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    主動脈夾層手術(shù)前后患者腸道菌群結(jié)構(gòu)特征變化的研究

    2018-10-31 00:49:18余英高峰張杰陳雪
    心肺血管病雜志 2018年10期
    關鍵詞:厚壁菌門夾層

    余英 高峰 張杰 陳雪

    宏基因組高通量DNA測序技術(shù)突破了過去依靠細菌培養(yǎng)不能準確獲得菌群結(jié)構(gòu)特征的技術(shù)瓶頸;能夠準確獲得門、綱、目、科、屬、種水平菌群結(jié)構(gòu)特征;使得腸道菌群結(jié)構(gòu)與疾病之間關系的研究成為目前臨床研究的熱點[1-4];主動脈夾層是最常見的主動脈疾病之一;目前外科手術(shù)治療仍是其最主要的治療方法;有研究[5-7]發(fā)現(xiàn)心臟或主動脈夾層手術(shù)患者在術(shù)后常出現(xiàn)腹脹、腹瀉、排便困難、消化道出血等胃腸道癥狀;但目前缺乏胃腸道癥狀的發(fā)生是否與腸道菌群結(jié)構(gòu)改變有關的研究;因此;我們通過宏基因組高通量DNA測序技術(shù)研究行主動脈夾層手術(shù)患者手術(shù)前后腸道菌群結(jié)構(gòu)特征;初步探討胃腸道癥狀與腸道菌群結(jié)構(gòu)特征之間的關系

    資料與方法

    1.臨床資料 納入2015年5月到2016年1月,于首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院心臟外科中心,行主動脈夾層手術(shù)治療患者,均行胸腹部CT檢查提示存在主動脈夾層,同時排除患有精神心理疾病、基礎消化道疾?。ㄈ缪装Y性腸病、腸易激綜合征、消化道潰瘍、消化道腫瘤等)、肝炎、肝硬化、糖尿病、肥胖、冠心病及1個月內(nèi)曾使用過抗生素的患者。

    收集患者胃腸道癥狀評分(gastrointestinal symptom rating scale,GSRS)結(jié)果,GSRS 癥狀包括:腹脹、排氣增多、惡心和嘔吐、排便不盡感、噯氣、硬糞、腹鳴、稀便、排便減少、排便增多、排便緊迫感、反流、燒心、腹痛、上腹部緊抽感,共15個癥狀;每個癥狀分為無癥狀、稍微嚴重、比較嚴重、非常嚴重,共4個級別(分別計 1 到 4 分)[8]。

    2.糞便樣本的采集與處理 所有入組患者入院后采集新鮮糞便樣本2~5g立即置于無菌采樣盒內(nèi),并于-80℃低溫冷凍保存。每一例取300mg糞便樣本,采用康為公司的糞便DNA快速提取試劑盒快速提取和純化DNA,使用Nanodrop測定DNA濃度和260/280值,以濃度 >15ng/μL,且260/280值在1.8~2.0之間的DNA作為符合質(zhì)量要求的樣本,另外使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測確定DNA樣本無降解,合格DNA保存于-20℃冰箱待用。

    3.DNA文庫的建立、測序及歸類 從糞便樣本中提取的DNA進行PCR擴增和建庫,PCR引物使用針對細菌16S rDNA的V3-V5區(qū)的通用引物,上機測序前進行二次PCR建庫,對第一次PCR產(chǎn)物的5'端加上Roche/454特異性接頭和多重標簽(MID)修飾(標簽序列為10個核苷酸序列),不同樣本的標簽序列不同。使用Illumina Hiseq2500系統(tǒng)(中國科學院微生物所)進行測序,及微生物生態(tài)學定量研究(Quantitative Insights Into Microbial Ecology,QIIME)系統(tǒng)進行歸類分析。

    4.統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均用SPSS 20.0統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料用平均值±標準差表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數(shù)資料采用χ2檢驗;非正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)(M)及四分位距間(P25,P75)表示,兩組間比較采用 Mann-Whitney U檢驗,并進一步進行Spearman相關性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    1.一般資料 共收集術(shù)前組標本17例,術(shù)后組標本11例,其中5例患者同時收集到術(shù)前、術(shù)后標本,12例患者僅收集到術(shù)前標本,6例患者僅收集到術(shù)后標本。兩組患者在性別、年齡和住院時間上無明顯差別(表1)。術(shù)前組和術(shù)后組GSRS分別為(35.5±2.2)分和(40.6±3.5)分,P<0.001。

    表1 不同組間一般資料和腸道菌群結(jié)構(gòu)結(jié)果[±s,n,M(QR)]

    表1 不同組間一般資料和腸道菌群結(jié)構(gòu)結(jié)果[±s,n,M(QR)]

    注:其他:包括平均值百分比例<1%和組間比較P>0.05的所有細菌

    項目 術(shù)前(n=17) 術(shù)后(n=11) t/Z/χ2值 P值年齡 /歲52.3±12.2 52.0±10.1 0.079 0.937男/女 11/6 9/2 0.958 0.419胃腸道癥狀評分/分 35.5±2.2 40.6±3.5 -4.673 0.001住院時間/d 15.9±9.2 14.5±5.2 0.456 0.652門水平 - - - -厚壁菌門 /% 66.1(38.3,82.3)45.0(32.5,53.5)-1.717 0.086擬桿菌門 /% 20.6(12.6,35.4) 40.4(22.2,47.4)-2.046 0.041放線菌門 /% 0.7(0.1,5.1) 1.5(0.4,4.2) -0.917 0.359變形菌門 /% 3.6(1.1,16.5) 5.4(3.0,23.1) -1.011 0.312梭桿菌門 /% 0.0(0.0,0.0) 0.0(0.0,0.2) -2.696 0.007其他菌門 /% 0.0(0.0,0.6) 0.0(0.0,0.2) -0.024 0.981擬桿菌門/厚壁菌門/% 0.3(0.1,0.7) 0.7(0.3,1.1) -2.046 0.041綱水平 - - - -芽孢桿菌綱 /% 0.4(0.0,1.4) 0.4(0.1,4.5) -0.635 0.525梭菌綱 /% 31.0(19.3,50.2)34.6(17.6,48.7)-0.447 0.655 Negativicutes綱 /% 9.9(2.4,43.3) 1.0(0.1,6.9) -2.752 0.006擬桿菌綱 /% 20.6(12.6,35.4)40.4(22.2,47.4)-2.046 0.041放線菌綱 /% 0.7(0.1,5.1) 1.5(0.4,4.2) -0.917 0.359梭桿菌綱 /% 0.0(0.0,0.0) 0.0(0.0,0.2) -2.696 0.007 γ-變形菌綱 3.0(0.5,15.7) 4.9(0.8,22.9) -0.541 0.589其他綱 /% 1.6(0.7,3.0) 2.2(1.5,4.0)-1.341 0.180

    2.門、綱、目、科水平腸道菌群結(jié)構(gòu)比較 術(shù)前組和術(shù)后組在門水平腸道菌群結(jié)構(gòu)(表1,圖1)百分比分別為:厚壁菌門[66.1(38.3,82.3)vs.45.0(32.5,53.5)%,P=0.086)];擬桿菌門 [20.6(12.6,35.4)vs.40.4(22.2,47.4) %,P=0.041)];放線菌門[0.7(0.1,5.1)vs.1.5(0.4,4.2) %,P=0.359)];變形菌門[3.6(1.1,16.5)vs.5.4(3.0,23.1) %,P=0.312)];梭桿菌門[0(0,0)vs.0(0,0.2) %,P=0.007)];其他菌門[0(0,0.6)vs.0(0,0.2) %,P=0.981)]。

    圖1 門水平腸道主要菌群結(jié)構(gòu)結(jié)果

    表2 不同組間目和科水平腸道菌群結(jié)構(gòu)結(jié)果[M(QR),%]

    術(shù)前組和術(shù)后組在綱、目、科水平腸道菌群結(jié)構(gòu)(表1~2)有明顯差別的菌群包括:Negativicutes綱[9.9 (2.4,43.3)%vs.1.0(0.1,6.9)%,P=0.006],擬桿菌綱[20.6(12.6,35.4)%vs.40.4(22.2,47.4)%,P=0.041],梭桿菌綱[0.0(0.0,0.0)%vs.0.0(0.0,0.2),P=0.007]; Selenomonadales目[9.9(2.4,43.3)%vs.1.0(0.1,6.9)%,P=0.006)];擬桿菌目[20.6(12.6,35.4)%vs.40.4(22.2,47.4) %,P=0.041)],韋榮氏菌科[8.7(2.1,43.3)%vs.0.6(0.1,6.9) %,P=0.006],桿菌科[8.2(1.4,24.0)%vs.26.8(12.9,34.5) %,P=0.018],梭桿菌科[0.0(0.0,0.0)%vs.0.0(0.0,0.2) %,P=0.007]。

    門、綱、目、科水平腸道菌群結(jié)構(gòu)在不同性別組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),在不同年齡組(>50歲組和≤50歲組)間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    3.胃腸道癥狀評分與門水平腸道菌群結(jié)構(gòu)間的相關性研究 Spearman相關性分析結(jié)果顯示,GSRS除與擬桿菌門r=0.386(P=0.042)有相關性外,與厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門、其他菌門無相關性,分別為:r=-0.263(P=0.177),r=-0.136(P=0.489),r=0.013(P=0.947),r=0.262(P=0.178),r=-0.081(P=0.681)。 性別、年齡與門水平腸道菌群結(jié)構(gòu)也無相關(P>0.05,表3)。

    表3 胃腸道癥狀評分與門水平腸道菌群結(jié)構(gòu)間相關性分析結(jié)果

    討 論

    胃腸功能紊亂是體外循環(huán)心臟手術(shù)的主要并發(fā)癥之一,體外循環(huán)轉(zhuǎn)流期間,患者全身的血液將發(fā)生再分布,胃腸道的血液供應明顯減少,導致其缺血、缺氧,而在心臟復跳、部分轉(zhuǎn)流期間及血液回輸之后,會出現(xiàn)新的缺血-再灌注損傷,此過程將造成胃腸道黏膜的損害,進而影響胃腸道的蠕動和排空功能,最終導致胃腸道癥狀的發(fā)生;在手術(shù)后應激的狀態(tài)下,也可以出現(xiàn)胃腸道黏膜屏障受損、胃黏膜內(nèi)脂質(zhì)過氧化物含量升高和氧自由基產(chǎn)生增加等多方面改變,術(shù)后如出現(xiàn)低心排或者循環(huán)不穩(wěn)定,也將導致大劑量兒茶酚胺藥物的使用,從而引起內(nèi)臟血管收縮,組織灌注降低,加上術(shù)后應用鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及肌松等藥物,更抑制胃腸道的蠕動和排空功能,最終導致胃腸道癥狀的發(fā)生[6-7]。既往有研究顯示手術(shù)應激后患者腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變,而給予糞便移植、微生態(tài)制劑等改變腸道微環(huán)境以后患者感染及腹部癥狀均明顯緩解[9]。因此,我們考慮主動脈夾層手術(shù)后胃腸道癥狀的發(fā)生與腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化具有內(nèi)在的聯(lián)系,本研究旨在初步探討行主動脈夾層手術(shù)患者胃腸道癥狀與腸道菌群結(jié)構(gòu)特征之間的關系。

    我們的研究發(fā)現(xiàn)性別、年齡對主動脈夾層手術(shù)患者腸道菌群結(jié)構(gòu)無影響。主動脈夾層患者腸道主要菌群包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門,其中厚壁菌門和擬桿菌門是占比最多的菌門。主動脈夾層術(shù)后擬桿菌門比例明顯增加,其所屬擬桿菌綱、擬桿菌目、桿菌科水平明顯增加,厚壁菌門所屬Negativicutes綱、Selenomonadales目、韋榮氏菌科比例下降,梭桿菌門及其所屬梭桿菌綱、梭桿菌目、梭桿菌科比例增加。擬桿菌門/厚壁菌門比值明顯增加。腸道菌群是影響人體微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要因素[4],正常腸道菌群參與宿主的營養(yǎng)代謝,外源物和藥物代謝,維持腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)完整性,參與免疫調(diào)節(jié)和對病原體的拮抗。當人體受到的刺激超過自身調(diào)節(jié)能力時,腸道細菌的平衡狀態(tài)被打破,引起菌群失調(diào),嚴重時會導致疾病的發(fā)生[10-12]。有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群影響腸道蠕動和傳輸功能,擬桿菌門所屬菌群可以抑制腸道傳輸,而厚壁菌群所屬菌群可以促進腸道傳輸,擬桿菌門/厚壁菌門比值降低可以促進腸道蠕動和傳輸[13-14]。我們考慮主動脈夾層手術(shù)導致患者術(shù)后擬桿菌門比例增加、擬桿菌門/厚壁菌門比值增加,抑制腸道蠕動和傳輸功能,進而產(chǎn)生胃腸道癥狀。2018年歐洲基礎治療胃腸病學會發(fā)布的益生菌在下消化道癥狀管理中的應用共識認為特定的益生菌有助于減輕下消化道癥狀,癥狀的改善會促進患者健康相關生活質(zhì)量的改善,益生菌對有一系列下消化道癥狀的患者具有良好的安全性[15]。

    我們的研究有一定的局限性。所有受試者來自于單中心,其中存在潛在的選擇偏倚。此外,患者例數(shù)較少限制了研究的統(tǒng)計力。但我們首次對主動脈夾層手術(shù)患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)特點進行了研究。在今后的研究中有待增加樣本量以及開展多中心研究以進一步確認。

    綜上所述,主動脈夾層手術(shù)后患者腸道菌群結(jié)構(gòu)較術(shù)前發(fā)生明顯變化,主動脈夾層手術(shù)治療前后患者胃腸道癥狀的發(fā)生與腸道菌群結(jié)構(gòu)改變有一定相關性,這可能為術(shù)后患者益生菌治療胃腸道癥狀提供了依據(jù)。

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