骨前肌中AKT/FOXO1信號(hào)通路的活化變化 Western blot 分析結(jié)果顯示,AKT和FOXO1總蛋白的表達(dá)量在HF組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。磷酸化AKT和磷酸化FOXO1的水平在HF組顯著增加,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p-AKT/AKT和p-FOXO1/ FOXO1的比值在HF組顯著增加,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖7)。

    圖7 A:兩組小鼠脛骨前肌中p-FOXO1和FOXO1的蛋白表達(dá)水平;B:兩組小鼠脛骨前肌中p-AKT和AKT的蛋白表達(dá)水平,注:與對(duì)照組相比,*P<0.05; 與對(duì)照組相比,**P<0.01

    討 論

    根據(jù)中國心力衰竭注冊(cè)登記記錄統(tǒng)計(jì),中國35~74歲人群慢性心力衰竭患病率為0.9%,并呈上升趨勢(shì),其中住院心力衰竭患者的病死率約為5.3%[5]。心力衰竭患者骨骼肌萎縮的程度直接影響疾病的預(yù)后情況[2]。心力衰竭引起骨骼肌病變的主要表現(xiàn)為:①重量減輕;②結(jié)構(gòu)改變, 如肌纖維面積變小、I型纖維向Ⅱ型纖維轉(zhuǎn)變、線粒體減少;③能量代謝的改變,蛋白水解、糖酵解增加;④細(xì)胞因子及氧化標(biāo)記物表達(dá)增加等[6]。心力衰竭患者發(fā)生骨骼肌萎縮是一種多因素、多種分子生物學(xué)機(jī)制共同參與的復(fù)雜過程[7],其最終歸結(jié)為骨骼肌蛋白合成和降解之間的不平衡,蛋白降解途徑增加程度大于蛋白合成,導(dǎo)致骨骼肌萎縮。我們?cè)诒狙芯恐惺褂肨AC 8周建立小鼠HF模型,發(fā)現(xiàn)小鼠的骨骼肌重量減輕,肌纖維面積減小,提示小鼠HF導(dǎo)致骨骼肌萎縮的模型成功,可以為研究小鼠骨骼肌萎縮的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。

    國內(nèi)外的研究顯示,骨骼肌萎縮過程中的蛋白質(zhì)的降解途徑主要包括溶酶體途徑、泛素-蛋白酶體途徑和Ca2+依賴性途徑等[8],其中泛素-蛋白酶體途徑最為重要。在肌肉中特異性表達(dá)的E3 泛素連接酶主要為MAFbx (muscle atrophy F-box,又稱為Atrogin-1)和MuRF-1 (muscle RING finger 1),這兩個(gè)分子屬于成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen, MyoD)降解過程中的核蛋白[9]。在發(fā)生HF的心臟組織中Atrogin-1和MuRF-1可出現(xiàn)高表達(dá)[10-11]。Li 等的實(shí)驗(yàn)證明,腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor,TNF)-α可通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) p38亞基來調(diào)節(jié)Atrogin-1的表達(dá)[12]。細(xì)胞因子胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor,IGF)-1的表達(dá)可以抑制Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)從而抑制骨骼肌萎縮的發(fā)生[13]。先前有研究顯示在慢性阻塞性肺疾病導(dǎo)致的骨骼肌萎縮過程中骨骼肌中的Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)就顯著增加[14]。我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)HF小鼠的骨骼肌中兩種泛素連接酶Atrogin-1和MuRF-1的表達(dá)顯著增加,這兩個(gè)分子可能引起骨骼肌中蛋白質(zhì)的泛素化增加, 促進(jìn)其被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解,發(fā)生骨骼肌萎縮。

    轉(zhuǎn)錄因子FOXOs 家族是一類擁有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的蛋白,主要包括FOXO-1 和FOXO-3 等。FOXOs 蛋白通過其C末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與靶基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合促進(jìn)靶基因的表達(dá)[15]。當(dāng)FOXOs被上游的信號(hào)分子如AKT等磷酸化后使其由細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì),進(jìn)而被泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解,表達(dá)降低,導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性下調(diào),從而抑制其對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。研究顯示FOXOs可以通過調(diào)控自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄引起骨骼肌細(xì)胞的自噬,同時(shí)可以促進(jìn)肌細(xì)胞中MyoD的表達(dá)影響肌纖維的分化[16-17]。最近的研究也顯示FOXO1可以直接結(jié)合至與骨骼肌萎縮密切相關(guān)的Atrogin-1 和MuRF1的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)域,從而調(diào)節(jié)Atrogin-1 和MuRF1的表達(dá)[18]。研究顯示骨骼肌特異性敲除FOXO1基因?qū)⒁种茝U用性骨骼肌萎縮或去神經(jīng)性骨骼肌萎縮的發(fā)生[19-20]。我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)HF組骨骼肌組織中FOXO1的磷酸化水平增加,同時(shí)FOXO1總蛋白水平下降,提示在心力衰竭導(dǎo)致骨骼肌萎縮的過程中存在負(fù)向調(diào)控分子導(dǎo)致FOXO1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力下降從而抑制骨骼肌萎縮的發(fā)生。

    AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)的協(xié)同作用下,磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)與胞漿內(nèi)AKT 結(jié)合,AKT轉(zhuǎn)位 到質(zhì)膜,并促進(jìn)Ser473 和Thr308 位點(diǎn)磷酸化。Ser473或/和Thr308 位點(diǎn)的磷酸化是AKT 激活的必要條件,活化狀態(tài)下的AKT 使轉(zhuǎn)錄因子FOXO1 磷酸化后從細(xì)胞核中移出,并在細(xì)胞漿中被泛素蛋白酶體所降解,從而抑制其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性[21]。Atrogin-1 和MuRF1 受FOXOs 轉(zhuǎn)錄因子家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié),而AKT 可使FOXOs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能失活。本研究中發(fā)現(xiàn)HF小鼠的骨骼肌中AKT和FOXO1的磷酸化顯著高于對(duì)照組,提示骨骼肌中存在激活A(yù)KT下調(diào)FOXO1的轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制Atrogin-1 和MuRF1表達(dá)抑制骨骼肌萎縮的負(fù)性調(diào)控因子。另一方面,磷酸化的AKT可激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(e IF4E-binding protein 1,4E-BP1)、核糖體S6激酶1(ribosome protein subunit 6 kinase 1, S6K1)信號(hào)通路,并阻礙抑制蛋白質(zhì)合成因子糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)活性,促進(jìn)蛋白合成[22-23],啟動(dòng)負(fù)向調(diào)控機(jī)制。

    綜上所述,心力衰竭的骨骼肌中蛋白降解相關(guān)基因Atrogin-1 和MuRF1的表達(dá)顯著上調(diào)促進(jìn)骨骼肌萎縮的形成。同時(shí)骨骼肌中AKT/FOXO1信號(hào)通路活化,啟動(dòng)負(fù)向調(diào)控機(jī)制,可能發(fā)揮抑制骨骼肌萎縮的作用,成為機(jī)體的一個(gè)代償機(jī)制。但是具體何種分子激活A(yù)KT/FOXO1信號(hào)通路尚需進(jìn)一步的探索。本研究的發(fā)現(xiàn)為治療心力衰竭骨骼肌萎縮提供一個(gè)新思路,即干預(yù)AKT/FOXO1 信號(hào)通路上的某些靶點(diǎn)使其進(jìn)一步激活,從而達(dá)到抑制骨骼肌萎縮的目的。

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