耐低氮假儉草種質(zhì)篩選

李丹丹,宗俊勤,陳靜波,郭海林,汪 毅,劉建秀

(江蘇省中國科學(xué)院植物研究所,江蘇 南京 210014)

氮是草坪草生長發(fā)育需要量最多的營養(yǎng)元素[1]。合理施用氮肥可明顯改善草坪色澤,提高草坪質(zhì)量[2],增加草坪密度,增強草坪抗性和提高草坪恢復(fù)能力[3]。但在實際生產(chǎn)應(yīng)用中，由于缺乏合理的養(yǎng)分管理措施和技術(shù)指導(dǎo)，過量施用氮肥的現(xiàn)象非常普遍。氮肥施用過多一方面提高了草坪的養(yǎng)護成本，另一方面過量的氮素通過淋洗、徑流、反硝化氣態(tài)損失而浪費掉，會對土壤、水體等產(chǎn)生不良的環(huán)境影響[4-6]。Christopher等[7]對澳大利亞本土的草坪草種質(zhì)資源進行評價，發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)間對氮素的吸收利用存在很大變異。我國本土具有豐富的草坪草種質(zhì)資源，這些種質(zhì)對氮的吸收利用也可能存在顯著變異。而利用草坪草自身對氮素吸收利用的遺傳性差異，選育低氮營養(yǎng)下氮高效的草坪草種質(zhì)資源對提高氮素利用效率和保護環(huán)境具有重要意義。

假儉草(Eremochloaophiuroides)是禾本科黍亞科蜈蚣草屬植物，是該屬中唯一可以用作草坪草的多年生草本植物[8]，除在東南亞有少量分布外，主要分布在我國長江流域及其以南地區(qū)，被稱為“中國草坪草”[9]。假儉草葉形優(yōu)美，植株低矮，生長緩慢，具有耐陰、抗病、抗蟲、耐瘠薄等優(yōu)良特性，可用作庭院草坪、園林綠化及保土護坡草坪，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[10-11]。1916年Frank Meyer從我國西南把假儉草引進美國，假儉草在美國備受重視，育出了‘Common’、 ‘TC319’、‘Oklawn’ 、‘Aucentennial’和‘TifBlair’等假儉草品種[12]，并針對假儉草抗逆性、遺傳多樣性、育種和草坪建植等方面進行了一系列研究[13]。我國對假儉草的研究起步較晚，國內(nèi)許多學(xué)者就施肥對假儉草的影響開展了一定的研究。如，以峨眉假儉草為試驗材料，進行假儉草的施肥試驗，發(fā)現(xiàn)葉片施氮、鐵肥可以改善草坪的綠度，增加假儉草的抗寒性，延緩衰老，促進返青，從而延長假儉草草坪的青綠期[14]； 以假儉草為材料進行盆栽試驗，發(fā)現(xiàn)硝酸鉀可以提高葉綠素含量、脯氨酸含量，提高抗寒性[15]施肥對草坪生長影響的相關(guān)研究已經(jīng)在狗牙根(Cynodondactylon)[16]、結(jié)縷草(Zoysiajaponica)[17]、高羊茅(Festucaarundinacea)[18]、黑麥草(Loliumperenne)[19]、常用禾草[20]中開展，各種研究結(jié)果表明，不同種屬植物材料對氮的需求存在顯著差異。但是，關(guān)于假儉草耐低氮營養(yǎng)的種質(zhì)資源多樣性研究還鮮見報道。

江蘇省中國科學(xué)院植物研究所多年來收集引種假儉草種質(zhì)資源共計200余份，并在此基礎(chǔ)上對假儉草種質(zhì)資源的生長發(fā)育特性、形態(tài)解剖特征、物候性和抗逆性進行了系統(tǒng)研究[21-22]。本研究以前期研究得到的坪用價值較高假儉草優(yōu)良種質(zhì)為材料，通過水培試驗研究假儉草不同種質(zhì)間耐低氮的差異，并從中篩選出最耐低氮的假儉草種質(zhì)，從而為假儉草耐低氮種質(zhì)的遺傳改良和養(yǎng)護管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

以坪用價值較高的10個假儉草優(yōu)良種質(zhì)為試驗材料(表1)，進行水培試驗，所有材料均取自江蘇省中國科學(xué)院植物研究所草業(yè)中心試驗地(32°02′ N，118°28′ E)。試驗方法和日常管理參考陳靜波等[23]并略作修改。假儉草返青后，從試驗地取生長均勻一致、直徑7 cm的草皮塊，用自來水沖洗干凈后，種植于裝有干凈河沙的塑料杯中(直徑7 cm、深10 cm)，放于溫室內(nèi)進行預(yù)培養(yǎng)。營養(yǎng)液pH在6左右，采用修改了的Hoagland營養(yǎng)液[0.4 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、1.6 mmol·L-1KNO3、0.5 mmol·L-1(NH4)2SO4、1 mmol·L-1KH2PO4、1 mmol·L-1MgSO4·7H2O、0.5 mmol·L-1NaCl、5 μmol·L-1Fe-EDTA、2.35 mmol·L-1H3BO3、0.55 μmol·L-1MnSO4·H2O、0.038 5 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、0.016 5 μmol·L-1CuSO4·5H2O、0.006 5 μmol·L-1H2MoO4]。低氮水平下采用CaSO4代替Ca(NO3)2，K2SO4代替KNO3。用電動氣泵持續(xù)通氣，每7 d更換一次營養(yǎng)液。每天檢查箱內(nèi)水位,并用去離子水補充由于液面蒸發(fā)和植物吸收及蒸騰而損失的水分,同時用0.1 mmol·L-1的HCl和0.1 mmol·L-1的NaOH調(diào)pH至5.5～6.5。

為使假儉草適應(yīng)水培環(huán)境,使其生長一致，減少同一材料間的生長差異，處理前進行1個月左右的預(yù)培養(yǎng)。為保證試驗材料的一致性，處理前1 d統(tǒng)一修剪, 修剪高度為5 cm。前期做氮濃度梯度試驗(0.05、0.5、1、2.5、5、10、20、40mmol·L-1)，通過研究假儉草植株生長和生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，5 mmol·L-1氮水平地上部密度最大，不同指標(biāo)變異系數(shù)最小，確定為最適氮水平，0.05 mmol·L-1氮水平下不同假儉草種質(zhì)差異最顯著，因此設(shè)2個氮水平[5 mmol·L-1(對照)和0.05 mmol·L-1(低氮)]，隨機區(qū)組設(shè)計，重復(fù)3次。處理期間每7 d修剪一次，修剪材料105 ℃殺青后，80 ℃烘干至恒重后稱重。處理4周后取樣，測定形態(tài)數(shù)據(jù)，分為殘茬和根系，烘干后稱重。

表1 供試假儉草種質(zhì)的來源Table 1 Germplasm and source of centipedegrass used in this experiment

1.2 形態(tài)數(shù)據(jù)測定

草層高度：處理結(jié)束用直尺測量每杯材料的自然高度，重復(fù)3次，求平均值。葉片長度和寬度：每個處理隨機抽取頂部倒數(shù)第2張完全展開葉片5張，用游標(biāo)卡尺測定其長度和寬度，求平均值。

1.3 氮含量測定

烘干后植株樣磨成粉末，全氮含量采用凱氏定氮法[24]測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

為了消除不同假儉草種質(zhì)間固有的生物學(xué)特性和遺傳學(xué)特性的差異，采用耐低氮指數(shù)[25]指標(biāo)來衡量不同種質(zhì)間的耐低氮差異。

耐低氮指數(shù)=低氮脅迫下的測定值/正常氮水平下的測定值。

采用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS 19.0，分別對不同氮水平、不同種質(zhì)進行單因素方差分析；以14個氮含量和氮積累量相關(guān)生長指標(biāo)的耐性指數(shù)為依據(jù)，經(jīng)歸一化處理后采用離差平方和法對假儉草不同種質(zhì)進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氮對假儉草生長和生理特性的影響

低氮處理降低了假儉草草層高度、葉長和葉寬，與對照相比，修剪枝葉干重、殘茬干重降低，而根干重增加，但差異不顯著(P>0.05)，因此總干重降低(表2)。方差分析表明，除根干重外，其余6個生長指標(biāo)對假儉草生長的影響均達到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平。

表2 低氮對假儉草生長的影響Table 2 Effect of low-nitrogen supply on the growth of centipedegrass

同列不同小寫字母表示不同氮水平之間差異顯著(P<0.05)；*和**分別表示在0.01和0.05水平上影響顯著。 下同。

Different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different nitrogen levels at the 0.05 level; * and ** indicate significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively; similarly for the following tables.

方差分析表明，7個生長指標(biāo)不同種質(zhì)間差異均達到顯著或極顯著水平(P<0.05或P<0.01)(表3)。7個生長指標(biāo)變異系數(shù)均大于10%，其中，相對殘茬干重變異系數(shù)最大，為44.84%，變異系數(shù)最小的是相對葉寬，為11.91%。不同種質(zhì)間比較，除相對葉長和相對枝葉修剪干重外，其余5個指標(biāo)的耐性指數(shù)E-126均為最高；除相對殘茬干重外，其余6個指標(biāo)的耐性指數(shù)以Tifblair均為最低。

2.2 低氮對假儉草氮含量和氮積累量的影響

與對照相比，低氮處理降低了假儉草修剪枝葉、殘茬和根系的氮含量和氮積累量，以及總氮積累量(表4)。方差分析表明，除修剪枝葉氮積累量外，其余6個氮含量和氮積累量相關(guān)指標(biāo)不同氮水平之間的差異均達到極顯著水平(P<0.01)。

方差分析表明，修剪枝葉、殘茬、根系相對氮含量，修剪枝葉、殘茬、根系和總氮相對積累量不同種質(zhì)間差異均達到顯著或極顯著水平(P<0.05或P<0.01)(表5)。修剪枝葉、殘茬、根系相對氮含量，修剪枝葉、殘茬、根系和總氮相對積累量均具有較大變異(變異系數(shù)>10%)。其中，殘茬相對氮積累量變異系數(shù)最大，為51.08%，變異系數(shù)最小的是殘茬相對氮含量，為16.29%。不同種質(zhì)間比較，除根系相對氮含量和修剪枝葉相對氮積累量外，其余5個指標(biāo)的耐性指數(shù)E-126均為最高；除殘茬和根系相對氮含量外，其余5個指標(biāo)的耐性指數(shù)Tifblair均為最低。

2.3 假儉草耐低氮種質(zhì)資源篩選

以14個氮含量和氮積累量相關(guān)生長指標(biāo)的耐性指數(shù)為依據(jù)，經(jīng)歸一化處理后采用離差平方和法進行聚類分析(圖1)。以歐氏距離10為標(biāo)準(zhǔn)可以將10個假儉草種質(zhì)資源聚成3類(耐低氮型、中間型、低氮敏)感型，其中耐低氮型種質(zhì)為E-126和E-039，低氮敏感型種質(zhì)為E-038和Tifblair，中間型種質(zhì)為Common、E-022、E-092(1)、翠綠1號、E-099和E-174。

表3 低氮處理對不同假儉草種質(zhì)生長指標(biāo)耐性指數(shù)的影響Table 3 Variation in the relative values of growth traits of different centipedegrass accessions in response to low-nitrogen supply

表4 低氮對假儉草氮含量和氮積累量的影響Table 4 Effect of low-nitrogen supply on nitrogen content and accumulation in centipedegrass

表5 低氮對不同種質(zhì)假儉草氮含量和氮積累量耐性指數(shù)的影響Table 5 Variation in the relative values of nitrogen content and accumulation traits of different centipedegrass accessions in response to low-nitrogen supply

圖1 10個假儉草種質(zhì)資源的系統(tǒng)聚類圖Fig. 1 System clustering of 10 centipedegrass accessions

3個類群相對草層高度、相對葉長、相對葉寬、修剪枝葉相對干重、殘茬相對干重、相對根干重和相對總干重差異均達到極顯著水平(P<0.01)(表6)。不同類群間比較，耐低氮型除相對葉長外，其余6個生長指標(biāo)的耐性指數(shù)均顯著高于中間型和低氮敏感型(P<0.05)；耐低氮型殘茬相對干重和相對根干重均大于1，說明低氮促進了耐低氮型假儉草殘茬和根系的生長。低氮敏感型的相對草層高度、相對葉寬、修剪枝葉相對干重、相對殘茬干重、相對根干重和相對總干重僅為耐低氮型的78.57%、62.75%、49.41%、55.36%、55.56%和55.56%，說明低氮敏感型假儉草生長受到低氮的明顯抑制。

除殘茬相對氮含量和根系相對氮積累量外，3個類群其余5個氮含量和氮積累量相關(guān)指標(biāo)耐性指數(shù)的差異均達到顯著(P<0.05)或極顯著水平P<0.01)(表7)。不同類群間比較，除殘茬相對氮含量、根系相對氮含量和根系相對氮積累量外，耐低氮型其余5個氮含量和氮積累量相關(guān)指標(biāo)均顯著高于中間型和低氮敏感型，說明耐低氮型通過提高修剪枝葉氮含量，并在修剪枝葉和殘茬累積更多的氮適應(yīng)低氮營養(yǎng)。低氮敏感型7個氮含量和氮積累量相關(guān)指標(biāo)的耐性指數(shù)顯著低于耐低氮型和中間型。

3 討論

3.1 低氮對假儉草生長、氮含量和氮積累量的影響

植物耐低氮的研究開始于20世紀(jì)30年代。到目前為止，在水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、燕麥(Avenasativa)、棉花(Gossypiumspp.)、高粱(Sorghumbicolor)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、黑麥草、狗牙根等植物上均有這方面的報道[16,19,26-28]。有研究表明，低氮通常導(dǎo)致地上部生長減緩，營養(yǎng)物質(zhì)更多的分配到根系中[29]。蘇日古嘎等[20]研究了介質(zhì)供氮水平對10種禾草幼苗生長及氮效率的影響，發(fā)現(xiàn)在低氮培養(yǎng)介質(zhì)中, 禾草各器官的生長發(fā)育都受到抑制, 不同禾草冠層特性變化受到的影響程度不同。本研究結(jié)果表明，低氮降低了假儉草草層高度、葉長、葉寬、修剪枝葉和殘茬干重，而根干重與對照相比差異不顯著；低氮降低了修剪枝葉、殘茬和根系的氮含量和氮積累量。此外，與對照比較，低氮條件下根系氮積累量降低幅度明顯小于修剪枝葉和殘茬的氮積累量。綜上，低氮條件下，假儉草通過減緩地上部生長，分配更多氮給根系以維持根系的正常生長來獲取更多氮素。

表6 不同類群生長耐性指數(shù)的差異Table 6 Differences in the relative values of growth indices among the three accession clusters

表7 不同類群氮含量和氮積累量耐性指數(shù)的差異Table 7 Differences in the relative values of nitrogen content and accumulation among the three accession clusters

3.2 假儉草耐低氮的種質(zhì)資源多樣性

假儉草外部性狀、種子產(chǎn)量[9,21]、坪用價值[30]、物候期[22]等方面存在顯著差異，但是有關(guān)假儉草種質(zhì)資源耐低氮差異方面還未有深入研究。低氮介質(zhì)培養(yǎng)條件下, 不同禾草生長和生理學(xué)特性變化受到的影響程度不同[20]。本研究結(jié)果表明，假儉草7個生長指標(biāo)和7個氮含量和氮積累量相關(guān)指標(biāo)耐性指數(shù)變異系數(shù)均大于10%，說明低氮處理條件下不同假儉草種質(zhì)間生長、氮含量和氮積累量存在顯著差異。不同種質(zhì)間比較，除相對葉長、相對枝葉修剪干重、相對根系氮含量和相對枝葉氮積累量外，其余10個指標(biāo)的耐性指數(shù)E-126均為最高，說明E-126最耐低氮。對氮肥提高假儉草抗寒性研究發(fā)現(xiàn)，施用氮肥可延長E-126青綠期12～13 d，說明該材料自身耐低氮的優(yōu)良特性有助于提高青綠期[15]。本研究中，除相對殘茬干重、相對殘茬氮含量和相對根系氮含量外，其余11個指標(biāo)的耐性指數(shù)Tifblair均為最低，說明Tifblair對低氮最敏感。TifBlair為美國引進種質(zhì)，說明該材料不適應(yīng)中國本土野外生長環(huán)境，需要適當(dāng)施氮才能保持正常生長。

3.3 不同類群假儉草耐低氮的差異

以7個生長指標(biāo)和7個氮含量和氮積累量相關(guān)指標(biāo)的耐性指數(shù)為篩選指標(biāo)，通過聚類分析將10個種質(zhì)資源分為3類(耐低氮型、中間型、低氮敏感型)。3個類群的7個生長指標(biāo)和7個氮含量和氮積累量相關(guān)指標(biāo)耐性指數(shù)的平均值呈遞減趨勢。除相對葉長、相對殘茬氮含量、相對根系氮積累量外，3個類群之間其余11個生長，氮含量和氮積累量相關(guān)的耐性指數(shù)平均值差異均達到極顯著水平(P<0.01)。不同類群間比較，耐低氮型除相對葉長、相對殘茬氮含量、相對根系氮含量和相對根系氮積累量外，其余10個生長和生理指標(biāo)的耐性指數(shù)均顯著高于中間型和低氮敏感型；耐低氮型相對殘茬干重和相對根干重均大于1，相對殘茬氮積累量和相對根氮積累量顯著高于低氮敏感型和中間型，說明耐低氮型假儉草通過分配更多氮給殘茬和根系以促進殘茬和根系的生長來適應(yīng)低氮營養(yǎng)。低氮敏感型7個生長指標(biāo)和7個氮含量和氮積累量相關(guān)指標(biāo)的耐性指數(shù)均顯著小于中間型和耐低氮型，說明低氮敏感型假儉草生長受到低氮的明顯抑制。

4 結(jié)論

低氮處理條件下，假儉草地上部生長降低，將更多氮分配給根系以維持根系的正常生長。且不同假儉草種質(zhì)間生長、氮含量和氮積累量存在顯著差異。進一步通過對7個生長指標(biāo)和7個氮含量和氮積累量相關(guān)指標(biāo)的耐性指數(shù)進行聚類分析，將10個種質(zhì)分為耐低氮型、中間型和低氮敏感型3個類群。其中，耐低氮型以E-126為典型性種質(zhì)，Tifblar為低氮敏感型代表性種質(zhì)。