黑木耳多糖AAP-10對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

甘 霓，許海林，吳小勇*，尹 輝，黃延盛，寧初光

（1.廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310；2.廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，廣東 中山 528453；3.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣東 廣州 510006；4.無限極（中國）有限公司，廣東 新會 529156）

黑木耳（Auricularia auricula-judae）是一種大型食用真菌，是人工種植最早的商品菌類之一。目前我國黑木耳的年產(chǎn)量估計在300萬 t左右，黑木耳資源非常豐富。黑木耳的碳水化合物含量較高，一般占其子實體干質(zhì)量的60%以上，且大部分為非淀粉多糖[1]。相關(guān)研究表明黑木耳多糖具有免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗凝血等多種藥理活性[2-7]，被認為是黑木耳的主要功能因子之一。

天然多糖作為一種生物大分子，在組成、結(jié)構(gòu)方面存在多樣性；產(chǎn)地、菌種及提取、制備方法不同，得到的多糖在組成、結(jié)構(gòu)方面會存在一定的差異，進而影響其生物活性[8-12]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)自浙江龍泉地區(qū)的一種黑木耳不僅多糖含量較高，且其粗多糖具有增強小鼠非特異性免疫的功效[13]。為進一步開發(fā)該黑木耳多糖，本研究采用分級醇沉的方法從該黑木耳中獲得水溶性多糖AAP-10，并重點研究了其對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

近交系BALB/c小鼠，雌性，體質(zhì)量18～22 g，合格證號：SCXK（粵）2013-0020，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)（大學(xué)城）實驗動物中心。

黑木耳產(chǎn)自浙江龍泉，由無限極（中國）有限公司提供。

水解蛋白酶（novozym37071） 諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）、噻唑藍（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、葡萄糖、甘露糖等單糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；DEAE-52纖維素柱、Sephacryl S-400凝膠柱、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（重均分子質(zhì)量分別為670、270、80、25、12、5 kDa） 上海玉博生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、新生牛血清 美國GIBCO公司；印度墨汁 上海億欣生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752型紫外-可見分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司；1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；ELx808酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；CO2培養(yǎng)箱 上海安競實驗設(shè)備有限公司；BT100S/YZ15恒流泵 上海精科實業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳多糖的制備

取50.00 g粉碎過篩的黑木耳粉，按課題組前期優(yōu)化得到的黑木耳多糖提取最佳工藝進行黑木耳多糖提取[13]，重復(fù)提取3 次，合并3 次提取液，適當(dāng)濃縮后調(diào)節(jié)pH值至7.0，按底物質(zhì)量的1%加入水解蛋白酶，于55 ℃下攪拌酶解12 h以分解提取液中的游離蛋白。酶解結(jié)束后沸水浴加熱保溫20 min，滅酶，向其中緩慢加入一定量的無水乙醇，直至體系中乙醇的質(zhì)量分數(shù)達到10%，適當(dāng)攪拌使乙醇分布均勻后置于4 ℃冰箱中醇沉12 h，4 000 r/min離心10 min，收集沉淀物，用蒸餾水將其完全溶解。先用流動自來水透析24 h，再用蒸餾水透析48 h，期間每12 h換一次水，截留液冷凍干燥，得到一種初步精制的黑木耳多糖，命名為AAP-10。準(zhǔn)確稱質(zhì)量，記錄AAP-10凍干粉的質(zhì)量，以凍干粉質(zhì)量與黑木耳粉質(zhì)量之比計算黑木耳的多糖得率。

1.3.2 黑木耳多糖的纖維素柱層析和凝膠柱層析

準(zhǔn)確稱取AAP-10凍干粉0.30 g，溶于100 mL蒸餾水中，取經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后的多糖溶液10 mL，過DEAE-52纖維素柱，用1.5 g/L NaCl溶液洗脫，洗脫劑流速為1.0 mL/min，自動部分收集器每5 min收集一管溶液，以苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖含量。以管號為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制APP-10過DEAE-52纖維素柱的洗脫曲線，收集并合并同一部分。取收集到的主要洗脫部分5.00 mL，直接過Sephacryl S-400凝膠柱，用1.5 g/L NaCl溶液洗脫，采用與DEAE-52纖維素柱類似操作，繪制AAP-10過Sephacryl S-400凝膠柱的洗脫曲線。

1.3.3 黑木耳多糖理化性質(zhì)的測定

參照文獻[13]的方法，測定1.3.2節(jié)中配制好的AAP-10凍干粉水溶液（過濾膜前）的多糖含量，計算AAP-10的純度。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生高效液相色譜法測定多糖的糖基組成[14]；以不同重均分子質(zhì)量的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用高壓凝膠滲透色譜法測定多糖的分子質(zhì)量[15]。

1.3.4 動物實驗

取小鼠40 只，隨機分成5 組，分別為正常對照組、環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CPA）模型組以及AAP-10低、中、高劑量給藥組，每組8 只。除正常對照組外，其余各組連續(xù)3 d每天按體質(zhì)量80 mg/kg腹腔注射CPA，建立免疫低下小鼠模型。隨后，多糖給藥組每天灌胃給藥，根據(jù)前期研究結(jié)果，確定AAP-10低、中、高劑量組的多糖給藥量分別為2.5、5.0、10.0 mg/（kg·d），灌胃量均為0.2 mL/只，正常對照組和CPA模型組每天灌胃等體積的生理鹽水。期間每天定時測動物體質(zhì)量，2 周后（第17天），各組隨機取一半動物進行相關(guān)指標(biāo)檢測，另一半動物繼續(xù)灌胃2 周后（第31天）進行相關(guān)指標(biāo)檢測。以臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的比值表示臟器指數(shù)；采用MTT法通過ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗檢測小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖能力[16-17]；通過小鼠碳廓清實驗檢測單核-巨噬細胞功能[18]；采用乳酸脫氫酶測定法檢測自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性[19]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均以 ±s表示，運用SPSS 22.0軟件，采用單因素方差分析對組間差異進行比較，組內(nèi)比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AAP-10的基本理化性質(zhì)分析

由50.00 g黑木耳子實體干粉得到4.47 g初步精制的AAP-10，多糖得率為8.94%。苯酚-硫酸法測得AAP-10的純度為97.58%，說明其純度較高；紫外-可見分光光度計掃描結(jié)果表明，AAP-10的水溶液在260、280 nm波長處都沒有吸收峰出現(xiàn)，說明多糖凍干粉中不含核酸和蛋白質(zhì)。

圖 1 AAP-10過DEAE-52層析柱的洗脫曲線Fig. 1 Elution prof i le of AAP-10 on DEAE-52 column

圖 2 AAP-10過Sephacryl S-400凝膠柱的洗脫曲線Fig. 2 Elution prof i le of AAP-10 on Sephacryl S-400 column

從圖1可以看出洗脫曲線只有一個峰，說明AAP-10中多糖的性質(zhì)較為接近。由圖2可知曲線只有一個單一對稱峰，說明黑木耳多糖AAP-10為分子質(zhì)量分布較均一的多糖。糖基組成分析結(jié)果表明，AAP-10主要由葡萄糖和甘露糖組成，物質(zhì)的量比為6∶1；分子質(zhì)量分析結(jié)果表明，AAP-10的分子質(zhì)量為6.56×105Da。

2.2 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠體質(zhì)量的影響分析

CPA是一種應(yīng)用廣泛的化療藥物，屬于烷化劑類免疫抑制劑，常用于制備免疫抑制動物模型。一定劑量的CPA灌胃或注射，會引起動物體質(zhì)量下降、免疫器官質(zhì)量降低等生理反應(yīng)[20]。從圖3可以看出，注射CPA后，小鼠體質(zhì)量開始顯著下降，一直到第7天前后才開始停止下降并逐漸恢復(fù)，其中AAP-10中劑量組恢復(fù)得最快，CPA模型組及AAP-10高劑量組恢復(fù)得較慢。

圖 3 小鼠體質(zhì)量變化情況Fig. 3 Changes in body mass ofmice from each group

表 1 AAP-10給藥對小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of AAP-10 administration on body mass of mice

從表1可以看出，在實驗第1天各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異；與正常對照組相比，在第17天，CPA模型組小鼠體質(zhì)量顯著偏低（P＜0.05）；在第31天，CPA模型組和AAP-10高劑量組小鼠的體質(zhì)量均極顯著低于正常對照組（P＜0.01），但AAP-10低、中劑量組小鼠體質(zhì)量與正常對照組間差異不顯著。實驗結(jié)果說明，一定劑量的AAP-10給藥可改善CPA注射導(dǎo)致的小鼠體質(zhì)量低于正常對照組的現(xiàn)象。

2.3 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響

從表2可以看出，與正常對照組相比，CPA模型組及AAP-10給藥各組小鼠第17天的肝臟指數(shù)極顯著增大（P＜0.01）；AAP-10給藥各組小鼠第31天的肝臟指數(shù)與CPA模型組差異不明顯。CPA注射小鼠的體質(zhì)量略低于正常小鼠（表1），可能是導(dǎo)致其的肝臟指數(shù)高于正常對照組的原因之一。

表 2 AAP-10給藥對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of AAP-10 administration on liver index and spleen index of mice

CPA模型組小鼠的脾臟指數(shù)與正常對照組間差異不顯著；由于注射CPA會導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量下降，因此可以認為CPA注射導(dǎo)致了小鼠脾臟質(zhì)量低于正常小鼠。AAP-10給藥各組小鼠第17天的脾臟指數(shù)與正常組相比均極顯著升高（P＜0.01），與肝臟指數(shù)的結(jié)果類似，推測與CPA注射導(dǎo)致小鼠的體質(zhì)量略低于正常小鼠有關(guān)。與CPA模型組相比，在第17天，AAP-10給藥各劑量組小鼠的脾臟指數(shù)均極顯著增加（P＜0.01）；而在第31天，僅有AAP-10低劑量組小鼠脾臟指數(shù)極顯著增加（P＜0.01）。實驗結(jié)果表明，AAP-10給藥能在一定程度上升高CPA免疫抑制小鼠的脾臟指數(shù)，即緩解了CPA注射對小鼠脾臟的負面影響。

2.4 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖能力的影響分析

表 3 AAP-10給藥對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖能力的影響Table 3 Effect of AAP-10 administration on lymphocyte activity of mice

從表3可以看出，與正常對照組相比，CPA模型組小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖能力極顯著下降（P＜0.01），而AAP-10各劑量組小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖能力無顯著差異（P＞0.05）。與CPA模型組相比，AAP-10各劑量組小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖能力均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01），說明AAP-10能夠顯著提高免疫抑制小鼠的細胞免疫功能。

2.5 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠單核-巨噬細胞功能的影響分析

單核-巨噬細胞屬于機體固有免疫系統(tǒng)重要成員，具有免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)以及抗原遞呈等多種免疫功能。小鼠碳廓清實驗可用于評價小鼠單核-巨噬細胞吞噬廓清異體顆粒的能力，從而評價小鼠的非特異性免疫功能。

表 4 AAP-10給藥對小鼠碳廓清能力的影響Table 4 Effect of AAP-10 administration on carbon clearance capacity of mice

從表4可以看出，CPA模型組小鼠碳廓清能力極顯著低于正常對照組（P＜0.01），說明CPA注射導(dǎo)致小鼠單核-巨噬細胞吞噬廓清異體顆粒的能力有所下降。在第31天，AAP-10各劑量組小鼠碳廓清能力與正常對照組相比存在顯著差異（P＜0.05，P＜0.01），但一定劑量的多糖可使吞噬指數(shù)增大。與CPA模型組比較，在第17天，AAP-10各劑量組均能極顯著提高CPA免疫抑制小鼠的碳廓清能力（P＜0.01），但在第31天差異不顯著。從實驗結(jié)果可以看出，多糖給藥能改善CPA免疫抑制小鼠單核-巨噬細胞的吞噬廓清能力，說明AAP-10具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能。

2.6 AAP-10給藥對免疫抑制小鼠NK細胞活性的影響

表 5 AAP-10給藥對小鼠NK細胞活性的影響Table 5 Effect of AAP-10 administration on NK cell activity of mice

從表5可以看出，與正常對照組相比，CPA模型組小鼠的NK細胞活性雖有所下降，但差異不顯著（P＞0.05）；與CPA模型組相比，AAP-10各劑量組小鼠NK細胞活性在第17天均有顯著提高（P＜0.05，P＜0.01），但在第31天差異不顯著，可能是隨著時間的延長CPA對小鼠的負面影響逐漸減弱所致。

3 討 論

乙醇沉淀是將多糖從其水溶液中分離出來最常用的方法，該方法利用乙醇的脫水作用，降低多糖在水中的溶解度，使多糖沉淀析出。乙醇質(zhì)量分數(shù)不同，沉淀析出的多糖在組成結(jié)構(gòu)和功能方面會有一定的差別[21-23]。本研究利用質(zhì)量分數(shù)10%的乙醇溶液，從產(chǎn)自浙江龍泉地區(qū)的一種黑木耳的水提物中分離得到一種組成結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量分布較均一的多糖AAP-10，得率為8.94%，經(jīng)精制后純度達到97.58%。

惡性腫瘤是威脅人類健康的重大疾病，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)總體呈上升趨勢。據(jù)估計，我國2013年新發(fā)惡性腫瘤約368.2萬 例，死亡222.9萬 例，全國惡性腫瘤發(fā)病率為270.59/10萬 例，防控形勢非常嚴(yán)峻[24]。放化療是目前中晚期惡性腫瘤的主要治療方法，但副作用較大，且對有些惡性腫瘤療效并不理想。黑木耳多糖被報道具有明顯的抗腫瘤活性[25-26]，在我國民間也有在將黑木耳作為腫瘤放化療病人輔食的做法。CPA是一種烷化劑，可干擾DNA及RNA功能，抑制DNA合成，發(fā)揮殺傷腫瘤細胞的作用，但對機體正常細胞也有殺傷作用，具有免疫抑制等毒副作用[27-28]。多糖能夠在一定程度上調(diào)節(jié)機體的免疫功能，拮抗CPA的毒副作用，發(fā)揮減毒增效作用[29-30]。脾臟是重要的外周免疫器官，是機體對血源性抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要場所。本研究結(jié)果表明，一定劑量的AAP-10給藥能緩解CPA注射對小鼠脾臟的負面影響。此外，較低劑量（2.5～5.0 mg/（kg·d））的AAP-10給藥就能增強CPA免疫抑制小鼠的脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖能力、單核-巨噬細胞的吞噬廓清能力、NK細胞活性。因此可以認為，黑木耳多糖AAP-10具有增強CPA免疫抑制小鼠免疫功能的作用，且在保健食品、特殊醫(yī)學(xué)用途食品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。