低溫貯藏不同年限的鴨茅種子活力變化

張 旭，聶 剛，黃琳凱，周 洲，唐 露，張新全

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，四川 成都 611130)

鴨茅(Dactylisglomerata)又被稱為雞腳草、果園草，系禾本科鴨茅屬，原產(chǎn)于歐洲、北非及亞洲溫帶地區(qū)。鴨茅因其極耐陰，適應(yīng)性好，再生性強(qiáng)，常被用于栽培草地和混播草地建植[1]。同時(shí)，鴨茅在巖溶石漠化治理及南方草山草坡改良、草地畜牧業(yè)發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用[2]。近年來國家先后提出了“草牧業(yè)”及“糧改飼”戰(zhàn)略方針，特別是西南石漠化地區(qū)治理工程實(shí)施后，鴨茅等牧草種子需求日益增加。相對于其他禾本科牧草種子，鴨茅單株小花數(shù)多，但結(jié)實(shí)性和飽滿度差，種子偏小，種子清選困難，發(fā)芽率相對偏低。有研究表明，國外引進(jìn)的商品種種子發(fā)芽率7-14 d為70%左右[3]，而國內(nèi)野生栽培馴化品種發(fā)芽率在50%左右[4]，田間試驗(yàn)表明，播種20～30 d后仍有少量可相繼發(fā)芽出苗，其余種子可能因?yàn)榄h(huán)境原因?qū)е掳l(fā)育不理想，進(jìn)而難以發(fā)芽出苗[5]。

種子是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中重要的生產(chǎn)資料，種子質(zhì)量的好壞是保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一。種質(zhì)資源能夠長期保存是品種改良的前提，種子更是植物種質(zhì)資源長期保存的理想材料[6]。伴隨著種子貯藏時(shí)間的延長，種子會不斷地老化，使得種子活力持續(xù)下降。其中種子貯藏含水量、貯藏溫度、貯藏年限一直被認(rèn)為是影響種子壽命的關(guān)鍵因素[7-9]?？寡趸缸鳛榧?xì)胞內(nèi)的自由基清除劑，能夠降低種子老化過程中自由基對種子細(xì)胞膜的攻擊，使得細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化作用降低，從而降低種子老化速率。丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，是衡量種子老化的關(guān)鍵指標(biāo)。近年來，在小麥(Triticumaestivum)[10]、油菜(Brassicanapus)[11]、水稻(Oryzasativa)[12]、苜蓿(Medicagosativa)[13]、洋蔥(Alliumcepa)[14]、玉米(Zeamays)[15]上許多學(xué)者利用高溫、高濕、人工加速老化及超干處理等一系列手段來研究種子老化劣變規(guī)律。結(jié)果表明，人工處理下高溫、高濕、高水分的條件能在短時(shí)間內(nèi)使種子膜透性增加，抗氧化酶活性下降，MDA含量上升，種子活力下降。

本研究以低溫貯藏不同年限的鴨茅種子為試驗(yàn)材料，對不同貯藏年限的鴨茅種子進(jìn)行種子質(zhì)量與酶活性的評價(jià)，以期了解鴨茅種子在貯藏過程中的生理變化機(jī)制，并找出鴨茅種子貯藏的最佳期限，為種子生產(chǎn)貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)系雅安基地2009-2017年的鴨茅種子。貯藏溫度為2～4 ℃，種子均收自雅安鴨茅繁種試驗(yàn)地。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1種子標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽率測定 種子發(fā)芽率測定參照ISTA(2011)規(guī)定[16]進(jìn)行。選取均勻飽滿的鴨茅種子，將其放置于預(yù)先鋪好3層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中。每個(gè)培養(yǎng)皿放置100粒鴨茅種子，4個(gè)重復(fù)，在20 ℃條件下放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。初次計(jì)數(shù)為第7天，末次計(jì)數(shù)為第15天，分別計(jì)算種子發(fā)芽勢與發(fā)芽率：

發(fā)芽勢=7 d正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)(100粒)×100%；

發(fā)芽率=15 d正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)(100粒)×100%。

1.2.2種子生理生化指標(biāo)測定 粗酶液提?。喝豇喢┓N子0.1 g，在液氮中研磨組織破碎后，待液氮完全揮發(fā)后加入預(yù)冷磷酸緩沖液提取，斡旋震蕩至勻漿，將勻漿在4 ℃，8 000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液。將粗酶液分裝到各管進(jìn)行MDA和抗氧化酶活性測定。SOD活性采用核黃素-氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法[17]測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[18]測定，過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法[18]測定，MDA采用硫代巴比妥酸法(TBA)比色法測定[19]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入統(tǒng)計(jì)和圖表繪制。采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Duncan法對不同的年份進(jìn)行多重比較，用Pearson相關(guān)性分析不同貯藏年限的種子活力與生理指標(biāo)的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏年限對鴨茅種子萌發(fā)特性的影響

在4 ℃的低溫貯藏條件下，鴨茅種子的發(fā)芽勢隨著貯藏年限的增加大體呈現(xiàn)出先增加再降低的趨勢(圖1)。其中貯藏前4年總體呈現(xiàn)上升的趨勢，至貯藏4年時(shí)達(dá)到了55.50%，顯著高于貯藏1、2、3年(P<0.05)。隨著貯藏時(shí)間的進(jìn)一步延長，發(fā)芽勢呈明顯下降趨勢，貯藏5年以后，鴨茅的發(fā)芽勢急劇下降，平均每年下降10%，種子老化加劇。低溫貯藏下，在一定的貯藏時(shí)間內(nèi)鴨茅種子的發(fā)芽勢會維持在較高的水平。

圖1 貯藏年限對鴨茅種子萌發(fā)特性的影響Fig. 1 Effect of storage duration on germination characteristics of seeds

不同字母表示不同貯藏年限間差異顯著(P<0.05)。下同。

Different lowercase letter indicate significant differences between different storage durations at the 0.05 level; similarly for the following figures.

在4 ℃的低溫貯藏條件下，鴨茅種子的發(fā)芽率也呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，與發(fā)芽勢的變化趨勢相一致。鴨茅種子發(fā)芽率在貯藏的前4年中逐年增高，在第4年時(shí)達(dá)到最高(67.00%)，且在第7年時(shí)出現(xiàn)急劇下降的趨勢?？梢?，在低溫的貯藏條件下，鴨茅種子能長期維持較高的發(fā)芽率。貯藏7年以后的鴨茅種子發(fā)芽率明顯降低，顯著低于其他各年(P<0.05)，已經(jīng)不適宜生產(chǎn)利用。值得注意的是，鴨茅在貯藏5年后其發(fā)芽勢下降趨勢比發(fā)芽率下降的更快，表明長時(shí)間貯藏時(shí)發(fā)芽勢的降低先于發(fā)芽率。

2.2 貯藏年限對鴨茅種子抗氧化酶活性的影響

2.2.1貯藏年限對SOD的影響 在4 ℃低溫的貯藏條件下，貯藏1、2年的鴨茅種子的SOD活性顯著高于其他貯藏年限的鴨茅種子(P<0.05)(圖2)。就變化幅度而言，前4年SOD的降速幅度較大，平均每年下降14.85%。隨著貯藏時(shí)間的延長，SOD活性逐年下降并在貯藏的第5年后SOD活性變化趨于穩(wěn)定，各年間差異不顯著(P>0.05)。SOD作為種子抗氧化酶中的第一道防線，可以歧化O2-生成H2O2。在貯藏的前幾年一直保持高活性，使得鴨茅種子在貯藏早期能抵抗劣變對其萌發(fā)的影響。伴隨著種子老化的加劇，SOD活性逐漸降低。

圖2 不同貯藏年限種子SOD活性變化Fig. 2 Changes in the SOD activity of seeds for different storage durations

2.2.2貯藏年限對POD的影響 在4 ℃低溫的貯藏條件下，鴨茅種子POD活性呈現(xiàn)了先上升再下降的趨勢變化，其中貯藏3年的鴨茅種子POD活性最高，顯著高于除貯藏兩年外的其他各年的鴨茅種子活性(P<0.05)(圖3)。就變化幅度而言，貯藏3年內(nèi)種子POD活性增幅不明顯；但貯藏3年后POD活性的降幅差異明顯，年均降幅達(dá)15.43%。POD是抗氧化酶中關(guān)鍵的酶之一，在種子貯藏的前幾年中提高自身活性來抵抗老化帶來的傷害。但隨著貯藏年限增加，由于種子自身機(jī)能顯著降低，難以維持其自身酶活性，呈現(xiàn)急劇下降趨勢。

圖3 不同貯藏年限種子POD活性變化Fig. 3 Changes in the POD activity of seeds for different storage durations

2.2.3貯藏年限對CAT的影響 在4 ℃的低溫貯藏條件下，隨著貯藏年限逐年增加，鴨茅種子CAT酶活性呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并在第5年的時(shí)候達(dá)到最高，其活性顯著高于其他各年(P<0.05)(圖4)。就變化幅度而言，前3年間CAT酶活性增加并不明顯，但5年內(nèi)的種子酶活性年均增幅高達(dá)10.26%；而從第5年之后，CAT酶活性開始急劇下降，平均降幅達(dá)到19.58%。由此可見，作為生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，CAT酶在種子貯藏的前幾年提高其活性來抵抗自身老化帶來的傷害，但隨著貯藏年限增加，由于種子自身機(jī)能顯著降低，難以維持其自身酶活性，呈現(xiàn)急劇下降趨勢。

圖4 不同貯藏年限種子CAT活性變化Fig. 4 Changes in the CAT activity of seeds for different storage durations

總體上看，3種抗氧化酶均隨著貯藏時(shí)間的延長而活性降低，SOD活性在貯藏前兩年保持最高，并隨后降低。POD活性在第3年保持最高，CAT活性在貯藏第5年保持最高。研究表明，種子在低溫貯藏中，隨著貯藏年限的延長，脂質(zhì)的過氧化作用增強(qiáng)，為抵抗老化對種子的傷害，通過提高自身的抗氧化酶活性來降低傷害。抗氧化酶之間具有協(xié)同作用，分別在不同的貯藏年限中發(fā)揮作用。

2.2.4貯藏年限對MDA的影響 MDA含量的高低在一定程度上可以衡量膜質(zhì)過氧化水平，在4 ℃低溫的貯藏條件下，鴨茅種子MDA含量隨著貯藏年限的延長出現(xiàn)了緩慢上升的趨勢(圖5)。在前3年內(nèi)的貯藏年限中，呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(P<0.05)，隨著貯藏年限的進(jìn)一步延長MDA含量變化不明顯，呈現(xiàn)上升的趨勢。值得注意的是，MDA含量與種子的發(fā)芽勢及發(fā)芽率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(表1)，說明MDA雖對鴨茅種子的正常膜結(jié)構(gòu)造成了一定的影響，但與種子的萌發(fā)的相關(guān)關(guān)系不顯著。

圖5 不同貯藏年限種子MDA含量變化Fig. 5 Change in the MDA content of seeds for different storage durations

測試指標(biāo)Test index發(fā)芽勢Germination potential發(fā)芽率Germination rateSOD活性SOD activityPOD活性POD activityCAT活性CAT activityMDA含量MDA content發(fā)芽勢Germination potential1.000發(fā)芽率Germination rate0.936**1.000SOD活性SOD activity0.9950.8421.000POD活性POD activity0.832**0.808**0.3421.000CAT活性CAT activity0.847**0.918**-0.1980.695*1.000MDA含量 MDA content-0.402-0.296-0.739*-0.489-0.0331.000

*表示在0.05水平上顯著相關(guān)，**在0.01水平上極顯著相關(guān)。

* and ** indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 level, respectively.

2.3 不同貯藏年限種子萌發(fā)指標(biāo)與生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

在種子老化過程中，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率是評價(jià)種子生活力的指標(biāo)。SOD、CAT和POD這3種酶是細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)中的重要組成，能夠協(xié)同作用防止種子的過氧化。低溫下不同貯藏年限的鴨茅種子活力與MDA含量均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但不顯著(表1)。POD活性和CAT活性與種子活力呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。在低溫貯藏的條件下，種子活力與抗氧化酶活性變化關(guān)系密切?？寡趸甘呛饬糠N子種用價(jià)值的重要指標(biāo)，抗氧化酶活性的降低意味著種子活力下降，種子種用價(jià)值降低。

3 討論

本研究選用了在低溫條件下9種不同貯藏年限的鴨茅種子，通過測定其種子萌發(fā)指標(biāo)和抗氧化酶活性進(jìn)行種子劣變評價(jià)，得出了鴨茅適宜的貯藏年限為5年。本研究表明，鴨茅種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢在低溫保存下，一定年限內(nèi)能穩(wěn)定萌發(fā)，保持較高的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，但是隨著貯藏年限的增加，種子劣變加速，其發(fā)芽指標(biāo)呈現(xiàn)降低的變化趨勢。前人在羊草(Leymuschinensis)[20]、結(jié)縷草(Zoysiajaponica)[21]、狗牙根(Cynodondactylon)[22]、披堿草(Elymusdahuricus)[23]和老芒麥(Elymussibiricus)[24]等種子老化研究中，自然條件下貯藏的種子在2～3年后種子活力急劇下降，基本喪失利用價(jià)值。本研究采用的是低溫貯藏的種子材料，結(jié)果表明低溫貯藏較自然條件下貯藏種子活力下降明顯變緩，貯藏時(shí)間更久。

相關(guān)報(bào)道表明，種子老化常伴隨著酶活性的變化，SOD、CAT、POD是細(xì)胞內(nèi)的3種酶活性氧清除劑。保護(hù)生物膜系統(tǒng)免受活性氧自由基損傷，活性越高，說明種子的抗逆能力越強(qiáng)[25]。其中SOD可以歧化O2-生成H2O2。CAT和POD則是H2O2的清除劑。三者協(xié)同作用，保護(hù)鴨茅種子生物膜。本研究表明，在一定的貯藏年限內(nèi)，鴨茅種子內(nèi)的CAT、POD活性都呈上升趨勢，在5年內(nèi)的貯藏時(shí)間里，表現(xiàn)出了一定的協(xié)同作用，其活性分別在不同年限達(dá)到最高。其中SOD作為抵御氧化逆境自由基形成的第一道防線，在貯藏的前兩年，SOD表現(xiàn)出的較高的活性，以O(shè)2-為基質(zhì)進(jìn)行歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為H2O2。清除了活性氧的毒害，減輕脂質(zhì)過氧化作用[26-28]。隨著老化程度的加劇，逆境脅迫加重，SOD活性被H2O2抑制，活性下降，POD的活性被激活，形成了第二道防線，在貯藏3年時(shí)POD活性達(dá)到峰值，相關(guān)性分析表明，POD與種子活力極顯著正相關(guān)。伴隨著老化程度的加強(qiáng)，CAT活性逐步升高，在貯藏5年時(shí)，CAT活性達(dá)到最高(P<0.05)。CAT具有較強(qiáng)的催化能力，是植物氧化和抗氧化的關(guān)鍵酶，可以專一清除H2O2[29]。相關(guān)性分析表明，CAT與種子活力極顯著相關(guān)。在貯藏5年以后，SOD、POD、CAT活性水平均大幅下降，這與Jeng和Sung[30]、姜義寶等[31]研究一致。這是因?yàn)槔匣幼兗由钍沟妹复倏寡趸到y(tǒng)自身遭受了損害，種子劣變程度加劇，活力下降，其種用價(jià)值降低。

MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，它對種子有毒害作用，可以作為逆境脅迫程度的指示[32]。本研究中，MDA的含量隨著貯藏年限的增加逐步上升，這與前人[27,33]研究基本一致。老化使得鴨茅種子的MDA含量逐漸增加，但與種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率沒有顯著的相關(guān)性，可能供試種子是在低溫條件下貯藏的，且試驗(yàn)?zāi)晗掭^短，不能很好地反映出MDA含量與萌發(fā)指標(biāo)的明顯關(guān)系[34]。

4 結(jié)論

低溫貯藏中，SOD、CAT和POD活性是影響鴨茅種子萌發(fā)的關(guān)鍵因素。種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率較高時(shí)，其種子內(nèi)的抗氧化酶活性也較高，隨著老化加劇，種子活力逐步喪失。低溫貯藏條件下，鴨茅種子表現(xiàn)出了較強(qiáng)的耐貯性，種子的最長貯藏年限可達(dá)5年，5年后種子劣變加劇，其種用價(jià)值降低。本研究中MDA含量高低并不能很好地表現(xiàn)出對鴨茅種子萌發(fā)的影響。