小分子青稞β-葡聚糖輔助降血糖功能研究

胡輝，劉鵬，程佩佩，王委，劉源才，4

（1.勁牌生物醫(yī)藥有限公司，湖北黃石435000；2.勁牌有限公司，湖北大冶435100；3.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶435100；4.勁牌研究院，湖北黃石435000）

β-葡聚糖，即（1-3）（1-4）-β-D-葡聚糖，是由 β-1，3和β-1，4糖苷鍵將D-吡喃葡萄糖基連接而成的線型均一性非淀粉多糖[1]，具有降低血液中膽固醇水平[2]、調(diào)節(jié)血糖濃度[3]、增強機體免疫力[4]等重要的生理功能。美國食品藥品管理局已頒發(fā)相關(guān)條例，認可在食品中添加β-葡聚糖組分有利于人們健康[5]，英、法等國食藥監(jiān)局不但允許在含大麥的產(chǎn)品包裝上標(biāo)明該類食物能減少患冠心病風(fēng)險，還強制規(guī)定“一般成人日均攝入食品中β-葡聚糖絕對量不低于3 g”的指標(biāo)[6]。隨著高血壓、高血脂、肥胖、糖尿病等“現(xiàn)代文明病”的高發(fā)，膳食纖維的需求量日漸旺盛。青藏高原特殊的生態(tài)條件賦予了青稞在世界范圍內(nèi)擁有最高β-葡聚糖含量[7-8]的寶貴特征，青稞β-葡聚糖的研究與利用對青稞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

然而青稞β-葡聚糖是青稞籽粒胚乳細胞壁的主要成分，占胚乳細胞壁干重的75%左右，是一類非淀粉多糖[9]。與纖維素結(jié)構(gòu)類似，其中就有超過10個葡萄糖分子以β-1，4糖苷鍵連接的β-葡聚糖片段，該結(jié)構(gòu)片段在水及乙醇中溶解性極低[10]，影響產(chǎn)品穩(wěn)定性和消費者體驗。另有學(xué)者研究顯示，餐后血糖指數(shù)與胰島素反應(yīng)受β-葡聚糖分子量的影響[11]，分子量為40 000[12]及100 000[13]的β-葡聚糖提取物無顯著降低餐后血糖的效果，而分子量為70 000[12]的β-葡聚糖提取物具有顯著降低餐后血糖的效果，推測其降血糖功效可能與分子量關(guān)系密切，因此特定分子量的β-葡聚糖需進行藥理活性研究。

現(xiàn)行的提取工藝分為3類，分別為水提法[14-17]、堿提法[18-19]和酸提法[20-21]，水提法得到的葡聚糖分子片段最完整，但分子量大小不齊，且含有難溶大分子片段，提取物在水及乙醇溶液中的穩(wěn)定性不好，易沉淀；堿提法和酸提法對不溶性葡聚糖提取效果較好，但水解產(chǎn)物的分子量不易控制，且酸提法得到的提取物降低了提取物的黏度，可能影響其功能活性。鑒于此，本課題組將從工藝和藥效方面解決以下問題：1）采用先堿提再酶解的方法，解決青稞β-葡聚糖分子量大和在水及乙醇溶液中溶解性不好的問題，拓展青稞β-葡聚糖在飲料行業(yè)中的應(yīng)用；2）以酶解前后青稞β-葡聚糖為受試樣品進行動物實驗，研究酶解后產(chǎn)物的輔助降血糖功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試樣品的制備方法

青稞β-葡聚糖A（未酶解樣品）：將青稞粉碎后用80%乙醇回流2 h脫脂，棄去乙醇液，加4倍量水混勻后，飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH值至8.5～9.0，（75±5）℃提取2 h，提取液加入10%的鹽酸調(diào)pH 4.5，冷卻后離心（16 000 r/min），將離心清液干燥即得。

青稞β-葡聚糖B（酶解后樣品）：青稞粉碎后用80%乙醇回流2 h脫脂，棄去乙醇液，加4倍量水混勻后，飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH值至8.5～9.0，（75±5）℃提取2 h，提取液加入10%的鹽酸調(diào)pH 4.5，冷卻后離心（16 000 r/min），離心清液pH值用飽和碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)調(diào)至7.0，加入10%α-淀粉酶，在50℃下酶解4 h，煮沸30 min殺酶，冷卻，上清液經(jīng)過超濾膜純化，收集截留液，干燥即得。

1.1.2 材料及儀器

KM小鼠（SPF等級，雌性，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2011-0003，合格證號 43004700016013）：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；小鼠于湖北師范大學(xué)動物實驗房養(yǎng)殖，環(huán)境溫度20℃～26℃，相對濕度40%～70%，光照12 h/d；輻照小鼠繁殖飼料：湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

JPS-6型系列手持式全血葡萄糖測試儀、虹吸式血糖試條：北京怡成生物電子技術(shù)有限公司；小鼠灌胃針：武漢恒康醫(yī)療器械有限公司。

1.1.3 樣品及試劑

青稞β-葡聚糖提取物樣品A、B（黃色粉末，2.25 kg/袋）人體推薦攝入量7.8 g/d，按成人60 kg.bw計為130 mg/kg·bw、15度基酒（10瓶，5 L/瓶）：均由湖北勁牌生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；鏈脲佐菌素：Sigma；中溫α-淀粉酶（酶活力3 000 U/g）：山東蘇柯漢生物工程股份有限公司；其他試劑均為分析純。

檸檬酸緩沖液：稱取2.1 g檸檬酸（相對分子量210.4）溶于雙蒸水，定容至100 mL，配成A液。稱取2.94 g檸檬酸鈉（相對分子量294.10）溶于雙蒸水，定容至100 mL，配成B液。用時將A液和B液按照1∶1.32（體積比）混合，即配成檸檬酸緩沖液。鏈脲佐菌素溶液：用檸檬酸緩沖液配置，現(xiàn)配現(xiàn)用，遮光置于冰上，30 min內(nèi)，必須注射完畢。

青稞葡聚糖A（批號20141008）、青稞葡聚糖B（批號20150416）樣品均委托青島科標(biāo)化工分析有限公司檢測，檢測結(jié)果見表1。

表1 青稞β-葡聚糖樣品平均分子量和純度Table 1 Average molecular weight and purity quotient of hull-less barley β-glucan

青稞β-葡聚糖酶解后（B）相較于未酶解（A）產(chǎn)物，在50%乙醇溶液和純水溶液中澄清透明，不顯乳白色渾濁狀態(tài)，顯示酶解后產(chǎn)物溶解性良好（葡聚糖濃度為5%）。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法

1.2.1.1 正常小鼠降血糖實驗

75只KM小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按禁食不禁水7 h～8 h的血糖水平隨機分組，分別為：空白對照組（15度基酒、純水）、3個樣品組（15度基酒+B、純水+B、純水+A），15只/組，共5組?？瞻讓φ战M給予同體積溶劑（15度基酒、純水），3個樣品組給予20倍人體推薦量，連續(xù)灌胃30 d，灌胃體積為0.4 mL，測空腹血糖值（禁食同實驗前），比較各組動物血糖值。

1.2.1.2 高血糖（1型糖尿病）模型小鼠降血糖實驗

隨機取15只KM小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，禁食7 h～8 h，測空腹血糖，作為該批次小鼠基礎(chǔ)血糖值。隨后取200只待造模小鼠，禁食12 h以上（自由飲水），注射鏈脲佐菌素（用前新鮮配制）造模，小鼠腹腔注射80 mg/kg.BW，連續(xù)注射兩天。5 d～7 d后小鼠禁食7 h～8 h，測血糖，血糖值 10 mmol/L～25 mmol/L[22]的小鼠，判斷高血糖模型建立成功。

取165只成功的高血糖模型小鼠按禁食7 h～8 h的血糖水平（組間差不大于1.1 mmol/L）隨機分組，分別為：2個模型對照組（15度基酒、純水）、9個樣品組（15度基酒+B、純水+B、純水+A），15只/組，共 11組。樣品組分別給予低中高3個劑量，劑量濃度依次為5、10、20倍人體推薦量，模型對照組分別給予同體積溶劑（15度基酒、純水），連續(xù)灌胃30 d，測空腹血糖值（禁食同實驗前），比較各組動物血糖值及血糖下降百分率。

1.2.1.3 高血糖模型小鼠糖耐量實驗

高血糖模型小鼠（降血糖實驗），連續(xù)灌胃30 d后，測空腹血糖值（禁食同實驗前），作為給葡萄糖前（即0 d）血糖值，15 min～20 min后各組經(jīng)口給予葡萄糖2.0 g/kg·bw，測定給葡萄糖后各組0.5、2 h的血糖值，觀察模型對照組與受試樣品組給葡萄糖后各時間點（0、0.5、2 h）血糖值及血糖曲線下面積的變化。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析及結(jié)果判定

采用T檢驗、方差分析SNK檢驗（方差齊時）及Dunnett T3檢驗（方差不齊時）（SAS9.3軟件包），結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

血糖指標(biāo)：空腹血糖受試樣品劑量組與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，判定對正常動物血糖無影響。

空腹血糖指標(biāo)：模型成立的前提下，受試樣品劑量組與模型對照組比較，空腹血糖下降或血糖下降百分率升高有統(tǒng)計學(xué)意義，判定該受試樣品空腹血糖指標(biāo)結(jié)果陽性。

糖耐量指標(biāo)：模型成立的前提下，受試樣品劑量組與模型對照組比較，在給葡萄糖后0.5、2 h任一時間點血糖下降（或血糖下降百分率升高）有統(tǒng)計學(xué)意義，或0、0.5、2 h血糖曲線下面積降低有統(tǒng)計學(xué)意義，判定該受試樣品糖耐量指標(biāo)結(jié)果陽性。

結(jié)果判定：根據(jù)“保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗方法”中輔助降血糖功能的結(jié)果判定規(guī)則[23]，在模型成立的條件下空腹血糖和糖耐量二項指標(biāo)中有一項陽性，且對正常動物空腹血糖無影響即可判定該受試物輔助降血糖功能為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞β-葡聚糖輔助降血糖功能評價

2.1.1 正常小鼠降血糖實驗

正常小鼠降血糖實驗，灌胃30天前后，各組血糖水平，如表2。

表2 對正常小鼠血糖水平的影響（±s，n=15）Table 2 Effects of blood glucose levels on normal mice

表2 對正常小鼠血糖水平的影響（±s，n=15）Table 2 Effects of blood glucose levels on normal mice

20×高劑量組/（mmol/L）灌胃前 A溶于純水 6.65±0.71 6.50±0.55 B溶于純水 6.30±0.52 B溶于15度基酒 6.85±0.52 7.23±0.49灌胃后 A溶于純水 6.79±0.79 6.65±0.42 B溶于純水 6.36±0.39 B溶于15度基酒 5.34±0.44 5.92±0.47組別 樣品 空白對照組/（mmol/L）

與空白對照組相比，青稞β-葡聚糖A和B溶于純水及15度基酒實驗，灌胃前后，各組小鼠血糖值均無顯著差異，表明受試物對正常小鼠的空腹血糖水平無明顯影響。

2.1.2 高血糖模型小鼠降血糖實驗

將造模成功的高血糖模型小鼠按血糖水平隨機分組，組間差不大于1.1 mmol/L，實驗前后各組小鼠血糖值變化見表3、表4。

青稞β-葡聚糖A、B分別溶于純水的實驗中，灌胃前后，3個劑量組血糖下降率與模型組相比具有顯著性差異，但各劑量組之間無顯著差異。青稞β-葡聚糖B溶于15度基酒灌胃實驗中，中、高劑量組小鼠血糖下降率均不及模型組。

表3 建模成功時，各組小鼠血糖值（±s，n=15）Table 3 Levels of blood glucose on hyperglycemic mice before test

表3 建模成功時，各組小鼠血糖值（±s，n=15）Table 3 Levels of blood glucose on hyperglycemic mice before test

注：#表示與空白對照組相比，結(jié)果差異顯著（p＜0.05）。

樣品/組別空白對照組/（mmol/L）模型對照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）A 溶于純水 6.65±0.44 14.11±0.77# 13.96±0.88# 13.86±0.59# 14.20±0.62#B 溶于純水 14.18±0.75# 14.21±0.63# 14.02±0.72#B 溶于基酒 6.85±0.39 15.93±0.63# 15.96±0.91# 16.04±0.84# 15.92±0.88#

表4 灌胃30天后，各組小鼠血糖值（±s，n=15）Table 4 Levels of blood glucose on hyperglycemic mice after test

表4 灌胃30天后，各組小鼠血糖值（±s，n=15）Table 4 Levels of blood glucose on hyperglycemic mice after test

注：#表示與空白對照組相比，結(jié)果差異顯著（p＜0.05）；*表示與模型對照組相比，結(jié)果差異顯著（p＜0.05）。

血糖下降百分率/%W模型組 W低 W中 W高A 溶于純水 6.60±0.52 14.56±0.94# 10.51±0.66#* 10.09±0.41#* 11.90±0.55#* -3.19±0.82 24.71±2.58* 27.20±2.44* 16.20±1.42*B 溶于純水 11.14±0.52#* 11.23±0.55#* 11.02±0.37#* -3.19±0.69 21.44±1.17* 20.97±1.68* 21.40±3.55*B 溶于基酒 5.38±0.46 14.65±0.87# 14.09±1.01# 15.46±0.79# 15.47±0.94# 8.04±5.47 11.72±4.49 3.62±3.62 2.83±5.38樣品/組別 空白對照組/（mmol/L）模型對照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）

2.1.3 高血糖模型小鼠糖耐量實驗

將青稞β-葡聚糖A、B分別溶于純水，青稞β-葡聚糖B溶于15度基酒，分別對此3個樣品進行糖耐量實驗，結(jié)果見表5～表7。

表5 高血糖模型小鼠糖耐量實驗（A溶于純水）（±s，n=15）Table 5 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample A dissolved in water）

表5 高血糖模型小鼠糖耐量實驗（A溶于純水）（±s，n=15）Table 5 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample A dissolved in water）

注：#表示與空白對照組相比，差異顯著（p＜0.05）；*表示與模型對照組相比，差異顯著（p＜0.05）。

A溶于純水空白對照組/（mmol/L）模型對照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）0 h 6.60±0.52 14.56±0.94# 10.51±0.66# 10.09±0.41# 11.90±0.55#0.5 h 7.74±0.39 23.79±2.01# 18.32±1.76#* 17.72±1.49#* 16.90±1.69#*2 h 5.42±0.60 15.47±1.22# 11.10±0.92#* 11.27±2.05#* 12.37±2.77#曲線下面積 13.46±1.67 39.03±2.27# 29.27±3.03#* 28.70±2.87#* 29.15±2.96#*

表6 高血糖模型小鼠糖耐量實驗（B溶于純水）（±s，n=15）Table 6 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample B dissolved in water）

表6 高血糖模型小鼠糖耐量實驗（B溶于純水）（±s，n=15）Table 6 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample B dissolved in water）

注：#表示與空白對照組相比，差異顯著（p＜0.05）；*表示與模型對照組相比，差異顯著（p＜0.05）。

B溶于純水空白對照組/（mmol/L）模型對照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）0 h 6.60±0.52 14.56±0.94# 11.14±0.52# 11.23±0.55# 11.02±0.37#0.5 h 7.74±0.39 23.79±2.21# 18.86±1.89#* 19.02±2.41#* 19.37±2.33#*2 h 5.42±0.60 15.47±1.22# 12.11±0.71#* 12.56±1.48# 12.62±0.96#曲線下面積 13.46±1.67 39.03±2.47# 30.73±2.32#* 31.25±3.27#* 31.59±2.95#*

表7 高血糖模型小鼠糖耐量實驗（B溶于15度基酒）（±s，n=15）Table 7 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample B dissolved in ethanol solution）

表7 高血糖模型小鼠糖耐量實驗（B溶于15度基酒）（±s，n=15）Table 7 Test of glucose tolerance on hyperglycemic mice（sample B dissolved in ethanol solution）

注：#表示與空白對照組相比，差異顯著（p＜0.05）；*表示與模型對照組相比，差異顯著（p＜0.05）。

B溶于15度基酒空白對照組/（mmol/L）模型對照組/（mmol/L）5×低劑量組/（mmol/L）10×中劑量組/（mmol/L）20×高劑量組/（mmol/L）0 h 5.38±0.46 14.65±0.87# 14.09±1.01# 15.46±0.79# 15.47±0.94#0.5 h 8.02 ±0.41 22.23±3.32# 18.85±0.71#* 18.41±1.99#* 18.90±1.13#*2 h 5.76 ±0.69 12.77±1.28# 13.30±2.14# 12.29±1.55# 13.73±0.81#曲線下面積 13.69±1.47 35.47±3.48# 32.35±3.96# 31.49±6.12# 33.07±4.21#

降血糖實驗結(jié)束后，灌胃給予2.0 g/kg·bw葡萄糖，糖耐量實驗結(jié)束時模型對照組0.5、2 h血糖與空白對照組相比顯著升高，提示高血糖小鼠模型成立。對于以純水為溶劑的A、B受試樣品實驗中，3個劑量組0.5h血糖值顯著低于模型組，且曲線下面積均顯著降低，而不同劑量組之間無顯著性差異，說明A、B樣品溶于純水均具有輔助降血糖功效，但無明顯劑量效應(yīng)。B樣品溶于15度基酒實驗中，0.5 h血糖值下降與模型組相比具有顯著性，但2 h后并不能顯著降低血糖，提示B樣品溶于15度基酒不具有輔助降血糖功能。

3 討論與結(jié)論

3.1 青稞β-葡聚糖溶解性

青稞β-葡聚糖提取物的溶解性受制備工藝、提取物純度、分子量范圍等多方面的影響。研究考察不同提取工藝（水提、堿水提、酶水解）之間β-葡聚糖的性質(zhì)差別，水及堿水提取得到的大分子β-葡聚糖，在水及醇溶液中溶解性不佳，而經(jīng)過酶切工藝得到的小分子β-葡聚糖溶解性良好；考察了不同種類的酶（糖化酶、α-淀粉酶以及雙酶聯(lián)用）對大分子β-葡聚糖的酶解效果，結(jié)果糖化酶糖化4 h對大分子片段的酶解效果并不明顯且糖化過程耗時[24]，不利于工業(yè)生產(chǎn)；考察不同比例α-淀粉酶（1%、5%、10%）對β-葡聚糖的酶解效果，結(jié)果表明添加10%α-淀粉酶后，小分子葡聚糖得率最高（得率分別為68.1%、70.4%、74.8%）；中試實驗中采用膜過濾工藝后，β-葡聚糖轉(zhuǎn)移率為34.45%，明顯高于醇沉工藝的轉(zhuǎn)移率23.52%，且便于車間自動化控制，王謙等[25]研究結(jié)果顯示優(yōu)化后的膜濾工藝能夠使青稞提取液中β-葡聚糖截留率達到99.2%，且起到了純化蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)的作用。最終采取堿水提取后，經(jīng)10%α-淀粉酶酶解，再經(jīng)過固定孔徑的超濾膜過濾，得到的β-葡聚糖分子量小且均勻，在50%乙醇溶液及水中的溶解性良好。

3.2 輔助降血糖作用

本實驗研究了低分子量青稞-β葡聚糖對高血糖小鼠的輔助降血糖活性。結(jié)果表明，青稞-β葡聚糖A（未酶解）、B（酶解后）兩種提取物樣品，對正常動物空腹血糖無顯著影響；在溶于純水的降血糖及糖耐量實驗中，血糖下降百分率和血糖曲線下面積均具有顯著性，判定兩種樣品溶于純水具備輔助降血糖的功能；但是將青稞-β葡聚糖B（酶解后）樣品溶于15度基酒的動物實驗中，血糖下降百分率及血糖曲線下面積相較于模型組均未顯著降低，提示基酒溶解的樣品不具備輔助降血糖功能。有文獻報道，β-葡聚糖在水中溶解后具有粘性，食用后可覆蓋于胃黏膜，減緩胃腸道對葡萄糖的吸收[15，26-27]，是否改用15度基酒為溶劑后降低了溶液的粘性，從而無法減緩葡萄糖的吸收，導(dǎo)致輔助降血糖作用不明顯，還有待進一步研究。