小分子青稞β-葡聚糖輔助降血糖功能研究

胡輝，劉鵬，程佩佩，王委，劉源才，4

（1.勁牌生物醫(yī)藥有限公司，湖北黃石435000；2.勁牌有限公司，湖北大冶435100；3.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北大冶435100；4.勁牌研究院，湖北黃石435000）

β-葡聚糖，即（1-3）（1-4）-β-D-葡聚糖，是由 β-1，3和β-1，4糖苷鍵將D-吡喃葡萄糖基連接而成的線型均一性非淀粉多糖[1]，具有降低血液中膽固醇水平[2]、調(diào)節(jié)血糖濃度[3]、增強(qiáng)機(jī)體免疫力[4]等重要的生理功能。美國(guó)食品藥品管理局已頒發(fā)相關(guān)條例，認(rèn)可在食品中添加β-葡聚糖組分有利于人們健康[5]，英、法等國(guó)食藥監(jiān)局不但允許在含大麥的產(chǎn)品包裝上標(biāo)明該類食物能減少患冠心病風(fēng)險(xiǎn)，還強(qiáng)制規(guī)定“一般成人日均攝入食品中β-葡聚糖絕對(duì)量不低于3 g”的指標(biāo)[6]。隨著高血壓、高血脂、肥胖、糖尿病等“現(xiàn)代文明病”的高發(fā)，膳食纖維的需求量日漸旺盛。青藏高原特殊的生態(tài)條件賦予了青稞在世界范圍內(nèi)擁有最高β-葡聚糖含量[7-8]的寶貴特征，青稞β-葡聚糖的研究與利用對(duì)青稞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

然而青稞β-葡聚糖是青稞籽粒胚乳細(xì)胞壁的主要成分，占胚乳細(xì)胞壁干重的75%左右，是一類非淀粉多糖[9]。與纖維素結(jié)構(gòu)類似，其中就有超過(guò)10個(gè)葡萄糖分子以β-1，4糖苷鍵連接的β-葡聚糖片段，該結(jié)構(gòu)片段在水及乙醇中溶解性極低[10]，影響產(chǎn)品穩(wěn)定性和消費(fèi)者體驗(yàn)。另有學(xué)者研究顯示，餐后血糖指數(shù)與胰島素反應(yīng)受β-葡聚糖分子量的影響[11]，分子量為40 000[12]及100 000[13]的β-葡聚糖提取物無(wú)顯著降低餐后血糖的效果，而分子量為70 000[12]的β-葡聚糖提取物具有顯著降低餐后血糖的效果，推測(cè)其降血糖功效可能與分子量關(guān)系密切，因此特定分子量的β-葡聚糖需進(jìn)行藥理活性研究。

現(xiàn)行的提取工藝分為3類，分別為水提法[14-17]、堿提法[18-19]和酸提法[20-21]，水提法得到的葡聚糖分子片段最完整，但分子量大小不齊，且含有難溶大分子片段，提取物在水及乙醇溶液中的穩(wěn)定性不好，易沉淀；堿提法和酸提法對(duì)不溶性葡聚糖提取效果較好，但水解產(chǎn)物的分子量不易控制，且酸提法得到的提取物降低了提取物的黏度，可能影響其功能活性。鑒于此，本課題組將從工藝和藥效方面解決以下問(wèn)題：1）采用先堿提再酶解的方法，解決青稞β-葡聚糖分子量大和在水及乙醇溶液中溶解性不好的問(wèn)題，拓展青稞β-葡聚糖在飲料行業(yè)中的應(yīng)用；2）以酶解前后青稞β-葡聚糖為受試樣品進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究酶解后產(chǎn)物的輔助降血糖功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試樣品的制備方法

青稞β-葡聚糖A（未酶解樣品）：將青稞粉碎后用80%乙醇回流2 h脫脂，棄去乙醇液，加4倍量水混勻后，飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH值至8.5～9.0，（75±5）℃提取2 h，提取液加入10%的鹽酸調(diào)pH 4.5，冷卻后離心（16 000 r/min），將離心清液干燥即得。

青稞β-葡聚糖B（酶解后樣品）：青稞粉碎后用80%乙醇回流2 h脫脂，棄去乙醇液，加4倍量水混勻后，飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH值至8.5～9.0，（75±5）℃提取2 h，提取液加入10%的鹽酸調(diào)pH 4.5，冷卻后離心（16 000 r/min），離心清液pH值用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)調(diào)至7.0，加入10%α-淀粉酶，在50℃下酶解4 h，煮沸30 min殺酶，冷卻，上清液經(jīng)過(guò)超濾膜純化，收集截留液，干燥即得。

1.1.2 材料及儀器

KM小鼠（SPF等級(jí)，雌性，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2011-0003，合格證號(hào) 43004700016013）：湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；小鼠于湖北師范大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房養(yǎng)殖，環(huán)境溫度20℃～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，光照12 h/d；輻照小鼠繁殖飼料：湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

JPS-6型系列手持式全血葡萄糖測(cè)試儀、虹吸式血糖試條：北京怡成生物電子技術(shù)有限公司；小鼠灌胃針：武漢恒康醫(yī)療器械有限公司。

1.1.3 樣品及試劑

青稞β-葡聚糖提取物樣品A、B（黃色粉末，2.25 kg/袋）人體推薦攝入量7.8 g/d，按成人60 kg.bw計(jì)為130 mg/kg·bw、15度基酒（10瓶，5 L/瓶）：均由湖北勁牌生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；鏈脲佐菌素：Sigma；中溫α-淀粉酶（酶活力3 000 U/g）：山東蘇柯漢生物工程股份有限公司；其他試劑均為分析純。

檸檬酸緩沖液：稱取2.1 g檸檬酸（相對(duì)分子量210.4）溶于雙蒸水，定容至100 mL，配成A液。稱取2.94 g檸檬酸鈉（相對(duì)分子量294.10）溶于雙蒸水，定容至100 mL，配成B液。用時(shí)將A液和B液按照1∶1.32（體積比）混合，即配成檸檬酸緩沖液。鏈脲佐菌素溶液：用檸檬酸緩沖液配置，現(xiàn)配現(xiàn)用，遮光置于冰上，30 min內(nèi)，必須注射完畢。

青稞葡聚糖A（批號(hào)20141008）、青稞葡聚糖B（批號(hào)20150416）樣品均委托青島科標(biāo)化工分析有限公司檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 青稞β-葡聚糖樣品平均分子量和純度Table 1 Average molecular weight and purity quotient of hull-less barley β-glucan

青稞β-葡聚糖酶解后（B）相較于未酶解（A）產(chǎn)物，在50%乙醇溶液和純水溶液中澄清透明，不顯乳白色渾濁狀態(tài)，顯示酶解后產(chǎn)物溶解性良好（葡聚糖濃度為5%）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 正常小鼠降血糖實(shí)驗(yàn)

75只KM小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按禁食不禁水7 h～8 h的血糖水平隨機(jī)分組，分別為：空白對(duì)照組（15度基酒、純水）、3個(gè)樣品組（15度基酒+B、純水+B、純水+A），15只/組，共5組?？瞻讓?duì)照組給予同體積溶劑（15度基酒、純水），3個(gè)樣品組給予20倍人體推薦量，連續(xù)灌胃30 d，灌胃體積為0.4 mL，測(cè)空腹血糖值（禁食同實(shí)驗(yàn)前），比較各組動(dòng)物血糖值。

1.2.1.2 高血糖（1型糖尿病）模型小鼠降血糖實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)取15只KM小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食7 h～8 h，測(cè)空腹血糖，作為該批次小鼠基礎(chǔ)血糖值。隨后取200只待造模小鼠，禁食12 h以上（自由飲水），注射鏈脲佐菌素（用前新鮮配制）造模，小鼠腹腔注射80 mg/kg.BW，連續(xù)注射兩天。5 d～7 d后小鼠禁食7 h～8 h，測(cè)血糖，血糖值 10 mmol/L～25 mmol/L[22]的小鼠，判斷高血糖模型建立成功。

取165只成功的高血糖模型小鼠按禁食7 h～8 h的血糖水平（組間差不大于1.1 mmol/L）隨機(jī)分組，分別為：2個(gè)模型對(duì)照組（15度基酒、純水）、9個(gè)樣品組（15度基酒+B、純水+B、純水+A），15只/組，共 11組。樣品組分別給予低中高3個(gè)劑量，劑量濃度依次為5、10、20倍人體推薦量，模型對(duì)照組分別給予同體積溶劑（15度基酒、純水），連續(xù)灌胃30 d，測(cè)空腹血糖值（禁食同實(shí)驗(yàn)前），比較各組動(dòng)物血糖值及血糖下降百分率。

1.2.1.3 高血糖模型小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)

高血糖模型小鼠（降血糖實(shí)驗(yàn)），連續(xù)灌胃30 d后，測(cè)空腹血糖值（禁食同實(shí)驗(yàn)前），作為給葡萄糖前（即0 d）血糖值，15 min～20 min后各組經(jīng)口給予葡萄糖2.0 g/kg·bw，測(cè)定給葡萄糖后各組0.5、2 h的血糖值，觀察模型對(duì)照組與受試樣品組給葡萄糖后各時(shí)間點(diǎn)（0、0.5、2 h）血糖值及血糖曲線下面積的變化。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定

采用T檢驗(yàn)、方差分析SNK檢驗(yàn)（方差齊時(shí)）及Dunnett T3檢驗(yàn)（方差不齊時(shí)）（SAS9.3軟件包），結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

血糖指標(biāo)：空腹血糖受試樣品劑量組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定對(duì)正常動(dòng)物血糖無(wú)影響。

空腹血糖指標(biāo)：模型成立的前提下，受試樣品劑量組與模型對(duì)照組比較，空腹血糖下降或血糖下降百分率升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定該受試樣品空腹血糖指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。

糖耐量指標(biāo)：模型成立的前提下，受試樣品劑量組與模型對(duì)照組比較，在給葡萄糖后0.5、2 h任一時(shí)間點(diǎn)血糖下降（或血糖下降百分率升高）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，或0、0.5、2 h血糖曲線下面積降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，判定該受試樣品糖耐量指標(biāo)結(jié)果陽(yáng)性。

結(jié)果判定：根據(jù)“保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法”中輔助降血糖功能的結(jié)果判定規(guī)則[23]，在模型成立的條件下空腹血糖和糖耐量二項(xiàng)指標(biāo)中有一項(xiàng)陽(yáng)性，且對(duì)正常動(dòng)物空腹血糖無(wú)影響即可判定該受試物輔助降血糖功能為陽(yáng)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞β-葡聚糖輔助降血糖功能評(píng)價(jià)

2.1.1 正常小鼠降血糖實(shí)驗(yàn)

正常小鼠降血糖實(shí)驗(yàn)，灌胃30天前后，各組血糖水平，如表2。

表2 對(duì)正常小鼠血糖水平的影響（±s，n=15）Table 2 Effects of blood glucose levels on normal mice

表2 對(duì)正常小鼠血糖水平的影響（±s，n=15）Table 2 Effects of blood glucose levels on normal mice

20×高劑量組/（mmol/L）灌胃前 A溶于純水 6.65±0.71 6.50±0.55 B溶于純水 6.30±0.52 B溶于15度基酒 6.85±0.52 7.23±0.49灌胃后 A溶于純水 6.79±0.79 6.65±0.42 B溶于純水 6.36±0.39 B溶于15度基酒 5.34±0.44 5.92±0.47組別 樣品 空白對(duì)照組/（mmol/L）

與空白對(duì)照組相比，青稞β-葡聚糖A和B溶于純水及15度基酒實(shí)驗(yàn)，灌胃前后，各組小鼠血糖值均無(wú)顯著差異，表明受試物對(duì)正常小鼠的空腹血糖水平無(wú)明顯影響。

2.1.2 高血糖模型小鼠降血糖實(shí)驗(yàn)

將造模成功的高血糖模型小鼠按血糖水平隨機(jī)分組，組間差不大于1.1 mmol/L，實(shí)驗(yàn)前后各組小鼠血糖值變化見表3、表4。

青稞β-葡聚糖A、B分別溶于純水的實(shí)驗(yàn)中，灌胃前后，3個(gè)劑量組血糖下降率與模型組相比具有顯著性差異，但各劑量組之間無(wú)顯著差異。青稞β-葡聚糖B溶于15度基酒灌胃實(shí)驗(yàn)中，中、高劑量組小鼠血糖下降率均不及模型組。

表3 建模成功時(shí)，各組小鼠血糖值（±s，n=15）Table 3 Levels of blood glucose on hyperglycemic mice before test

表3 建模成功時(shí)，各組小鼠血糖值（±s，n=15）Table 3 Levels of blood glucose on hyperglycemic mice before test

注：#表示與空白對(duì)照組相比，結(jié)果差異顯著（p＜0.05）。

樣品/組別空白對(duì)照組/（mmol/L）模型對(duì)照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）A 溶于純水 6.65±0.44 14.11±0.77# 13.96±0.88# 13.86±0.59# 14.20±0.62#B 溶于純水 14.18±0.75# 14.21±0.63# 14.02±0.72#B 溶于基酒 6.85±0.39 15.93±0.63# 15.96±0.91# 16.04±0.84# 15.92±0.88#

表4 灌胃30天后，各組小鼠血糖值（±s，n=15）Table 4 Levels of blood glucose on hyperglycemic mice after test

表4 灌胃30天后，各組小鼠血糖值（±s，n=15）Table 4 Levels of blood glucose on hyperglycemic mice after test

注：#表示與空白對(duì)照組相比，結(jié)果差異顯著（p＜0.05）；*表示與模型對(duì)照組相比，結(jié)果差異顯著（p＜0.05）。

血糖下降百分率/%W模型組 W低 W中 W高A 溶于純水 6.60±0.52 14.56±0.94# 10.51±0.66#* 10.09±0.41#* 11.90±0.55#* -3.19±0.82 24.71±2.58* 27.20±2.44* 16.20±1.42*B 溶于純水 11.14±0.52#* 11.23±0.55#* 11.02±0.37#* -3.19±0.69 21.44±1.17* 20.97±1.68* 21.40±3.55*B 溶于基酒 5.38±0.46 14.65±0.87# 14.09±1.01# 15.46±0.79# 15.47±0.94# 8.04±5.47 11.72±4.49 3.62±3.62 2.83±5.38樣品/組別 空白對(duì)照組/（mmol/L）模型對(duì)照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）

2.1.3 高血糖模型小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)

將青稞β-葡聚糖A、B分別溶于純水，青稞β-葡聚糖B溶于15度基酒，分別對(duì)此3個(gè)樣品進(jìn)行糖耐量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5～表7。

表5 高血糖模型小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)（A溶于純水）（±s，n=15）Table 5 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample A dissolved in water）

表5 高血糖模型小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)（A溶于純水）（±s，n=15）Table 5 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample A dissolved in water）

注：#表示與空白對(duì)照組相比，差異顯著（p＜0.05）；*表示與模型對(duì)照組相比，差異顯著（p＜0.05）。

A溶于純水空白對(duì)照組/（mmol/L）模型對(duì)照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）0 h 6.60±0.52 14.56±0.94# 10.51±0.66# 10.09±0.41# 11.90±0.55#0.5 h 7.74±0.39 23.79±2.01# 18.32±1.76#* 17.72±1.49#* 16.90±1.69#*2 h 5.42±0.60 15.47±1.22# 11.10±0.92#* 11.27±2.05#* 12.37±2.77#曲線下面積 13.46±1.67 39.03±2.27# 29.27±3.03#* 28.70±2.87#* 29.15±2.96#*

表6 高血糖模型小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)（B溶于純水）（±s，n=15）Table 6 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample B dissolved in water）

表6 高血糖模型小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)（B溶于純水）（±s，n=15）Table 6 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample B dissolved in water）

注：#表示與空白對(duì)照組相比，差異顯著（p＜0.05）；*表示與模型對(duì)照組相比，差異顯著（p＜0.05）。

B溶于純水空白對(duì)照組/（mmol/L）模型對(duì)照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）0 h 6.60±0.52 14.56±0.94# 11.14±0.52# 11.23±0.55# 11.02±0.37#0.5 h 7.74±0.39 23.79±2.21# 18.86±1.89#* 19.02±2.41#* 19.37±2.33#*2 h 5.42±0.60 15.47±1.22# 12.11±0.71#* 12.56±1.48# 12.62±0.96#曲線下面積 13.46±1.67 39.03±2.47# 30.73±2.32#* 31.25±3.27#* 31.59±2.95#*

表7 高血糖模型小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)（B溶于15度基酒）（±s，n=15）Table 7 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample B dissolved in ethanol solution）

表7 高血糖模型小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)（B溶于15度基酒）（±s，n=15）Table 7 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample B dissolved in ethanol solution）

注：#表示與空白對(duì)照組相比，差異顯著（p＜0.05）；*表示與模型對(duì)照組相比，差異顯著（p＜0.05）。

B溶于15度基酒空白對(duì)照組/（mmol/L）模型對(duì)照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）0 h 5.38±0.46 14.65±0.87# 14.09±1.01# 15.46±0.79# 15.47±0.94#0.5 h 8.02 ±0.41 22.23±3.32# 18.85±0.71#* 18.41±1.99#* 18.90±1.13#*2 h 5.76 ±0.69 12.77±1.28# 13.30±2.14# 12.29±1.55# 13.73±0.81#曲線下面積 13.69±1.47 35.47±3.48# 32.35±3.96# 31.49±6.12# 33.07±4.21#

降血糖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，灌胃給予2.0 g/kg·bw葡萄糖，糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)模型對(duì)照組0.5、2 h血糖與空白對(duì)照組相比顯著升高，提示高血糖小鼠模型成立。對(duì)于以純水為溶劑的A、B受試樣品實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)劑量組0.5h血糖值顯著低于模型組，且曲線下面積均顯著降低，而不同劑量組之間無(wú)顯著性差異，說(shuō)明A、B樣品溶于純水均具有輔助降血糖功效，但無(wú)明顯劑量效應(yīng)。B樣品溶于15度基酒實(shí)驗(yàn)中，0.5 h血糖值下降與模型組相比具有顯著性，但2 h后并不能顯著降低血糖，提示B樣品溶于15度基酒不具有輔助降血糖功能。

3 討論與結(jié)論

3.1 青稞β-葡聚糖溶解性

青稞β-葡聚糖提取物的溶解性受制備工藝、提取物純度、分子量范圍等多方面的影響。研究考察不同提取工藝（水提、堿水提、酶水解）之間β-葡聚糖的性質(zhì)差別，水及堿水提取得到的大分子β-葡聚糖，在水及醇溶液中溶解性不佳，而經(jīng)過(guò)酶切工藝得到的小分子β-葡聚糖溶解性良好；考察了不同種類的酶（糖化酶、α-淀粉酶以及雙酶聯(lián)用）對(duì)大分子β-葡聚糖的酶解效果，結(jié)果糖化酶糖化4 h對(duì)大分子片段的酶解效果并不明顯且糖化過(guò)程耗時(shí)[24]，不利于工業(yè)生產(chǎn)；考察不同比例α-淀粉酶（1%、5%、10%）對(duì)β-葡聚糖的酶解效果，結(jié)果表明添加10%α-淀粉酶后，小分子葡聚糖得率最高（得率分別為68.1%、70.4%、74.8%）；中試實(shí)驗(yàn)中采用膜過(guò)濾工藝后，β-葡聚糖轉(zhuǎn)移率為34.45%，明顯高于醇沉工藝的轉(zhuǎn)移率23.52%，且便于車間自動(dòng)化控制，王謙等[25]研究結(jié)果顯示優(yōu)化后的膜濾工藝能夠使青稞提取液中β-葡聚糖截留率達(dá)到99.2%，且起到了純化蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)的作用。最終采取堿水提取后，經(jīng)10%α-淀粉酶酶解，再經(jīng)過(guò)固定孔徑的超濾膜過(guò)濾，得到的β-葡聚糖分子量小且均勻，在50%乙醇溶液及水中的溶解性良好。

3.2 輔助降血糖作用

本實(shí)驗(yàn)研究了低分子量青稞-β葡聚糖對(duì)高血糖小鼠的輔助降血糖活性。結(jié)果表明，青稞-β葡聚糖A（未酶解）、B（酶解后）兩種提取物樣品，對(duì)正常動(dòng)物空腹血糖無(wú)顯著影響；在溶于純水的降血糖及糖耐量實(shí)驗(yàn)中，血糖下降百分率和血糖曲線下面積均具有顯著性，判定兩種樣品溶于純水具備輔助降血糖的功能；但是將青稞-β葡聚糖B（酶解后）樣品溶于15度基酒的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，血糖下降百分率及血糖曲線下面積相較于模型組均未顯著降低，提示基酒溶解的樣品不具備輔助降血糖功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，β-葡聚糖在水中溶解后具有粘性，食用后可覆蓋于胃黏膜，減緩胃腸道對(duì)葡萄糖的吸收[15，26-27]，是否改用15度基酒為溶劑后降低了溶液的粘性，從而無(wú)法減緩葡萄糖的吸收，導(dǎo)致輔助降血糖作用不明顯，還有待進(jìn)一步研究。