黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤中Ig蛋白重鏈表達(dá)與IgH基因重排的研究

林海月，王紅霞，胡東東，陳 昊△

(江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院/徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院:1.病理科；2.婦產(chǎn)科，江蘇連云港 222002)

近年來(lái)黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma，MALToma)發(fā)病率有所提高，居非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin′s lymphoma,NHL)的第二位[1-2]，因缺乏特征性的免疫標(biāo)記，仍屬于排他性診斷。MALToma與反應(yīng)性淋巴組織增生(reactive lymphoid hyperplasia，RLH)的鑒別尤其困難，而兩者的鑒別直接影響患者的治療及預(yù)后，意義重大。本研究以MALToma與MALToma細(xì)胞起源接近的濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，F(xiàn)L)、同為生發(fā)中心后B2譜系的漿細(xì)胞淋巴瘤(plasmacytoma，PC)為研究對(duì)象，立足于Ig蛋白重鏈可變區(qū)的IgH基因重排與重鏈恒定區(qū)的抗體類別轉(zhuǎn)換，分

表1 試驗(yàn)組及對(duì)照組中各種Ig蛋白重鏈表達(dá)情況及表達(dá)模式[n(%)]

a:試驗(yàn)組間比較；b：試驗(yàn)組各腫瘤分別與對(duì)照組比較;c:Fisher檢驗(yàn)；d:試驗(yàn)組與對(duì)照組比較；▲:IgE在各組中均為陰性表達(dá)，因而不列入表中;-:此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)

析IgH基因重排與Ig重鏈表達(dá)的情況，以期找到有利于MALToma診斷和鑒別診斷的新方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院病理科2009年6月至2016年11月存檔蠟塊B細(xì)胞NHL(B-NHL)50例(包括MALToma 30例、FL 10例、PC 10例)作為試驗(yàn)組，另選取RLH 10例作為對(duì)照組。參照第四版造血與淋巴組織腫瘤WHO分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，所有病例經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)核診斷，將MALToma、FL、PC和RLH依病理號(hào)從MI、FI、PI、RI開(kāi)始依次編號(hào)。30例MALToma中，男14例，女16例，年齡28～77歲，中位年齡60.5歲，參照 Ann Arbor臨床分期，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為16、11、1、2例；依據(jù)國(guó)際預(yù)后指數(shù)(IPI)危險(xiǎn)度分級(jí)分為低危組20例、中危組9例、高危組1例。FL中男3例，女7例，年齡46～80歲，中位年齡61.5歲；PC中男3例，女7例，年齡45～72歲，中位年齡63.5歲；RLH中男6例，女4例，年齡39～76歲，中位年齡59歲。對(duì)30例MALToma患者進(jìn)行電話隨訪，隨訪時(shí)間截止于2017年6月19日，21例獲得隨訪資料，隨訪33～418周，疾病進(jìn)展6例，死亡1例，無(wú)進(jìn)展生存期(progression free survival,PFS)為33～143周。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué) 全部標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。采用EnVision兩步法檢測(cè)兩組中Ig蛋白重鏈表達(dá)，操作流程嚴(yán)格參照試劑說(shuō)明書(shū)要求。IgM、IgA、IgD、IgG為即用型工作液(購(gòu)自廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司)，IgE為濃縮液(購(gòu)自Abcam公司)，以1∶500倍稀釋，均為兔抗人抗體。

1.2.2PCR QIAamp DNA FFPE Tissue Kit購(gòu)于Qiagen公司，IgH基因重排試劑盒(包括IgHA、IgHB、IgHC、IgHD、IgHE占管引物)購(gòu)于InvivoScribe公司，Taq酶購(gòu)于ABI公司，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)及GelRed等試劑均購(gòu)于北京思爾成生物技術(shù)有限公司，操作流程嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)要求。

1.3結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)判讀標(biāo)準(zhǔn)：5種Ig蛋白陽(yáng)性染色均為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，每張切片選取5個(gè)具有典型病變的視野(×100)，各視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按照半定量積分法分為陰性(-)、弱陽(yáng)性(+)、陽(yáng)性(++)、強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。IgH基因重排判讀標(biāo)準(zhǔn)：(1)電泳條帶邊緣整齊，寬度不超過(guò)1 mm；(2)產(chǎn)物在期望范圍內(nèi)；(3)如若背景上無(wú)涂抹帶，同時(shí)也無(wú)引物二聚體即是擴(kuò)增失敗，而不是出現(xiàn)陰性結(jié)果；(4)期望范圍以外的其余條帶，則為人工假象。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間陽(yáng)性率的比較，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，生存分析采用Kaplan-Meier法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1試驗(yàn)組與對(duì)照組中Ig蛋白重鏈表達(dá)及IgH基因重排情況 研究中將Ig重鏈表達(dá)分為3種模式，模式1：?jiǎn)畏NIg重鏈表達(dá)；模式2：全陰性Ig重鏈缺失表達(dá)；模式3：多種Ig重鏈表達(dá)。試驗(yàn)組及試驗(yàn)組3種腫瘤模式1/2檢出率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。3種腫瘤、試驗(yàn)組及對(duì)照組中5管引物檢出率及組合檢出率見(jiàn)表2。試驗(yàn)組(74.0%)及對(duì)照組(0)中IgH基因單克隆重排檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.301，P<0.05)；生發(fā)中心來(lái)源的MALToma(73.3%)和PC(70.0%)略低于生發(fā)中心來(lái)源的FL(80.0%)，但試驗(yàn)組3種腫瘤間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.285，P>0.05)。IgH基因重排電泳圖見(jiàn)圖1。

2.2試驗(yàn)組中IgH基因重排與Ig蛋白重鏈表達(dá)模式的關(guān)系 試驗(yàn)組及試驗(yàn)組3種腫瘤中IgH基因重排陽(yáng)性組、陰性組中Ig重鏈模式1/2與模式3的檢出率間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IgH基因單克隆重排檢出率和Ig重鏈模式1/2檢出率亦無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表3。將IgH基因檢測(cè)陽(yáng)性或Ig重鏈表達(dá)呈模式1/2的病例均計(jì)為陽(yáng)性，兩者聯(lián)合檢測(cè)在試驗(yàn)組及MALToma、FL、PC中的陽(yáng)性率顯著升高，分別為94.0%(47/50)、96.7%(29/30)、90.0%(9/10)、90.0%(9/10)。

2.3MALToma中Ig蛋白重鏈表達(dá)模式及IgH基因重排與預(yù)后相關(guān)參數(shù)(臨床分期、危險(xiǎn)度分型、無(wú)疾病進(jìn)展期)的關(guān)系 本研究將Ig蛋白重鏈表達(dá)呈模式1/2計(jì)為方法一陽(yáng)性，IgH基因呈單克隆重排計(jì)為方法二陽(yáng)性，兩者聯(lián)合檢測(cè)任何一種出現(xiàn)陽(yáng)性均計(jì)為方法三陽(yáng)性，3種方法在不同臨床分期和危險(xiǎn)度分型中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表4。Ig蛋白重鏈不同表達(dá)模式及IgH基因檢測(cè)陽(yáng)性與陰性組中PFS的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。生存曲線見(jiàn)圖2。

表2 各組IgH基因重排結(jié)果[n(%)]

E管在209 bp處出現(xiàn)非特異性單克隆條帶

表3 試驗(yàn)組中IgH基因重排與Ig蛋白重鏈表達(dá)模式的關(guān)系[n(%)]

a:IgH基因重排陽(yáng)、陰性組間模式1/2檢出率的比較；b:IgH基因重排與Ig蛋白重鏈表達(dá)模式1/2、模式3的相關(guān)性分析；c：Fisher檢驗(yàn)

圖A、B、C為M1、M2基因重排電泳圖;A-、A+、B-、B+、C-、C+、D-、D+、E-、E+分別為IgHA、IgHB、IgHC、IgHD、IgHE的陰性和陽(yáng)性對(duì)照，M1為A、B、D管陽(yáng)性，M2為B、C管陽(yáng)性。陽(yáng)性條帶范圍：IgHA為310～360 bp，IgHB為250～295 bp，IgHC為100～170 bp，IgHD為110～290 bp，390～420 bp，IgHE為100～130 bp。圖C：IgHE在209 bp處出現(xiàn)非特異性條帶

圖1 MALToma基因重排電泳圖

續(xù)表4 MALToma中Ig蛋白重鏈表達(dá)模式及IgH基因重排與預(yù)后相關(guān)參數(shù)的關(guān)系[n(%)]

a：Ⅰ期+Ⅱ期與Ⅲ期+Ⅳ期間陽(yáng)性率比較；b：Fisher檢驗(yàn)

A:IgH基因；B：Ig蛋白重鏈

圖2 IgH基因檢測(cè)陽(yáng)性與陰性組及Ig蛋白重鏈模式1/2與模式3間PFS的比較(P=0.681、0.183)

3 討 論

B細(xì)胞在發(fā)育過(guò)程中在骨髓中首先發(fā)生Ig重鏈可變區(qū)VDJ基因重排，然后發(fā)生Ig輕鏈VJ基因重排，轉(zhuǎn)錄成RNA后再與重鏈恒定區(qū)轉(zhuǎn)錄的RNA并接成Ig分子，形成表達(dá)mIgM和mIgD的成熟B細(xì)胞后即進(jìn)入外周免疫器官，經(jīng)抗原刺激后于生發(fā)中心發(fā)生體細(xì)胞超突變和抗體類別轉(zhuǎn)換[3]。所謂抗體類別轉(zhuǎn)換即B細(xì)胞發(fā)生Ig重鏈恒定區(qū)的二次基因重排，由原先合成IgM和IgD的B細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣蒊gG、IgA或IgE的B細(xì)胞。根據(jù)腫瘤的單克隆學(xué)說(shuō)，B細(xì)胞淋巴瘤應(yīng)發(fā)生重鏈可變區(qū)IgH基因的單克隆重排，重鏈恒定區(qū)Ig蛋白編碼基因的單克隆重排并表達(dá)單種Ig蛋白重鏈。理論上，Ig重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)均可作為檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤單克隆性的兩個(gè)靶點(diǎn)，對(duì)于兩者關(guān)系的研究甚少。

一直以來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)于MALToma中Ig蛋白重鏈表達(dá)特點(diǎn)的研究較少，理論上腫瘤為單克隆增生，應(yīng)為表達(dá)模式1。BENDE等[4]關(guān)于MALToma的研究中模式1陽(yáng)性率達(dá)80%(16/20)，而有學(xué)者對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤Ig蛋白表達(dá)的研究得出模式2(15/30)及模式3的表達(dá)(4/30)[5]，模式2/3的表達(dá)可能是由于腫瘤細(xì)胞Ig蛋白表達(dá)失調(diào)所致。本研究中MALToma、PC、FL及試驗(yàn)組模式1/2陽(yáng)性檢出率分別為86.7%、80.0%、60.0%、80.0%，RLH均表達(dá)模式3(P<0.05)，模式1/2的表達(dá)有助于試驗(yàn)組3種腫瘤(尤其是MALToma)與RLH的鑒別診斷，因而筆者推測(cè)其為腫瘤特有，將其作為腫瘤的提示標(biāo)記。IgH基因重排是B細(xì)胞分化過(guò)程中首先發(fā)生的事件，人們較常運(yùn)用Biomed-2引物系統(tǒng)中針對(duì)IgH的5管引物檢測(cè)腫瘤的單克隆性[6]。受體細(xì)胞超突變的影響，生發(fā)中心前細(xì)胞來(lái)源的腫瘤單克隆重排檢出率高于生發(fā)中心及生發(fā)中心后來(lái)源的腫瘤[7]。本研究中3種腫瘤及試驗(yàn)組IgH基因重排陽(yáng)性率均達(dá)70%以上，與KOKOVIC等[8]、張婧等[9]的研究相符，因而B(niǎo)iomed-2引物系統(tǒng)對(duì)于B-NHL單克隆性的檢測(cè)具有重要的臨床病理應(yīng)用價(jià)值。多數(shù)研究中IgH E管陽(yáng)性率較低甚至為0[10-12]，本研究試驗(yàn)組及對(duì)照組IgH E管均未檢出單克隆重排，因而筆者不推薦使用。關(guān)于IgH基因重排檢測(cè)與Ig蛋白重鏈表達(dá)的研究少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究中IgH基因重排與Ig蛋白重鏈表達(dá)模式未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，說(shuō)明二者作為檢測(cè)腫瘤單克隆性的兩個(gè)位點(diǎn)，相互獨(dú)立。MALToma、FL、PC及試驗(yàn)組中兩者聯(lián)合檢測(cè)腫瘤單克隆檢出率分別升至96.7%(29/30)、90.0%(9/10)、90.0%(9/10)、94.0%(47/50)。3種腫瘤及試驗(yàn)組中聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率均提高到90%及以上，MALToma陽(yáng)性率達(dá)96.7%，因而Ig蛋白重鏈檢測(cè)聯(lián)合IgH基因重排檢測(cè)可以提高腫瘤單克隆性的檢出率。

Ig蛋白重鏈表達(dá)模式與預(yù)后相關(guān)參數(shù)的分析少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，而一些學(xué)者對(duì)于IgH基因重排與預(yù)后相關(guān)參數(shù)的關(guān)系做過(guò)一些分析。SHAN等[13]對(duì)21例原發(fā)性胃淋巴瘤的研究中，IE期IgH單克隆重排檢出率為46.1%(6/13)，ⅡE期為100%(8/8)，其推測(cè)IgH單克隆重排檢出率隨臨床分期的升高而升高。有學(xué)者對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤骨髓及外周血的研究顯示，IgH基因單克隆重排的陽(yáng)性率隨著臨床分期及IPI的升高而升高，并與治療后完全緩解率相關(guān)[14]。上述國(guó)外研究提示IgH基因單克隆重排與高級(jí)別臨床分期、高的IPI及低治療緩解率等預(yù)后不良因素相關(guān)。已知MALToma常見(jiàn)染色體易位包括t(11;18)(q21;q21)、t(1;14)(p22;q32)、t(14;18)(q32;q21)、t(3;14)(p14;q32)[15]，其中有3種涉及14號(hào)染色體的IgH基因，筆者推測(cè)IgH基因單克隆重排的病例可能同時(shí)伴隨IgH基因的斷裂、染色體異位，繼而引起MALT1、Bcl-10、FOXP1等伴侶基因的激活，而引發(fā)腫瘤的預(yù)后不良。本研究發(fā)現(xiàn)MALToma中Ig蛋白重鏈表達(dá)模式、IgH基因單克隆重排與臨床分期、危險(xiǎn)度分型及PFS等預(yù)后因素均無(wú)關(guān)，兩者聯(lián)合檢測(cè)與臨床分期、危險(xiǎn)度分型亦無(wú)關(guān)，與上述研究的差異可能與腫瘤類型不同、標(biāo)本例數(shù)少及隨訪時(shí)間短等相關(guān)。

綜上所述，單種Ig重鏈/全陰性Ig重鏈缺失表達(dá)的檢出對(duì)上述3種腫瘤的診斷具有提示意義。Biomed-2引物系統(tǒng)在MALToma、FL、PC中IgH基因單克隆重排具有較高的檢出率。兩者聯(lián)合檢測(cè)可以提高腫瘤陽(yáng)性檢出率，對(duì)于以上3種腫瘤尤其是MALToma與RLH的鑒別診斷具有較高的臨床病理應(yīng)用價(jià)值。