黑靈芝多糖對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1/M2表型轉(zhuǎn)化的影響

劉 想，付王威，牛曉琴，顏雨新，張賢益，李文娟,*

（1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330008；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

巨噬細(xì)胞是全身或局部炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞。炎癥狀態(tài)下，外周血單核細(xì)胞進(jìn)入組織分化形成巨噬細(xì)胞，其可通過分泌細(xì)胞因子及抗原提呈等作用影響并調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)的進(jìn)程[1-2]。在不同激活方式的刺激下，巨噬細(xì)胞可表現(xiàn)出不同的免疫表型及功能，主要包括經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞（M1型）和替代活化型巨噬細(xì)胞（M2型）兩類。M1和M2型巨噬細(xì)胞可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)過程中的天然免疫應(yīng)答[3]。在炎癥反應(yīng)初期，多介質(zhì)誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加，有利于病原微生物的清除；隨著炎癥反應(yīng)進(jìn)展，M2型巨噬細(xì)胞比例逐漸增加，促進(jìn)炎癥損傷的修復(fù)[4]。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是全身炎癥反應(yīng)綜合征的一種重要致病因子。其通過與各種免疫細(xì)胞表面相應(yīng)的模式識(shí)別受體相結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞，繼而激活多條炎癥通路，產(chǎn)生一系列促炎因子，引起機(jī)體嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[5-6]。有趣的是，LPS所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中存在M1/M2型巨噬細(xì)胞分化的失衡，表現(xiàn)為促炎型M1型細(xì)胞增多，而抗炎型M2型細(xì)胞減少[7]。由此，通過調(diào)控炎癥型M1型巨噬細(xì)胞向抗炎型M2型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)化有助于改善LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，可為炎癥的防治提供新思路。

黑靈芝（Ganoderma atrum）是我國江西省贛南地區(qū)的一種特色資源，其作為藥物和功能食品已有兩千余年的應(yīng)用歷史，但迄今為止，有關(guān)其活性組分的研究國內(nèi)外鮮有報(bào)道[8]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)黑靈芝的活性組分——多糖進(jìn)行了分離純化，得到的一種水溶性多糖，命名為PSG-1?；钚怨δ苎芯孔C實(shí)黑靈芝多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[9]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)在LPS致炎巨噬細(xì)胞中，黑靈芝多糖可顯著抑制LPS介導(dǎo)的NO和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β的過度釋放，具有抗炎作用[10]。然而，黑靈芝多糖是否可調(diào)控促炎型M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)向抗炎型M2型巨噬細(xì)胞，并由此途徑改善LPS介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，仍需進(jìn)一步闡明。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)別的昆明小鼠，雌雄不限，體質(zhì)量（20.00±2.00）g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（贛）2006-0001，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（贛）2005-0001，所購昆明小鼠飼養(yǎng)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)科部（使用許可證：SCXK（贛）2015-0001）。

黑靈芝多糖為本實(shí)驗(yàn)室自行制備[9]。

DMEM 美國GIBCO公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司；中性紅 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；FITC-大鼠抗小鼠甘露糖受體（mannose receptor，MR：CD206） 英國AbDSerotec公司；抗MR抗體 美國Abcam公司；細(xì)胞因子IL-1β試劑盒上海申雄科技實(shí)業(yè)有限公司；細(xì)胞因子IL-10試劑盒武漢博士德生物工程有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑盒和NO試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；二氧化碳培養(yǎng)箱日本TOSHIBA公司；倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；752紫外分光光度計(jì)、MD-200-3型電子天平 上海第三分析儀器廠；3K15-高速冷凍離心機(jī) 美國Sigma公司；FACSCaliburTM流式細(xì)胞儀 美國Becton Dickinson公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

小鼠頸椎脫臼處死后，立即浸泡于碘伏中并迅速移入細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)，保持無菌狀態(tài)靜置5 min；隨后將小鼠浸入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇3 min，用眼科彎鑷取出小鼠并放置于醫(yī)用搪瓷彎盤中；止血鉗鈍性分離小鼠腹部皮膚，暴露腹壁并向腹腔內(nèi)注入4～5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），輕揉小鼠腹部2 min左右；用眼科剪于小鼠側(cè)腹壁下方（左右均可）剪一約3 mm左右的小口，注射器吸取腹腔液并移入離心管中。合并腹腔液，1 000×g離心8 min并棄上清液，收集細(xì)胞沉淀并采用含血清DMEM完全培養(yǎng)基重懸。臺(tái)盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞比例大于95%的前提下，應(yīng)用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度并分別接種于96 孔培養(yǎng)板和6 孔培養(yǎng)板中，最后將培養(yǎng)板放置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4 h后取出培養(yǎng)板，換液并棄去未貼壁的細(xì)胞，即得到小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

1.3.2 LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組

原代培養(yǎng)純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，隨機(jī)分為4 組，每個(gè)處理組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔。1）對(duì)照組：腹腔巨噬細(xì)胞中給予等體積的含血清完全培養(yǎng)基；2）LPS組：腹腔巨噬細(xì)胞中給予相同體積的完全培養(yǎng)基，24 h后給予LPS（1 μg/mL）刺激24 h；3）PSG-1（40、80、160 μg/mL）+LPS組：本實(shí)驗(yàn)室PSG-1的劑量選擇40、80、160 μg/mL預(yù)處理腹腔巨噬細(xì)胞24 h后，加入LPS（1 μg/mL）刺激24 h，全程給予PSG-1；4）抗MR抗體+LPS+PSG-1：加入抗MR抗體（10 μg/mL）孵育巨噬細(xì)胞30 min后，再加入PSG-1（160 μg/mL）處理24 h，最后加入LPS（1 μg/mL）刺激24 h，全程給予PSG-1和抗MR抗體。

1.3.3 中性紅檢測巨噬細(xì)胞吞噬活性

按組分別收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，3 000 r/min離心3 min后吸去上清液，PBS洗滌沉淀細(xì)胞2 次。收集細(xì)胞接種于培養(yǎng)孔中，加入中性紅溶液培養(yǎng)4 h，離心去除上清液并用PBS洗滌3 次。在每孔中加入1 mL細(xì)胞裂解液，在室溫下放置2～3 h以完全裂解細(xì)胞。在多功能酶標(biāo)儀上測定540 nm波長處的吸光度（A540nm）[11]。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平

按組分別收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，3 000 r/min離心3 min后吸去上清液，PBS洗滌沉淀細(xì)胞2 次。加入0.5 mL DCFH-DA溶液（10 μmol/L）重懸細(xì)胞，避光37 ℃孵育20 min后，3 000 r/min離心3 min，棄上清液，PBS洗滌2 次，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)7’-二氯熒光素（7’-dichlorofluorescein，DCF）的熒光強(qiáng)度，以DCF的熒光強(qiáng)度來反映細(xì)胞內(nèi)ROS的含量[12]。

1.3.5 Griess法測定NO的生成

按組分別收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液。按照NO檢測試劑盒方法檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO含量。

1.3.6 ELISA法測定細(xì)胞因子生成

采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（e nzyme-l i nke d immunosorbent assay，ELISA）檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子（IL-1β和IL-10）質(zhì)量濃度。應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀在492 nm波長處測定吸光度（A492nm），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出實(shí)驗(yàn)樣本中細(xì)胞因子的質(zhì)量濃度。

1.3.7 流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞MR表達(dá)

按組分別收集小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，3 000 r/min離心3 min后吸去上清液，PBS洗滌沉淀細(xì)胞2 次后加100 μL PBS重懸細(xì)胞；加入10 μL FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD206抗體檢測巨噬細(xì)胞MR的表達(dá)，同型對(duì)照管加入10 μL對(duì)照試劑FITC-IgG2a。4 ℃條件下避光培養(yǎng)30 min后，PBS洗滌2 次以去除未結(jié)合的抗體；重懸細(xì)胞液定量至0.5 mL左右，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測并記錄各組MR的熒光強(qiáng)度[13]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PSG-1對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

圖 1 PSG-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響Fig. 1 Effect of PSG-1 on neutral red phagocytosis by LPS-induced macrophages

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬中性紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，與對(duì)照組相比，LPS對(duì)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性有明顯的增強(qiáng)作用。在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同質(zhì)量濃度的PSG-1后，與LPS組相比，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性顯著下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PSG-1能顯著抑制LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)。

2.2 PSG-1抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1表型極化

圖 2 PSG-1對(duì)LPS處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M1表型極化的影響Fig. 2 Effect of PSG-1 on M1 polarization of LPS-induced mouse peritoneal macrophages

M1型巨噬細(xì)胞可高分泌細(xì)胞因子IL-1β和NO等，并可促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，參與炎癥反應(yīng)及病菌清除，體內(nèi)產(chǎn)生過量促炎因子時(shí)即導(dǎo)致有害的炎癥損傷發(fā)生[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，LPS組中的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β（圖2A）和NO（圖2B）的水平顯著增加，腹腔巨噬細(xì)胞中ROS（圖2C、D）的生成量亦顯著升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS可誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M1型極化。而與LPS組相比，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同質(zhì)量濃度的PSG-1后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中IL-1β、NO和ROS的水平顯著下降，表明PSG-1能抑制LPS對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M1型極化的誘導(dǎo)。

2.3 PSG-1促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M2表型極化

圖 3 PSG-1對(duì)LPS處理的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M2表型極化的影響Fig. 3 Effect of PSG-1 on M2 polarization of LPS-induced mouse peritoneal macrophages

IL-10和MR作為M2型巨噬細(xì)胞的特征性參數(shù)，常用于M2型巨噬細(xì)胞極化的研究中。M2型巨噬細(xì)胞可表現(xiàn)為IL-10的高分泌和MR的高表達(dá)[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10的水平顯著增加（圖3A）；熒光探針FITC-MR標(biāo)記小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，可發(fā)現(xiàn)MR的熒光強(qiáng)度顯著下降（圖3B、C）。與LPS組相比，PSG-1處理可顯著性上調(diào)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中MR的表達(dá)與IL-10的水平。這些數(shù)據(jù)提示PSG-1在抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞向M1型極化的同時(shí)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。

2.4 PSG-1通過MR調(diào)控LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1/M2表型轉(zhuǎn)化

圖 4 PSG-1通過MR調(diào)控LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1/M2表型轉(zhuǎn)化Fig. 4 Effect of PSG-1 on M1/M2 polarization of mouse peritoneal macrophages via MR

將中性紅溶液加入小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，通過檢測培養(yǎng)液的吸光度來反映巨噬細(xì)胞的吞噬活性。吞噬結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖4A），應(yīng)用抗MR抗體預(yù)處理后，與LPS+PSG-1組相比，巨噬細(xì)胞的吞噬能力有所上升，即PSG-1對(duì)于LPS所介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞吞噬增強(qiáng)的抑制作用顯著下降，表明PSG-1是通過MR顯著抑制LPS激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能。同時(shí)，抗MR抗體處理也可阻斷PSG-1對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的M1/M2炎癥表型分化的調(diào)控。如圖4B～F所示，與LPS+PSG-1組相比，抗MR抗體可顯著上調(diào)NO、IL-1β和ROS的生成，由此阻斷PSG-1對(duì)巨噬細(xì)胞M1表型極化的抑制。觀察抗MR抗體對(duì)IL-10的分泌的影響可以發(fā)現(xiàn)（圖4D），與LPS+PSG-1組相比，抗MR抗體預(yù)處理組中IL-10的分泌顯著下降，由此提示抗MR抗體可抑制巨噬細(xì)胞的M2型極化。

3 討 論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，其極化模式的調(diào)控對(duì)維系健康十分重要，相關(guān)研究也已成為新的熱點(diǎn)[16]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用LPS建立體外炎癥模型，研究PSG-1對(duì)LPS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化模式的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PSG-1具有抗炎作用，其機(jī)理與PSG-1通過促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中MR的表達(dá)，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞的M1型極化而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化密切相關(guān)。

在多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均存在著巨噬細(xì)胞的極化現(xiàn)象。基于巨噬細(xì)胞較高的可塑性和異質(zhì)性，在不同的組織微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞可向M1和M2兩種類型極化[17]。M1型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為高分泌IL-1β和NO等炎性細(xì)胞因子，并促進(jìn)ROS的產(chǎn)生[14]。IL-1β是一種由活化的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在刺激免疫細(xì)胞增殖、分化中起重要作用。過量的IL-1β可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致多種臟器發(fā)生損傷。NO是一種重要的活性介質(zhì)，炎癥反應(yīng)過程分泌的IL-1β可誘導(dǎo)其過量產(chǎn)生，從而進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)[18]。ROS是細(xì)胞有氧代謝的副產(chǎn)物，主要包括過氧化物和氧自由基。在炎癥反應(yīng)中，炎癥細(xì)胞發(fā)生呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致組織細(xì)胞壞死凋亡，加重炎性反應(yīng)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞給予LPS后，與對(duì)照組相比，LPS組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和NO的水平顯著增加，ROS生成亦顯著升高，表明LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出M1表型極化。與LPS組相比，PSG-1組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中IL-1β、NO和ROS的水平顯著下降，由此表明PSG-1可抑制LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向M1型極化。研究證實(shí)，IL-10的高分泌和MR的高表達(dá)常常被用于M2型巨噬細(xì)胞極化研究[15]。IL-10是一種抗炎細(xì)胞因子，其在控制炎癥反應(yīng)的發(fā)展中有著至關(guān)重要的作用[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與LPS組相比，PSG-1顯著性上調(diào)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IL-10的水平，因此推測PSG-1可促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞向M2型極化。巨噬細(xì)胞的極化方向可有效反映機(jī)體局部組織的炎癥狀態(tài)。對(duì)巨噬細(xì)胞極性分化的深入探索，并通過調(diào)控炎性疾病中的極化失衡狀態(tài)將有望開拓新的免疫相關(guān)疾病的治療方法[20]。

此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)PSG-1在發(fā)揮調(diào)控LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1/M2表型轉(zhuǎn)化作用的同時(shí)，還可促進(jìn)MR的表達(dá)。MR是最早在巨噬細(xì)胞上被發(fā)現(xiàn)的一類非Toll樣模式識(shí)別受體，是一種分子質(zhì)量為175 kD的糖蛋白，屬于C型植物凝集素家族[21]。作為先天性免疫和后天性免疫的橋梁，MR在巨噬細(xì)胞極化過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在M2型巨噬細(xì)胞中MR呈現(xiàn)特征性上調(diào)，因而被作為M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物[22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PSG-1在發(fā)揮抗炎作用的同時(shí)，能顯著增加MR的表達(dá)。應(yīng)用抗MR抗體處理后，PSG-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化模式調(diào)控作用減弱，抗炎作用顯著降低。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均提示PSG-1抑制LPS介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化與MR有關(guān)。

近年來，越來越多的研究證實(shí)多糖激活免疫細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用主要是通過與細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（包括MR）相結(jié)合而介導(dǎo)的[23-24]。MR胞外段結(jié)構(gòu)包括富含半胱氨酸區(qū)域，II型纖連蛋白重復(fù)區(qū)和8～10 個(gè)C型凝集素樣糖類識(shí)別域。MR結(jié)構(gòu)中的糖類識(shí)別區(qū)域，可識(shí)別并結(jié)合以D-甘露糖、L-巖藻糖和N-乙酰葡萄糖胺等糖殘基為末端的糖類物質(zhì)[25-27]。在免疫研究中，MR無疑是一個(gè)新的設(shè)計(jì)靶標(biāo)，并以此推動(dòng)以甘露糖為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的多糖免疫調(diào)節(jié)研究[28]。有趣的是，黑靈芝多糖的結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)顯示甘露糖是黑靈芝多糖的主要單糖組分[29]。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PSG-1對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1/M2表型極化的調(diào)控與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，可能與PSG-1結(jié)構(gòu)中甘露糖單糖組成有關(guān)。黑靈芝多糖與MR之間結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)聯(lián)，可為黑靈芝多糖研究確立新的分子靶點(diǎn)。此外，在以后的研究中，將從巨噬細(xì)胞極化出發(fā)，進(jìn)一步探討黑靈芝多糖對(duì)極化相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控及機(jī)制。