甘草與附子不同比例配伍對甘草黃酮溶出過程的影響*

李芩萍 周 靜 李 敏 孔 俐 韓 進(jìn) 張宇燕

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效［1］。甘草的主要有效成分是黃酮類化合物、甘草皂苷類和甘草多糖類化合物［2-3］，除具有腎上腺皮質(zhì)激素樣作用外，還有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗心律失常、調(diào)脂等作用［4-10］。附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，具有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、散寒止痛的功效，用于亡陽虛脫及陽虛諸證［1］。配伍用藥是中醫(yī)特色之一，附子為回陽救逆要藥，但有毒，甘草味甘、性平，能緩能解，故臨床附子甘草多配伍應(yīng)用［11］，如仲景四逆湯為治療傷寒少陰寒化證的基本方，甘草在方中亦有十分重要的意義。甘草既能降低附子的毒性，又能加強(qiáng)姜、附的功能，3味藥有機(jī)配伍，成為一首峻而不烈、功效卓著的回陽救逆名方。此經(jīng)典搭配的增效減毒配伍關(guān)系引起醫(yī)藥研究人員的極大興趣并進(jìn)行了大量研究。同時張仲景及歷代各醫(yī)家使用甘草附子配伍劑量各有特點(diǎn)，發(fā)揮最佳藥效［12-13］。本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法，以甘草苷為對照品建立甘草黃酮的含量測定方法 ，觀察甘草與附子不同比例配伍對甘草黃酮的溶出過程及含量的影響，從分析化學(xué)探討甘草與附子等中醫(yī)藥配伍對成分溶出及含量變化的影響，為中醫(yī)藥配伍研究提供參考也為臨床用藥提供了依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 甘草藥材：購自浙江臨安市醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖，批號20161025。附子藥材：購自浙江臨安市醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品，批號 20161210。甘草苷對照品（111610-200604）：中國藥品生物制品檢定所。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。AG135型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司。DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)有限公司。FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品2.2 mg，加60%乙醇溶解，并用乙醇定容至50 mL，制得濃度為44 μg/mL的對照品溶液。

2.2 單煎液、甘草與附子合煎液的制備 分別取甘草5 g，甘草 5 g與附子 5 g，加水 20倍，浸漬 30 min，煎煮60 min時間后定容至50 mL，取定容溶液0.4 mL，加60%乙醇至8 mL，加10%氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL，作為甘草單煎，甘草與附子合煎供試液。

2.3 最大吸收波長的確定 精密吸取甘草苷對照品溶液0.5 mL，加60%乙醇至8 mL，加10%氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL，以第1份為空白對照，于190～500 nm波長處掃描，結(jié)果在337 nm處有最大吸收。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取甘草苷對照品溶液 0.5、0.7、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，加 60%乙醇至 8 mL，加10%氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL，在337 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程 y=0.0712x+0.0248 （R=0.9994）， 在 2.20～11.00 μg/mL范圍內(nèi)甘草苷對照品濃度與吸光度呈線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.4”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)溶液系列中質(zhì)量濃度為6.60 μg/mL的溶液，重復(fù)測定6次，以吸收度計(jì)算RSD，考察精密度。結(jié)果RSD=0.40%，精密度符合要求，說明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取對照品溶液、甘草單煎液、甘草與附子合煎液，于各樣品制備后0、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h測定其吸光度，結(jié)果以吸光度計(jì)算RSD分別為0.24%、0.43%、0.55%，結(jié)果表明對照品溶液及各樣品溶液在6 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 依照“2.2”項(xiàng)下供試液制備方法 制備甘草單煎液，甘草與附子合煎樣品液各5份。分別取甘草單煎液0.4 mL，甘草與附子合煎液0.4 mL，加60%乙醇至8 mL，加10%氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，放置5 min，用60%乙醇定容至10 mL。測定吸光度，計(jì)算甘草苷平均含量的RSD分別為1.51%、2.24%，結(jié)果見表1。

表1 甘草單煎液重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（%）

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的供試品（分別單煎和合煎），加入甘草苷對照品，依照“2.4”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2、表3，平均回收率分別為98.06%、97.99%。

表2 甘草單煎液甘草苷加樣回收試驗(yàn)

表3 甘草與附子合煎液甘草苷加樣回收試驗(yàn)

2.9 甘草與附子不同比例配伍對甘草黃酮溶出過程的影響 分別取甘草5 g，按表4與附子不同比例配伍，加水 20 倍，浸漬 30 min，分別在煎煮 0、5、10、20、30、45、60、75、90 min 時間后定容至 50 mL，取定容0.4 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測定并計(jì)算甘草苷含量。結(jié)果見表4、圖1，甘草與附子不同比例各配伍組，均隨著時間變化甘草黃酮溶出增加，溶出變化趨勢基本一致，且60 min后含量保持基本穩(wěn)定。在同一時間點(diǎn)甘草與附子配伍后合煎比甘草單煎甘草苷的含量均降低，其中1∶3配伍時相同時間點(diǎn)甘草黃酮溶出明顯比其他配伍組低，其他配伍組變化比較接近。

表4 不同比例配伍后不同時間甘草苷含量的測定結(jié)果（%）

圖1 甘草與附子不同比例配伍后甘草黃酮動態(tài)溶出過程

3 討 論

甘草黃酮是甘草的主要有效成分，測定甘草黃酮的含量可以控制甘草生藥及含甘草制劑的質(zhì)量［14-16］。二氫黃酮甘草苷是甘草黃酮的重要成分，在堿性條件下紫外最大吸收峰紅移，減少溶劑的干擾。本實(shí)驗(yàn)采用樣品中加堿液的方法 ，在337 nm處測定吸光度，得線性回歸方程y=0.0712x+0.0248（R=0.9994），方法穩(wěn)定，可靠，操作簡便。

甘草與附子配伍后，能明顯改變煎煮過程活性成分的含量變化。楊明等分析附子與甘草合煎后生成的沉淀，發(fā)現(xiàn)在生成的沉淀中除有酯型生物堿成分、甘草皂苷類成分，還有甘草黃酮類成分 （以甘草苷為代表）［17］。甘草苷屬二氫黃酮類成分，含有7-羥基，而苷元甘草素含有7，4’-二羥基，均顯酸性，易與附子中的生物堿（包括酯型生物堿）發(fā)生沉淀反應(yīng)，從而可降低藥液中酯型生物堿含量，起到降低附子毒性的作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明，甘草與附子配伍后，甘草黃酮的溶出降低了，可能是甘草苷與附子中生物堿發(fā)生沉淀反應(yīng)所致。本實(shí)驗(yàn)研究甘草與附子不同比例配伍對甘草黃酮溶出過程的影響，結(jié)果同時也表明，甘草與附子不同比例各配伍組，隨著時間變化甘草黃酮溶出增加，60 min后含量保持基本穩(wěn)定，且在同一時間點(diǎn)甘草與附子配伍后合煎比甘草單煎甘草苷的含量降低，不同配伍比例后含量動態(tài)變化規(guī)律基本一致，其中甘草與附子1∶3配伍在相同時間點(diǎn)甘草黃酮溶出明顯比其他配伍組低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了中醫(yī)臨床配伍的科學(xué)性與合理性，中醫(yī)藥配伍必須通過合理煎煮以降低毒性，增加療效，發(fā)揮其特長，同時也有助于探討甘草對附子的解毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，初步為臨床用藥劑量設(shè)計(jì)及新藥開發(fā)研究提供了依據(jù)。