E-cadherin、β-catenin、MLCK在高甘油三酯血癥相關(guān)性急性胰腺炎早期大鼠模型中的表達(dá)及意義

韋宇樂， 唐國都， 梁志海， 覃蒙斌， 符洪宗， 覃凌燕， 韋珍平

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是消化系統(tǒng)疾病常見的嚴(yán)重急腹癥之一，重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)起病兇險(xiǎn)且伴有多種并發(fā)癥，可引起胰外多器官的嚴(yán)重?fù)p傷而致功能衰竭[1]。AP以膽源性、酒精性為主，近年來以甘油三酯(triglyceride，TG)升高為主的高甘油三酯血癥相關(guān)性急性胰腺炎(hypertriglyceridemia associated acute pancreatitis，HTGP)的發(fā)病率逐漸增加，并具有病情嚴(yán)重、病程發(fā)展快及反復(fù)發(fā)作等臨床特點(diǎn)。上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)是在鈣離子參與下維持上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞間黏附的重要組成部分，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)以高親和力結(jié)合E-cadherin的C末端，α-連環(huán)蛋白(α-catenin)通過β-catenin與E-cadherin間接結(jié)合形成E-cadherin/catenin復(fù)合體[2]。E-cadherin及β-catenin表達(dá)上調(diào)對細(xì)胞間完整性具有一定的保護(hù)作用，表達(dá)下調(diào)或缺失時(shí)細(xì)胞間的相互黏附力減弱。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)通過使肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化，誘導(dǎo)肌球蛋白收縮，在維持細(xì)胞間黏附、緊密連接及屏障功能中起重要作用[3-4]。本研究通過建立高脂血癥與非高脂血癥的大鼠急性壞死性胰腺炎模型，觀察胰腺病理變化，采用免疫組化方法檢測胰腺組織中E-cadherin、β-catenin、MLCK蛋白的表達(dá)，探討甘油三酯對急性壞死性胰腺炎早期大鼠E-cadherin、β-catenin、MLCK表達(dá)的影響，研究HTGP早期發(fā)病的特性。

1 材料與方法

1.1材料體質(zhì)量為60～80 g的SPF級雄性SD健康大鼠144只，4周齡，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證：SCXK(桂)2014-002；膽固醇(廣州威佳公司)，膽酸鈉(廣州威佳公司)，豬油(自制)，普通飼料(北京科奧協(xié)力有限公司)，牛黃膽酸鈉(日本TCI公司)，全自動生化檢測儀(7600-120型，日本HI-TACHI公司)，通用型SP-9000免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB 試劑盒(北京中杉金橋公司)，E-cadherin、β-catenin抗體(CST公司)，MLCK抗體(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及造模：144只雄性SD大鼠隨機(jī)分為普通飼料組(48只)和高脂飼料組(96只)，分別用普通飼料、高脂飼料喂養(yǎng)4周，滿4周時(shí)行眼球眶后靜脈叢采血測血清TG水平。高脂飼料配方：82.8%普通飼料+15%豬油+2%膽固醇+0.2%膽酸鈉。普通飼料組分為正常組(N組)、急性壞死性胰腺炎組(ANP組)，高脂飼料組分為高脂組(HTG組)、HTGP組，高脂干預(yù)組(HTG+ML-7組)、HTGP干預(yù)組(HTGP+ML-7組)。建模前禁食12 h，自由飲水，N組、HTG組、HTG+ML-7組僅開腹輕輕翻動十二指腸，ANP組、HTGP組、HTGP+ML-7組采用經(jīng)十二指腸乳頭逆行膽胰管注射質(zhì)量濃度為40 g/L的牛磺膽酸鈉(1 ml/kg)的方法制備大鼠急性壞死性胰腺炎模型。HTG+ML-7組及HTGP+ML-7組分別在術(shù)前24、12、1 h腹腔注射2 mg/kg ML-7(溶于20 ml/L乙醇中)進(jìn)行干預(yù)。各組造模后3、6、12 h處置大鼠，觀察胰腺大體情況，取胰腺組織于質(zhì)量濃度為100 g/L的中性甲醛固定。造模過程中，假手術(shù)組大鼠無死亡，造模組3 h無大鼠死亡，6 h時(shí)死亡1只，12 h時(shí)死亡6只，死亡大鼠由備用大鼠完成實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 胰腺組織病理學(xué)檢查：質(zhì)量濃度為100 g/L的中性甲醛固定的胰腺組織常規(guī)行石蠟包埋、切片、HE染色，根據(jù)Schmidt標(biāo)準(zhǔn)[5]從出血、壞死、水腫、炎癥浸潤4個(gè)方面雙盲進(jìn)行胰腺病理評分。

1.2.3 胰腺組織E-cadherin、β-catenin、MLCK表達(dá)量檢測：胰腺石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化，用枸櫞酸鈉溶液(pH=6.0)高壓修復(fù)5 min后，采用鏈菌素親生物素-過氧化物酶(streptavidinperoxdaseconjugataedme-thod，SP法)免疫組織化學(xué)方法，E-cadherin(CST，1∶50)、β-catenin(CST，1∶50)、MLCK(Abcam，1∶2 000)一抗4 ℃孵育過夜，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察胰腺組織的染色強(qiáng)度及范圍。采用雙盲法評分，每張切片選取5個(gè)隨機(jī)高倍視野(400倍鏡下)，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件分析平均光密度值(IOD)。

2 結(jié)果

2.1血清TG水平普通飼料組血清呈清亮淡黃色，高脂飼料組血清呈混濁乳糜樣；普通飼料組和高脂飼料組的TG含量分別為(0.41±0.10) mmol/L、(2.11±0.53) mmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2血清AMY水平ANP、HTGP、HTGP+ML-7組各時(shí)點(diǎn)血清AMY水平較N組、HTG、HTG+ML-7組升高(P<0.05)，同時(shí)點(diǎn)ANP、HTGP、HTGP+ML-7血清AMY相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 大鼠血清AMY水平Tab 1 The level of serum amylase in each group U/L

注：與N組比較，aP<0.05；與HTG組比較，bP<0.05；與HTG+ML-7組比較，cP<0.05。

2.3血清Ca2+水平造模后6 h，ANP組與HTGP組血清Ca2+分別低于N組和HTG組(P<0.05)，HTGP+ML-7組12 h時(shí)血清Ca2+較HTG+ML-7組下降(P<0.05)。同時(shí)點(diǎn)ANP、HTGP、HTGP+ML-7組血清Ca2+比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠血清Ca2+水平Tab 2 The level of serum Ca2+ in each group mmol/L

注：與N組比較，aP<0.05；與HTG組比較，bP<0.05；與HTG+ML-7組比較，cP<0.05。

2.4胰腺組織病理學(xué)改變N組胰腺組織鏡下無明顯病理改變；HTG組、HTG+ML-7組偶見部分胰腺組織輕度小葉間水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤，未見出血和腺泡細(xì)胞壞死；ANP、HTGP、HTGP+ML-7組各時(shí)間點(diǎn)胰腺呈現(xiàn)不同程度水腫、出血、壞死、炎性細(xì)胞浸潤，并隨著時(shí)間延長胰腺壞死程度加重，腺泡細(xì)胞大面積壞死，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的空泡，大量炎癥細(xì)胞浸潤，腺泡結(jié)構(gòu)破壞(見圖1)。隨著病程發(fā)展，胰腺組織病理學(xué)評分逐漸升高，各組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)點(diǎn)HTGP組病理評分較ANP組顯著升高(P<0.05)，HTGP+ML-7組病理評分較HTGP組改善(P<0.05)，與ANP組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3、圖1)。

表3 各組大鼠胰腺病理評分

注：與N組比較，aP<0.05；與HTG組比較，bP<0.05；與HTG+ML-7組比較，cP<0.05；與ANP組比較，dP<0.05；與HTGP比較，eP<0.05。

2.5E-cadherin、β-catenin、MLCK在各組胰腺組織中的表達(dá)結(jié)果E-cadherin、β-catenin主要表達(dá)在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色染色。E-cadherin、β-catenin在N組無明顯表達(dá)，在HTG組和HTG+ML-7組可見細(xì)胞質(zhì)少量蓄積。在各時(shí)點(diǎn)ANP組、HTGP組、HTGP+ML-7組中均可見隨著病情的發(fā)展E-cadherin、β-catenin在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)點(diǎn)HTGP組比ANP組表達(dá)明顯升高(P<0.05)，HTGP+ML-7組較HTGP組表達(dá)減少(P<0.05)，與ANP組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表4～5、圖2～3)。MLCK主要表達(dá)于胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞及腺泡細(xì)胞，呈棕黃色染色。與各時(shí)點(diǎn)相比HTGP組大鼠胰腺組織MLCK的表達(dá)量較ANP組明顯升高(P<0.05)，與HTGP+ML-7組比較，HTGP組表達(dá)減少(P<0.05)，與ANP組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表6、圖4)。E-cadherin、β-catenin、MLCK分別與胰腺病理評分呈正相關(guān)(r1=0.644，r2=0.474，r3=0.685,P均<0.05)。

圖1 各組大鼠3、6、12 h時(shí)胰腺組織病理改變(HE 200×) Fig 1 Pancreatic histopathological changes of rats in each group at 3, 6, 12 hours (HE 200×)

圖2 各組大鼠3、6、12 h時(shí)胰腺組織免疫組化法檢測E-cadherin蛋白(400×) Fig 2 The E-cadherin protein in pancreatic tissues of rats in each group detected by immunohistochemistry at 3, 6, 12 hours (400×)

表4 各組胰腺組織免疫組織化學(xué)法E-cadherin蛋白表達(dá)Tab 4 The expression of E-cadherin protein in pancreastic tissues detected by immunohistochemistory in each group

注：與N組比較，aP<0.05；與HTG組比較，bP<0.05；與HTG+ML-7組比較，cP<0.05；與ANP組比較，dP<0.05；與HTGP組比較，eP<0.05。

表5 各組胰腺組織免疫組織化學(xué)法β-catenin蛋白表達(dá)Tab 5 The expression of β-catenin protein in pancreatic tissues detected by immunohistochemistory in each group

注：與N組比較，aP<0.05；與HTG組比較，bP<0.05；與HTG+ML-7組比較，cP<0.05；與ANP組比較，dP<0.05；與HTGP組比較，eP<0.05。

表6 各組胰腺組織免疫組織化學(xué)法MLCK蛋白表達(dá)Tab 6 The expression of MLCK protein in pancreastic tissues detected by immunohistochemistory in each group

注：與N組比較，aP<0.05；與HTG組比較，bP<0.05；與HTG+ML-7組比較，cP<0.05；與ANP組比較，dP<0.05；與HTGP組比較，eP<0.05。

3 討論

AP是多種病因?qū)е碌囊让讣せ?、自身消化所引起的一系列化學(xué)炎性反應(yīng)。KLATSKIN等[6]于1952年首次報(bào)道復(fù)發(fā)性胰腺炎和高脂血癥同時(shí)發(fā)生時(shí)，高脂血癥可能是導(dǎo)致胰腺炎反復(fù)發(fā)作的原因，此后高脂血癥與胰腺炎的相關(guān)性引起臨床上的廣泛關(guān)注。近年來HTGP的發(fā)病率逐漸上升，已成為繼膽源性、酒精性之后AP的第三大病因，具有病情嚴(yán)重、病程發(fā)展快及反復(fù)發(fā)作等臨床特點(diǎn)。目前主要圍繞的幾種發(fā)病機(jī)制為：(1)游離脂肪酸對組織腺泡細(xì)胞直接損傷假設(shè)；(2)胰蛋白酶原激活加速假設(shè)；(3)胰腺微循環(huán)障礙假設(shè)；(4)氧化應(yīng)激反應(yīng)；(5)鈣超載。研究[7-9]表明，HTGP淀粉酶升高較膽源性急性胰腺炎低，即使影像學(xué)提示胰腺病變嚴(yán)重，血清淀粉酶可以是正常范圍或升高不明顯。本研究結(jié)果顯示，同時(shí)點(diǎn)HTGP組胰腺病理損傷程度較ANP組明顯增高，提示HTG可加重ANP的嚴(yán)重程度。各時(shí)點(diǎn)HTGP組血淀粉酶水平與ANP組相比無明顯差異，除與HTGP組胰腺組織壞死嚴(yán)重淀粉酶釋放減少有關(guān)，還可能與血漿中存在抑制血淀粉酶活性的因子有關(guān)。

圖3 各組大鼠3、6、12 h胰腺組織免疫組化法檢測β-catenin蛋白(400×) Fig 3 The β-catenin protein in pancreatic tissues of rats detected by immunohistochemistry in each group at 3, 6, 12 hours (400×)

E-cadherin屬于鈣依賴性細(xì)胞黏附分子，是介導(dǎo)上皮細(xì)胞間黏附的重要黏附分子，可促進(jìn)相鄰細(xì)胞形成穩(wěn)定的細(xì)胞間連接，維持組織結(jié)構(gòu)和功能的完整。β-catenin以高親和力結(jié)合E-cadherin的C末端，α-catenin通過β-catenin間接結(jié)合形成E-cadherin/catenin復(fù)合體并對該復(fù)合體具有重要調(diào)節(jié)作用。當(dāng)β-catenin受到蛋白酪氨酸激酶磷酸化后可導(dǎo)致E-cadherin/catenin復(fù)合體失去連接，細(xì)胞黏附功能喪失，細(xì)胞間連接松散脫落[2,6,10-11]。上調(diào)E-cadherin和β-catenin的表達(dá)及穩(wěn)定E-cadherin/β-catenin 復(fù)合體可以增強(qiáng)上皮細(xì)胞屏障功能[12]，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力[13-14]。在本研究中，造模后3、6、12 h免疫組化結(jié)果顯示，ANP組和HTGP組E-cadherin、β-catenin水平上調(diào)，并隨著炎癥加重升高明顯，同時(shí)點(diǎn)HTGP組上調(diào)水平顯著高于ANP組，提示急性壞死性胰腺炎早期E-cadherin和β-catenin可能通過自我增殖促進(jìn)損傷后連接結(jié)構(gòu)重建，且HTGP組再黏附的過程強(qiáng)于ANP組，細(xì)胞間連接受損嚴(yán)重。

圖4 各組大鼠3、6、12 h胰腺組織免疫組化法檢測MLCK蛋白表達(dá)(400×) Fig 4 The expression of MLCK protein in pancreatic tissues of rats detected by immunohistochemistry in each group

肌球蛋白輕鏈激酶MLCK是平滑肌細(xì)胞收縮的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，主要由mylk1和mylk2兩種基因編碼[15]。MLCK的結(jié)構(gòu)組成包括N端肌動蛋白結(jié)合區(qū)、中心激酶區(qū)、鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)結(jié)合區(qū)及C端的肌球蛋白結(jié)合區(qū)。細(xì)胞收縮、黏附、遷移和上皮屏障形成與肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(myosin light chain，MLC) 磷酸化有關(guān)。Ca2+和CaM結(jié)合后激活MLCK[16]，進(jìn)而磷酸化MLC Ser19和Thr18，促使肌動蛋白收縮引起細(xì)胞骨架重排及增加細(xì)胞表面張力，開放細(xì)胞間隙，使細(xì)胞間通透性增加[3-4]。LORENTZ等[17]表明，患有膿毒血癥的MLCK-/-小鼠與WT小鼠相比死亡率明顯下降，腸黏膜ZO-1和claudin 15表達(dá)升高腸屏障功能得到改善。EUTAMENE等[18]表明，MLCK抑制劑ML-7可能通過降低MLCK磷酸化和Rho/Rho激酶水平減少肌動蛋白重排，從而影響細(xì)胞間緊密連接功能。石慧榮等[19]實(shí)驗(yàn)表明，在重癥急性胰腺炎中MLCK可能對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及TJ結(jié)構(gòu)的完整性進(jìn)行調(diào)控，引起細(xì)胞緊密連接破壞和腸屏障功能損傷。本研究中HTGP組MLCK表達(dá)較ANP組顯著，與病理損傷趨勢一致。HTGP組E-cadherin和β-catenin表達(dá)較ANP組明顯，利用ML-7干預(yù)后二者表達(dá)下降，且病理損傷得到改善。ML-7抑制劑MLCK可降低HTGP上皮細(xì)胞黏附連接蛋白水平，改善胰腺病理損傷，表明MLCK可能通過改變細(xì)胞間連接參與了HTGP的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，E-cadherin、β-catenin及MLCK在急性壞死性胰腺炎早期表達(dá)上調(diào)，三者表達(dá)同時(shí)點(diǎn)HTGP較ANP升高明顯，且與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，MLCK可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附連接參與HTGP的形成。