兩種蘆筍不同部位酚類物質(zhì)及抗氧化活性研究

尹培培，楊靈光，王桂宏，3，趙福江，4，賈愛(ài)榮，趙魯豫，劉永，劉昌衡，*

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）生物研究所，山東濟(jì)南250103；2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京100083；3.煙臺(tái)大境生態(tài)環(huán)境科技股份有限公司，山東煙臺(tái)264003；4.山東極貝爾生物科技有限公司，山東濟(jì)南250014；5.菏澤巨鑫源食品有限公司，山東菏澤274400）

蘆筍（Asparagus officinalis L.）又名石刁柏、龍須菜，為百合科天門冬屬多年生草本植物[1]。其嫩莖鮮美芳香，富含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、胡蘿卜素、尼克酸、維生素、多種微量元素、酞胺及鹽類等多種營(yíng)養(yǎng)成分，并能夠促進(jìn)消化增進(jìn)食欲，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，因此被列為世界“十大名菜”之一，素有“蔬菜大王”的美稱[2]。除此之外，蘆筍還富含以蘆丁為主的黃酮等次生代謝產(chǎn)物[3]，因而具有抗腫瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力、抗衰老、抗疲勞等活性功能[4-6]。營(yíng)養(yǎng)學(xué)家和素食界人士均稱它是健康食品和全面的抗癌食品。

蘆筍品種很多，從顏色上可粗略分為綠蘆筍和白蘆筍兩大類[7]。綠蘆筍是完全光合作用的產(chǎn)物，而白蘆筍的整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程完全避光。綠蘆筍中維生素、葉酸、胡蘿卜素、膳食纖維、蛋白質(zhì)和碳水化合物等含量比較高，白蘆筍則含有比較多的微量元素、礦物質(zhì)元素及比例恰當(dāng)?shù)陌被?。然而，目前?duì)兩種蘆筍中酚類成分及其抗氧化活性的研究還比較匱乏。本文對(duì)兩種蘆筍不同部位的總酚、總黃酮、總單寧、縮合單寧和蘆丁含量，以及抗氧化活性進(jìn)行比較，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行分析，為衡量蘆筍的品質(zhì)、食用與藥用價(jià)值等提供科學(xué)依據(jù)，為綠蘆筍和白蘆筍的深度開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠蘆筍、白蘆筍：菏澤巨鑫源食品有限公司，采集新鮮的白蘆筍和綠蘆筍，清水洗凈基部污垢，將兩種蘆筍均分為蘆筍尖和蘆筍莖兩部分，得到綠蘆筍尖和綠蘆筍莖、白蘆筍尖和白蘆筍莖4組樣品。立即放入105℃烘箱15 min進(jìn)行滅酶，然后置于50℃烘箱干燥至恒重。采用中藥粉碎機(jī)將樣品粉碎，過(guò)120目篩，保存至-20℃冰箱備用。

ABTS、DPPH、6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（水溶性維生素E，即Trolox）、福林酚溶液：美國(guó)Sigma公司；乙腈（色譜級(jí)）：美國(guó)Fisher公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)食品藥品檢定研究院；其它試劑均為分析純級(jí)別。

5804R型臺(tái)式離心機(jī)：德國(guó)艾本德；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Infinite M200 Pro型多功能酶標(biāo)儀：瑞士TECAN；KQ-400KDF型超聲波提取儀：江蘇昆山超聲儀器有限公司；LC-20A液相色譜儀：日本島津。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆筍酚類物質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱取每份為1.000 g的蘆筍樣品各3份，置于50 mL離心管中，分別加入10 mL濃度為80%的乙醇水溶液，搖勻，置于超聲波提取儀中超聲提取30 min，冷卻至室溫，過(guò)濾；殘?jiān)貜?fù)以上步驟提取兩次，合并3次濾液。用乙醇水溶液定容至30 mL，此溶液用于測(cè)定分析總酚、總黃酮、總單寧和縮合單寧的含量、各種抗氧化活性及蘆丁含量。

1.2.2 總酚及總單寧含量的測(cè)定

總酚含量的測(cè)定：將40 μL福林酚溶液加到96孔板中，再加入20 μL樣品、空白及標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合均勻；室溫孵育5 min，加入140 μL的Na2CO3溶液，混合均勻；置于40℃烘箱中避光孵育30 min后，于765 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度值（OD）為縱坐標(biāo)（y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被測(cè)樣品溶液中沒(méi)食子酸濃度當(dāng)量，總酚含量以沒(méi)食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）表示，結(jié)果表達(dá)為mg GAE/g干重。

總單寧含量的測(cè)定：將100mg干酪素加入到25mL待測(cè)樣品溶液，于室溫條件下，150 r/min振搖3 h，過(guò)0.45 μm濾膜，上清液用于總單寧的測(cè)定，測(cè)定方法同總酚?？倖螌幒恳詻](méi)食子酸當(dāng)量（GAE）表示，表達(dá)為mg GAE/g干重。

1.2.3 總黃酮含量測(cè)定

將120 μL樣品、空白及標(biāo)準(zhǔn)品溶液加到96孔板中，加入8 μL亞硝酸鈉溶液，混合均勻，室溫孵育6 min，加入 8 μL 的 AlCl3溶液，混合均勻，室溫孵育5 min，最后加入100 μL的NaOH溶液混勻，室溫避光孵育30 min，用酶標(biāo)儀于410 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度值（OD）為縱坐標(biāo)（y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算被測(cè)樣品溶液中蘆丁濃度當(dāng)量，總黃酮含量用蘆丁當(dāng)量（rutin equivalent，RE）表示，表達(dá)為 mg RE/g干重。

1.2.4 縮合單寧測(cè)定

將20 μL樣品、空白及標(biāo)準(zhǔn)品溶液加到96孔板中，加入120 μL 4%的香草醛甲醇溶液，混合均勻，200 r/min震蕩 1 min，加入 60 μL 的濃 HCl，混合均勻，200 r/min震蕩5 min，室溫避光孵育15 min，用酶標(biāo)儀于500 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。以兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度值（OD）為縱坐標(biāo)（y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出被測(cè)樣品溶液中兒茶素濃度當(dāng)量，縮合單寧的含量用兒茶素當(dāng)量（catechin equivalent，CE）表示，表達(dá)為 mg CE/g干重。

1.2.5 抗氧化能力測(cè)定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力

將10 μL的Trolox、樣品及空白溶液加到96孔板中，加入40 μL新鮮配制的DPPH甲醇溶液，混合均勻后加入190 μL的甲醇溶液，200 r/min振搖1 min；室溫避光孵育30 min。用酶標(biāo)儀于517 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。自由基清除活性（radical scavenging activity，RSA）/%=（AO-AS）/AO×100，AS為樣品溶液吸光度值，AO為空白溶液吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DPPH自由基清除能力。結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干重。

1.2.5.2 ABST自由基清除能力

將5 μL的Trolox、樣品及空白溶液加到96孔板中，再加入200 μL新鮮配制的ABTS+·工作液，室溫避光孵育5 min。用酶標(biāo)儀于734 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。自由基清除活性RSA/%=（AO-AS）/AO×100，AS為樣品溶液吸光度值，AO為空白溶液吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ABTS自由基清除能力。結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干重。

1.2.5.3 還原力

準(zhǔn)確量取0.4 mL待測(cè)樣品溶液或空白溶液，再加入 1 mL磷酸緩沖液及1 mL鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]）溶液，混合均勻，于50℃水浴孵育20 min；再加入0.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，室溫孵育10 min。取上述溶液1 mL，加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%氯化鐵溶液，均勻混合，用分光光度計(jì)于700 nm處測(cè)定吸光度值。溶液的吸光度值越高，還原力越強(qiáng)，反之越弱。結(jié)果表示為Trolox當(dāng)量（Trolox equivalent，TE）μmol/g干重。

1.2.6 蘆筍提取物的指紋圖譜及蘆丁含量測(cè)定

蘆筍提取物的指紋圖譜及蘆丁含量測(cè)定的HPLC條件：色譜柱采用Eclipse XDB-C18 column（Agilent，250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相 A-水/甲酸（99.6 ∶0.4）和流動(dòng)相B-乙腈，流速為1 mL/min；梯度洗脫程序?yàn)椋?～30 min，5%B～20%B；30 min～38 min，20%B～21%B；38 min～40 min，21%B；40 min～50 min，21%B～40%B；50 min～70 min，40%B～80%B。進(jìn)樣體積為 10 μL，柱溫箱為35°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。批處理時(shí)，兩針之間用100%B沖洗20 min，并用起始條件穩(wěn)定10 min。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），試驗(yàn)至少重復(fù)3次。數(shù)據(jù)的顯著性差異（t檢驗(yàn)：等方差雙尾檢驗(yàn)）采用Microsoft Excel數(shù)據(jù)分析軟件。P＜0.05差異顯著，P＜0.01差異極顯著。相關(guān)性分析采用Windows SPSS 17.0版本，相關(guān)系數(shù)選項(xiàng)選用Pearson檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆筍中總酚、總黃酮、總單寧和縮合單寧的含量

2.1.1 沒(méi)食子酸、蘆丁和兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線

為避免傳統(tǒng)有毒有機(jī)試劑的影響，本研究采用乙醇水溶液提取蘆筍中的酚類物質(zhì)[8]。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，80%乙醇水溶液提取效果最好，提取液中酚類物質(zhì)的含量最高，因此采用80%乙醇水溶液提取蘆筍中的酚類物質(zhì)。

為了準(zhǔn)確測(cè)定白蘆筍莖、白蘆筍尖、綠蘆筍莖和綠蘆筍尖4個(gè)樣品中總酚、總黃酮、總單寧和縮合單寧的含量，分別建立沒(méi)食子酸、蘆丁和兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

如圖1所示，圖1A為測(cè)定總酚和總單寧所用的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=0.005 5x+0.062 7，R2=0.999 0，表明沒(méi)食子酸濃度在 0～300 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；圖1B為測(cè)定總黃酮所用的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=0.003 7x+0.049 2，R2=0.999 7，表明蘆丁濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；圖1C為測(cè)定縮合單寧所用的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y=0.001 3x+0.060 3，R2=0.996 3，表明兒茶素在0～300 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 測(cè)定總酚、總單寧、總黃酮和縮合單寧所建立的沒(méi)食子酸、蘆丁和兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curves of gallic acid，rutin and catechin for total phenols and tannins，flavonoids，and condensed tannins assay

2.1.2 總酚、總黃酮、總單寧和縮合單寧的含量

通過(guò)測(cè)定4個(gè)蘆筍樣品中的總單寧及縮合單寧含量發(fā)現(xiàn)：白蘆筍莖、白蘆筍尖、綠蘆筍莖及綠蘆筍尖均不含單寧及縮合單寧，這說(shuō)明蘆筍可食用嫩莖部分不含單寧類物質(zhì)，這也是蘆筍口感好、味道鮮美脆嫩的原因。白蘆筍和綠蘆筍兩個(gè)部位總酚和總黃酮的含量見(jiàn)圖2。

由圖2可知，白蘆筍和綠蘆筍提取物中總酚（圖2A）和總黃酮（圖2B）的含量具有顯著性差異。由圖2A可知，白蘆筍莖、白蘆筍尖、綠蘆筍莖和綠蘆筍尖中總酚含量之間均具有顯著性差異，其含量從高到低依次為：綠蘆筍尖＞綠蘆筍莖＞白蘆筍尖＞白蘆筍莖。由圖2B可知，白蘆筍莖和白蘆筍尖之間總黃酮含量沒(méi)有顯著性差異，而綠蘆筍莖和綠蘆筍尖之間黃酮含量具有顯著性差異，其含量由高到低依次為：綠蘆筍尖＞綠蘆筍莖＞白蘆筍尖≈白蘆筍莖。由此可得，綠蘆筍樣品（莖和尖）中總酚和總黃酮含量顯著高于白蘆筍樣品（莖和尖），而蘆筍尖的總酚和總黃酮含量高于蘆筍莖。本研究采用的白蘆筍和綠蘆筍為同一品種，其唯一區(qū)別在于綠蘆筍經(jīng)過(guò)正常光合作用呈現(xiàn)出綠色，而白蘆筍在整個(gè)生長(zhǎng)周期里全部在地底下，避光生長(zhǎng)所以呈現(xiàn)白色。在自然界中，黃酮類化合物是大多數(shù)植物體自身存在的一類最主要的抗紫外化合物，它能夠有效吸收紫外線，使植物體器官組織，尤其是光合作用組織免受或少受輻射損害[9]。因此推測(cè)光照有利于蘆筍中黃酮類化合物的合成，從而導(dǎo)致綠蘆筍中總酚及總黃酮含量均高于白蘆筍。

圖2 白蘆筍和綠蘆筍兩個(gè)部位總酚和總黃酮的含量Fig.2 Contents of total phenols and total flavonoids in different parts of white and green asparagus

2.2 蘆筍3種抗氧化活性測(cè)定

植物中存在的酚類物質(zhì)，如黃酮、酚酸及單寧等，是其發(fā)揮抗氧化活性的主要因素[10]。研究表明，不同抗氧化劑存在不同的抗氧化機(jī)制，因此單一的抗氧化方法很難全面反映包含多種化合物的植物提取物的抗氧化能力[11-12]，因此本文采用了DPPH自由基及ABTS自由基清除能力和還原力測(cè)定3種試驗(yàn)方法。為了準(zhǔn)確測(cè)定各樣品的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力和還原力，Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如圖3A～3C所示：y=0.228 5x+1.014 7，R2=0.996 8；y=0.236 2x+1.867 2，R2=0.992 7；y=0.002 2x+0.045 2，R2=0.997 8，且 Trolox濃度在0～400 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4種樣品的DPPH自由基、ABTS自由基清除能力及還原力如圖3D～3F所示，自由基的清除能力變化越快，表示物質(zhì)的氫原子供給能力越強(qiáng)[13]。3種抗氧化結(jié)果顯示，4種樣品的抗氧化能力顯著不同，且趨勢(shì)一致：綠蘆筍尖＞綠蘆筍莖＞白蘆筍尖＞白蘆筍莖。并且，樣品抗氧化能力趨勢(shì)與其總酚含量趨勢(shì)相同。因此，初步推測(cè)，蘆筍抗氧化能力的強(qiáng)弱與其總酚含量有關(guān)，總酚含量越多，抗氧化能力越強(qiáng)，反之，抗氧化能力越弱。

圖3 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線及兩種蘆筍不同部位的DPPH、ABTS自由基清除能力和還原力Fig.3 Standard curves of Trolox and antioxidant capacity of different parts of white and green asparagus by DPPH，ABTS free radical scavenging abilities and reducing power

A.DPPH自由基Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.ABTS自由基Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線；

C.還原力Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線；D.DPPH自由基清除能力；E.ABTS自由基清除能力；F.還原力；不同字母為差異顯著P＜0.05。

2.3 蘆筍提取物的指紋圖譜及蘆丁含量分析

為了探究蘆筍提取物中酚類物質(zhì)的組成差異，采用HPLC法構(gòu)建白蘆筍莖、白蘆筍尖、綠蘆筍莖及綠蘆筍尖提取物的指紋圖譜，并測(cè)定樣品中蘆丁含量。圖4和圖5分別為4種蘆筍樣品相同濃度下的HPLC指紋圖譜和蘆丁含量圖。

圖4 蘆丁標(biāo)樣和4個(gè)蘆筍樣品的HPLC指紋圖譜Fig.4 HPLC profiles of rutin and four asparagus samples

由圖4可知，蘆筍含有多種酚類物質(zhì)，且蘆丁含量最高，是蘆筍中主要的酚類物質(zhì)，這與Shou等的研究結(jié)果一致[14]；綠蘆筍樣品中酚類物質(zhì)的種類及含量均顯著高于白蘆筍樣品，且綠蘆筍尖中酚類物質(zhì)及含量最高，白蘆筍莖中最低，這與4種蘆筍樣品中總酚及3種抗氧化趨勢(shì)是一致的。由圖5可知，綠蘆筍尖提取物中蘆丁含量最高（5.261±0.021）mg/g，其次是綠蘆筍莖（1.302±0.011）mg/g、白蘆筍尖（0.090±0.002）mg/g、白蘆筍莖（0.025±0.001）mg/g。以上結(jié)果說(shuō)明，蘆筍的抗氧化能力不僅與酚類物質(zhì)的含量有關(guān)，并且也與其活性物質(zhì)的組成有關(guān)。

圖5 HPLC法測(cè)定4種蘆筍樣品中蘆丁含量Fig.5 HPLC was used to determine rutin contents in four asparagus samples

2.4 蘆筍中總酚、總黃酮、蘆丁含量及其抗氧化能力相關(guān)性分析

總酚、總黃酮、蘆丁含量、DPPH自由基和ABTS自由基清除活性及還原力之間的相關(guān)性見(jiàn)表1。

表1 相關(guān)性分析Table 1 Correlation analyses

如表1所示，總酚、總黃酮、蘆丁、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力兩兩之間都顯著正相關(guān)，并且總酚和DPPH自由基和ABTS自由基清除能力之間、總黃酮和蘆丁之間、蘆丁和DPPH自由基清除活性之間、DPPH自由基與ABTS自由基清除能力之間都極顯著正相關(guān)。以上結(jié)果說(shuō)明蘆筍中的酚類物質(zhì)是抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)者。此外，還原力與總酚、總黃酮、蘆丁、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力之間具有較高的相關(guān)系數(shù)，但沒(méi)有顯著相關(guān)性。以上結(jié)果說(shuō)明，蘆筍中的酚類物質(zhì)與DPPH自由基、ABTS自由基清除活性密切相關(guān)。該結(jié)果與之前的報(bào)道一致，植物中的多酚、黃酮等物質(zhì)的含量與其抗氧化活性相關(guān)[15-16]。因此，綠蘆筍中總酚、總黃酮的含量高，其抗氧化性較強(qiáng)，反之，白蘆筍的抗氧化性較弱。

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取兩種蘆筍中的酚類物質(zhì)，結(jié)果顯示：綠蘆筍和白蘆筍均不含單寧類物質(zhì)?？偡印⒖傸S酮、總單寧、縮合單寧及HPLC結(jié)果表明，綠蘆筍樣品中酚類物質(zhì)的種類、含量及抗氧化活性均顯著高于白蘆筍樣品；并且兩種蘆筍尖中酚類物質(zhì)的含量及抗氧化活性均高于蘆筍莖。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，蘆筍中酚類物質(zhì)含量與DPPH自由基、ABTS自由基清除活性顯著相關(guān)。綜上所述，蘆筍種類及部位對(duì)其抗氧化活性具有顯著的影響，這為蘆筍的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。然而，除蘆丁外，蘆筍中其它抗氧化活性貢獻(xiàn)基礎(chǔ)還不清楚，這需要通過(guò)進(jìn)一步的分離提純及物質(zhì)鑒定技術(shù)進(jìn)一步展開(kāi)研究。