牛輪狀病毒VP4、VP6、VP7基因分子生物學(xué)研究進(jìn)展

梁浩勤，李瓊毅，趙克學(xué)，鄧盈盈，賴露菊，魏鎖成，馮若飛

(1.西北民族大學(xué) 生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；3.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

輪狀病毒性胃腸炎(Rotavirus gastroenteritis, RVGE)是由輪狀病毒(Rotavirus, RV)引起的流行廣泛的人畜共患病，也是多種幼齡動(dòng)物及嬰幼兒的一種急性腸道傳染病，以腹瀉和脫水為特征，病死率可達(dá)50%[1].在發(fā)展中國(guó)家，由輪狀病毒引起的急性腸炎每天死亡數(shù)約2 000人[2].輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科，為無(wú)囊膜雙鏈RNA病毒，直徑大約60 nm～80 nm，是一個(gè)對(duì)稱的20面體，電鏡下呈典型的“車輪狀”，故稱為輪狀病毒[3].RV分為11個(gè)基因節(jié)段，分別編碼了6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP4、VP6、VP7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1-NSP6).在三層RV顆粒中，中間層由VP6蛋白(45 kDa)組成，位于最外層由VP4和VP7蛋白組成，內(nèi)部核心蛋白VP2，圍繞著RV的雙鏈基因組[4]；VP7和VP4蛋白決定RV的G型與P型以及它的毒力；NSP1-NSP6非結(jié)構(gòu)蛋白在輪狀病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、組成病毒復(fù)制酶、出芽等過程中發(fā)揮著重要的作用.

1 牛輪狀病毒的基因型和血清型

2008年Matthijnssens J等比對(duì)了GenBank中已知的不同RV毒株每個(gè)節(jié)段ORF區(qū)的同源性，并對(duì)每個(gè)節(jié)段的基因型設(shè)定同源性臨界值，由此可以判斷每個(gè)毒株的基因型[5].不同基因節(jié)段對(duì)應(yīng)不同的基因型，按照下列的排列順序?qū)群輪狀病毒進(jìn)行新的分類和命名VP7-VP4-VP6-VP1-VP2-VP3-NSP1-NSP2-NSP3-NSP4-NSP5.至今已發(fā)現(xiàn)27種G型，37種P型[4].在牛輪狀病毒中發(fā)現(xiàn)的G型為G1-G3、G5、G6、G8、G10、G11、G15、G17、G21、G24， P型為P[1]、P[3]、P[5-7]、P[11]、P[14]、P[17]、P[21]、P[29]、P[33].經(jīng)研究證實(shí)G6、G8、G10和P[1]、P[5]、 P[11]基因型在BRV中最常見[6].

以牛A組輪狀病毒G6為主流行的血清型(40/53，75.4%)，經(jīng)常檢測(cè)到的結(jié)合型為G6P[11](60.3%)和G10P[11](24.5%)[7].前期的研究表明,我國(guó)BRV的主要G血清型為G6(54.7%)和G10(15.1%)；主要的P基因型為P[5](52.8%)和P[11](18.9%)，主要的結(jié)合型是G6P[5](28.3%)、G6P[5]P[11](5.7%)、G10P[5](5.7%)及G10G6P[5](5.7%)[8].

Peter等應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)了德國(guó)家養(yǎng)動(dòng)物和伴侶動(dòng)物425份糞便樣中A、B和C組RV，在85.2%的樣本中檢測(cè)到BRV[9].基因分型結(jié)果顯示G6P[5]為經(jīng)常檢出的基因型，高達(dá)67.3%，其次是G6P[11](13.9%)和G10P[5](4.0%)[9].目前，根據(jù)研究者的用途，已經(jīng)研發(fā)了幾種針對(duì)輪狀病毒G和P分型的測(cè)定方法，且它們的特異性和敏感性存在顯著差異[7, 10-12].

2 VP4結(jié)構(gòu)蛋白的功能及分子特征

2.1 VP4結(jié)構(gòu)蛋白的功能

VP4是病毒穗蛋白，由基因片段4編碼[13, 14]，約88 kDa，它決定了宿主細(xì)胞嗜性，并攜帶P(對(duì)蛋白酶敏感)血清型.VP4在酶裂解時(shí)病毒傳染性增加并快速病毒內(nèi)化成兩個(gè)亞單位——VP8 (28 kDa)和VP5(60 kDa)[13, 15, 16].VP4除了決定P血清型研究，還與許多重要的生物學(xué)功能聯(lián)系在一起.VP4是許多病毒株的血凝素，被認(rèn)為是一種毒性決定因素，大多數(shù)研究表明VP4是輪狀病毒主要的細(xì)胞附著蛋白.輪狀病毒在感染許多動(dòng)物(除人類外)時(shí)，需要細(xì)胞唾液酸的作用才能發(fā)揮血凝、細(xì)胞結(jié)合和具有傳染性的功能[17].不同的VP4血清型之間還存在交叉保護(hù)，是疫苗研究最有前途的蛋白之一[18].但目前還未研制出用于BRV的基因工程亞單位疫苗.

2.2 VP4基因的分子特征

輪狀病毒感染宿主的過程中VP4被胰酶內(nèi)化成了帶氨基末端的VP8蛋白和帶羧基末端的VP5蛋白，進(jìn)而提高了病毒感染性[19].VP8包含血凝素域(氨基酸位點(diǎn)93-208)[20]，覆蓋了一個(gè)抗原區(qū)域(氨基酸位點(diǎn)79-192)[21].VP5包含一個(gè)假定的細(xì)胞融合區(qū)域(氨基酸位點(diǎn)384-401)和一個(gè)抗原區(qū)，其中細(xì)胞融合區(qū)為辛德畢斯病毒潛在的結(jié)合區(qū)域[22]，抗原區(qū)環(huán)繞著氨基酸位點(diǎn)305，細(xì)胞融合區(qū)和氨基酸位點(diǎn)428-458[21].Mawatari等研究了2003—2010年日本山形縣檢測(cè)出的6種輪狀病毒C(RCVs)與之前研究中發(fā)現(xiàn)的2種RCV的全長(zhǎng)核苷酸序列之間的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)VP4基因可明顯分為兩種譜系.在譜系I和II之間VP4核苷酸序列同源性為83.7%～ 84.8%[23].

3 VP6結(jié)構(gòu)蛋白的功能及分子特性

3.1 VP6結(jié)構(gòu)蛋白的功能

VP6是RV中最豐富和具有免疫原性的蛋白[24]，在RV株中高度保守[25].根據(jù)VP6將輪狀病毒目分為8組(A-H)[26].1997年發(fā)現(xiàn)新的RV能感染成人，這種新病毒被命名為新的成人腹瀉輪狀病毒(ADRV-N)[27].最近，Wakuda等從豬身上又分離出了一種相關(guān)病毒[28].RVA、RVB和RVC是已知感染人類和動(dòng)物的，而RVD、RVE、RVF和RVG只感染動(dòng)物[29].

3.2 VP6基因的分子特征

VP6型三聚體構(gòu)成六邊形，并進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)組裝，在不同條件下分別構(gòu)成VP6納米管(VP6T)和納米球(VP6S)[30].rVP6具有高度的免疫原性[31]，它被作為異種蛋白抗原和基因融合疫苗的載體或遞呈平臺(tái)，能夠提高外來(lái)抗原的免疫反應(yīng)[32].VP6在不同的pH條件下是穩(wěn)定的.在口服的時(shí)候，它被靶向作用于腸細(xì)胞，給藥物混合物運(yùn)輸?shù)轿改c道提供了一個(gè)新前景[33].2012年，Jelle等將400多個(gè)VP6 ORF序列和7個(gè)從雞中分離出的RVD菌株的VP6 ORF片段，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹和成對(duì)的特性頻率圖[26].

4 BRV VP7結(jié)構(gòu)蛋白的分子生物學(xué)特征

4.1 VP7結(jié)構(gòu)蛋白的功能

早期的研究表明VP7是一種輪狀病毒細(xì)胞附著蛋白[34]，但后期兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告，感染輪狀病毒的細(xì)胞裂解物中有一種蛋白被抗血清阻斷和吸附，并被吸附在MA104細(xì)胞單分子上[16, 35].后來(lái)發(fā)現(xiàn)這種蛋白是非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2，而不是VP7[36].VP7仍有可能在細(xì)胞附著中起次要作用[37].

4.2 VP7基因的分子特征

Isanaka等在印度西北部溫帶喜馬拉雅地區(qū)的一腹瀉小牛中發(fā)現(xiàn)了一種罕見的牛RVA菌株，命名為RVA/Cow-wt/IND/M1/09/2009.對(duì)該RVA菌株完整基因組序列的檢測(cè)顯示，在典型的牛RVA基因型主干(I2-R2-C2-M2-A11-N2-T6-E2-H3)上有一個(gè)不尋常的G-P組合[38].M1/09的VP7基因與猴株(RVA/ simian-tc/USA/RRV/1975/G3P[3])顯示了73.8%的核苷酸序列一致[38].研究人員廣泛研究了印度輪狀病毒的分子流行病學(xué)[39]，印度的各個(gè)城市中G9菌株的高發(fā)率高達(dá)15%.在最近SII主導(dǎo)的與印度國(guó)立霍亂及腸道疾病研究中心合作的一項(xiàng)研究中，印度G9P[4](27%)、G1P[8](18%)和G2 P[4](14%)是研究人群中主要的基因型.

5 RV疫苗研制

5.1 減毒活疫苗

5.1.1 RotaTeq減毒活疫苗

在美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NIH)技術(shù)轉(zhuǎn)讓后，印度開發(fā)了一種凍干人—牛重組五價(jià)輪狀病毒疫苗(RotaTeq/BRV-PV)[40].凍干的RotaTeq是一種耐熱的疫苗，可以在低于25 ℃環(huán)境中儲(chǔ)存30個(gè)月[41].RotaTeq包括了5種人和牛宿主的重配RV，其中4種重配RV均表達(dá)牛RV親代的吸附蛋白(P7)，還分別表達(dá)人RV親代株外殼蛋白G1、G2、G3、G4；第5種重配RV表達(dá)人RV的親代株吸附蛋白P1[42]和牛RV親代株外殼蛋白G6.RotaTeq可有效預(yù)防G1～ G4引起的嬰幼兒RVGE.在澳大利亞， RotaTeq已成為常規(guī)疫苗接種計(jì)劃的一部分[43].

除了凍干的BRV-PV，印度還開發(fā)了液體BRV-PV (LBRV-PV)，這將給使用者提供一個(gè)額外的選擇.LBRV-PV制作工藝幾乎與凍干的BRV-PV相同，它與傳統(tǒng)疫苗一樣需要在2 ℃～8 ℃儲(chǔ)存.該新疫苗在成人中進(jìn)行了一期臨床研究，結(jié)果顯示GLP毒理學(xué)研究中沒有出現(xiàn)安全問題，提示了LBRV-PV在成人中是安全且耐受性良好的.該疫苗將在嬰兒身上進(jìn)行下一步臨床開發(fā)應(yīng)用[44].

5.1.2 Rotarix減毒活疫苗

Rotarix是在美國(guó)獲得許可的第三種輪狀病毒疫苗[40]，第一個(gè)是Rotashield，由于它接種后導(dǎo)致腸阻塞幾率增加，已由制造商撤回[45].Rotarix是一種單價(jià)輪狀病毒疫苗，是人RV G1P[8]型RIX4414減毒后(89-12株)獲得[46]，并于2012年5月引入了加納國(guó)家擴(kuò)大免疫規(guī)劃(EPI)中[47].經(jīng)一些拉丁美洲國(guó)家鑒定，Rotarix對(duì)G1、G2、G3、G4、G9均具有保護(hù)效力，且無(wú)腸套疊癥狀[48].

5.2 亞單位疫苗

5.2.1 諾如病毒—輪狀病毒聯(lián)合亞單位疫苗

諾如病毒(Norovirus, NoV)和RV是最常見引起幼齡兒童病毒性腸胃炎的病因，為了消除NoV和RV引起的胃腸炎，嬰幼兒需要在出生后不久接種疫苗.盡管NoV病毒樣顆粒(VLPs)疫苗正在被廣泛研究，但仍不能通過疫苗接種來(lái)預(yù)防.當(dāng)前使用RV疫苗是減毒活疫苗病毒的潛在安全問題，如腸套疊和脫靶的風(fēng)險(xiǎn).研究滅活的RV亞單位疫苗是必要的.Malm等開發(fā)了一種聯(lián)合疫苗候選疫苗，針對(duì)NoV和RV兒童胃腸炎，由NoV VLPs和RV VP6組成[49].在小鼠模型中，聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫[50].除此之外，該研究還證明了VP6可以作為NoV抗體的一種體內(nèi)佐劑[51, 52]，使得NoV-RV聯(lián)合亞單位疫苗能夠達(dá)到一舉兩得的效果.

5.2.2 BRV-TV四價(jià)人—牛重組輪狀病毒疫苗

BRV-TV是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院過敏與感染研究所(NIAID)自主研發(fā)的一種含有4種重組病毒的疫苗，其VP7基因?yàn)槿说腉1, G2, G3或G4血清型和10個(gè)英國(guó)牛輪狀病毒株的基因[53].這種疫苗安全且不影響常規(guī)兒童免疫接種的免疫反應(yīng).Vesikari等人在芬蘭將BRV-TV與恒河猴四價(jià)疫苗進(jìn)行比較(RRV-TV，后來(lái)獲得RotaShield許可).結(jié)果證明兩種疫苗都同樣有效，但BRV-TV的反應(yīng)性比RRV-TV小.在研究中，97%的嬰兒對(duì)疫苗產(chǎn)生了免疫反應(yīng)，BRV-TV對(duì)嚴(yán)重輪狀病毒腸胃炎(severe rotavirus gastroenteritis, SRVGE)有90%的療效[40].盡管這項(xiàng)研究的規(guī)模有限，但清楚地反映了BRV-TV的免疫原性、安全性和有效性.

5.2.3 病毒樣顆粒疫苗

1996年，Conner等在昆蟲細(xì)胞中制備了表達(dá)牛RF VP2基因和SA11 VP4，VP6和VP7蛋白的重組桿狀病毒疫苗，并分別對(duì)小鼠和家兔進(jìn)行了免疫，得到了一種有效的免疫原[54].

5.2.4 研發(fā)中的基因工程亞單位疫苗

Wei Suocheng等從感染牛輪狀病毒(BRV)菌株GSB01的MA104細(xì)胞中提取總RNA.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)擴(kuò)增BRV VP7基因構(gòu)建了pET32a-VP7和pET32a-VP7-LTB(大腸桿菌不耐熱性腸毒素B亞單位)，并誘導(dǎo)表達(dá)了蛋白.將其作為抗體，免疫小鼠，制備了鼠多克隆抗體.研究結(jié)果顯示,該融合蛋白具有優(yōu)良的免疫原性，能夠保護(hù)小鼠免受BRV感染[55].Gonzalez等研究了桿狀病毒表達(dá)VP6重組蛋白，并用初乳模型對(duì)其進(jìn)行了評(píng)估.結(jié)果提示，這種疫苗能夠在不產(chǎn)生中和抗體(Nab)的情況下保護(hù)犢牛免受病毒攻擊[56].這些重組蛋白可用于進(jìn)一步開發(fā)高效的BRV亞單位疫苗.

6 小結(jié)

VP4、VP6、VP7是BRV重要的抗原蛋白，在輪狀病毒的診斷和研制疫苗方面具有重要的指導(dǎo)意義.VP4作為刺突蛋白，在機(jī)體中產(chǎn)生抗VP4的抗體，能夠有效阻斷輪狀病毒的吸附和進(jìn)入胞內(nèi)的過程.VP6進(jìn)入機(jī)體可以刺激機(jī)體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的IgA與多聚免疫球蛋白受體(plgR)結(jié)合，經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)與病毒顆粒結(jié)合，進(jìn)而抑制病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[57].VP7刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體能夠阻斷病毒脫殼，從而抑制病毒復(fù)制[58].世界各國(guó)很早就開始了輪狀病毒基因工程疫苗的研制，迄今輪狀病毒疫苗研制已經(jīng)取得很大進(jìn)展，現(xiàn)有減毒活疫苗、病毒樣顆粒(VLP)疫苗、重組亞單位疫苗等，其中VP4、VP6、VP7作為抗原的多種重組亞單位疫苗也相繼進(jìn)入臨床試驗(yàn)[40, 59, 60].隨著新疫苗的進(jìn)一步研發(fā)和多種動(dòng)物模型的成功建立，經(jīng)濟(jì)有效的輪狀病毒新疫苗終將會(huì)成功研制.