轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥脑O(shè)計和流程簡述

沈兆瑞

(天津市武清區(qū)楊村第一中學 天津 301700)

1 教材分析

“基因工程”是人教版高中生物學教材中(必修2)第六章以及(選修3)專題一的內(nèi)容，主要是圍繞著轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥幕静僮鞒绦蛘归_： 包括“目的基因的獲取”“基因表達載體的構(gòu)建”“將目的基因?qū)胧荏w細胞”和“目的基因的檢測與鑒定”。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥牧鞒谭爆嵡疫h離日常生活，以至于學生對上述步驟的認知常停留在記憶層面。因此，教材中建議“有條件的地方，嘗試讓部分學生參與轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灢⒔榻B給其他學生”。本文以此為出發(fā)點，帶領(lǐng)學生設(shè)計并開展一次完整的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?，并以講座形式進行流程簡述，以深化學生對教材知識的理解及應用。

2 實驗設(shè)計

2.1 受體植株的選擇——擬南芥 擬南芥(Arabidopsisthaliana)屬十字花科植物，在中國的華東、中南和西北等地廣泛分布，一般生長于山坡、平地、河邊以及路邊。由于具備生長周期短、繁殖系數(shù)高和基因組小等優(yōu)點，因此被作為模式生物廣泛應用于分子生物學、遺傳學和發(fā)育生物學等領(lǐng)域中[1]。

2.2 目的基因以及相關(guān)元件的選擇 具體如下：

(1) 目的基因 選取綠色熒光蛋白(GFP)基因作為目的基因，并在其上游連接一段的信號肽序列(signal peptide，簡稱sp)，后者可幫助GFP定位于線粒體中，方便后續(xù)的檢測與鑒定。

(2) 啟動子 選擇在雙子葉植物中廣泛使用的組成型啟動子CaMV 35S，用于驅(qū)動目的基因的高效表達。

3 實驗步驟

3.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒 具體如下：

(1) 構(gòu)建基因表達載體 利用工具酶，依次將啟動子、信號肽序列和目的基因連接成一段DNA序列(圖1A所示)，其上下游分別攜帶BamH I與KpnI酶切位點，方便與普通質(zhì)粒(圖1B所示)重組。利用雙酶切法同時處理目的基因與普通質(zhì)粒，連接后獲得重組質(zhì)粒(圖1C所示)。

(2) 轉(zhuǎn)化 將上述連接產(chǎn)物導入處于“感受態(tài)”的大腸桿菌中，所得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要分為三類： 絕大多數(shù)為空白的感受態(tài)細胞，少數(shù)細胞成功導入重組質(zhì)粒。除此之外，還存在普通質(zhì)粒自連所造成的干擾。

(3) 抗性篩選 將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至含有氨芐青霉素(Amp)的培養(yǎng)基中進行初步篩選，得到含有標記基因的大腸桿菌單克隆菌落。

(4) PCR鑒定 為了進一步排除普通質(zhì)粒的干擾，利用多聚酶鏈式反應(PCR)技術(shù)對目的基因進行檢測。通過DNA凝膠電泳觀察顯示，除去4/7/8組外，其余各組均獲得擴增條帶，表明成功導入重組質(zhì)粒(如圖1，D所示)。

(5) 提取質(zhì)粒 任取一組成功導入重組質(zhì)粒的單克隆菌落進行二次擴培，提取重組質(zhì)粒備用。

圖1 構(gòu)建重組質(zhì)粒

3.2 將目的基因?qū)胧荏w細胞 農(nóng)桿菌侵染作為一種天然的植物轉(zhuǎn)化體系，在雙子葉植物的應用中尤為常見。農(nóng)桿菌細胞質(zhì)中的Ti質(zhì)粒內(nèi)含一段T-DNA序列，侵入植物體后，該序列會隨機插入植物細胞的染色體組中，產(chǎn)生可遺傳變異。將重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌“感受態(tài)”細胞中，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、抗性篩選、PCR鑒定等步驟(同上文，不作贅述)獲取攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，在28℃下擴培后備用。

本實驗采取花序浸泡法，讓攜帶目的基因的農(nóng)桿菌侵染擬南芥子房內(nèi)部的胚珠(將發(fā)育成種子)，使子代獲得相應性狀。選取生長狀態(tài)良好的擬南芥植株，待花序發(fā)育至適宜階段后，剪除已成熟角果與已授粉花，并在24h后進行轉(zhuǎn)化。在此期間，將二次擴培的農(nóng)桿菌與等滲溶液(常用蔗糖溶液)混勻，制備農(nóng)桿菌懸濁液備用。將經(jīng)過剪切后的花序浸泡入上述懸濁液中，帶有T-DNA序列的農(nóng)桿菌通過侵染進入植株體內(nèi)并完成轉(zhuǎn)化。對轉(zhuǎn)化后植株進行避光和密閉保濕處理，24h后解除并移至適宜環(huán)境下生長。

3.3 目的基因的檢測與鑒定 一般將農(nóng)桿菌侵染的植株命名為T0代，其子代多數(shù)為正常植株(未成功轉(zhuǎn)化)，少數(shù)轉(zhuǎn)化成功的植株被命名為T1代?；ㄐ蚪莘ú僮骱啽?，但轉(zhuǎn)化效率相對偏低。因此，必須利用抗性篩選來獲取成功導入目的基因的T1代。因為本實驗選取的農(nóng)桿菌攜帶潮霉素抗性基因，所以使用含有潮霉素的植物生長培養(yǎng)基對T0代的種子進行篩選。潮霉素對幼苗生長有明顯抑制作用，僅有成功導入農(nóng)桿菌的T1代幼苗能夠正常生長發(fā)育。

綠色熒光蛋白(GFP)受到藍光照射時，會吸收能量并激發(fā)出綠色熒光。依據(jù)該特性，GFP常被生物學家作為標記蛋白，用于觀察細胞內(nèi)蛋白分子的動態(tài)變化[2]。本實驗可通過觀察T1代幼苗的綠色熒光水平，來進一步檢測與鑒定目的基因的表達情況。檢測結(jié)果表明，在擬南芥幼苗的根、莖和葉中均能檢測到綠色熒光信號。進一步通過酶解處理，獲取單個原生質(zhì)體后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)GFP集中分布于線粒體中。上述結(jié)果均表明目的基因成功導入了T1代幼苗中并正確表達，該幼苗確為轉(zhuǎn)基因植株，本次轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灹鞒掏瓿伞?/p>

4 實驗創(chuàng)新

本實驗利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功將目的基因?qū)胧荏w植株中并表達。通過流程簡述，學生從整體上對轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灥牟襟E有了更加直觀和感性的認識。此外，實驗中對相關(guān)技術(shù)的具體應用也拓展了學生的思路。

例如，PCR技術(shù)鑒定目的基因的導入和熒光標記法檢測目的基因的表達等。由此可見，生命科學離不開實驗，高中生物學教師應引導學生通過實驗來感受生物學這門學科的魅力所在。