瓜蔞薤白半夏湯促進(jìn)2型糖尿病合并急性心肌缺血大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員的作用及其機(jī)制

鄭夢夢, 趙啟韜， 周繼棟， 傅旎旎， 胡超群， 荀麗英

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250355； 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250355)

目前，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管病變之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病，我國糖尿病的患病率呈快速上升的趨勢[1].高血糖引起的血管內(nèi)皮損傷，可引致一系列心血管疾病，如高血壓、冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、心力衰竭及心肌梗死等.糖尿病患者患冠心病的危險(xiǎn)程度是非糖尿病人群的2～4倍[2-3].

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是修復(fù)機(jī)體血管內(nèi)皮層的重要力量，其功能狀態(tài)反映了機(jī)體修復(fù)血管損傷的能力.EPCs動(dòng)員能力的負(fù)性調(diào)節(jié)是導(dǎo)致糖尿病血管病變的關(guān)鍵因素.糖尿病患者外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞(circulating endothelial progenitor cells，CEPCs)的數(shù)目隨病變的程度而下降[4].EPCs動(dòng)員功能的低下是導(dǎo)致糖尿病患者CEPCs水平低下、血管損傷修復(fù)能力減弱的直接原因，也是糖尿病血管并發(fā)癥的關(guān)鍵致病因素.

現(xiàn)代中醫(yī)臨床研究證明，瓜蔞薤白半夏湯(Gualou Xiebai Banxia decoction，GXB)可用于痰濁壅塞胸膈、胸陽痹阻、胸背疼痛和不得安臥的胸痹證[5-7].對應(yīng)西醫(yī)臨床的糖尿病合并冠心病心絞痛、心肌梗死、慢性心力衰竭和急性腦梗死等心腦血管疾病，均顯示出顯著的療效,且不良反應(yīng)輕微[8-9].然而，目前相關(guān)其分子機(jī)制和細(xì)胞信號調(diào)控靶點(diǎn)的研究尚處于初步階段.本研究以2型糖尿病合并急性心肌梗死(type 2 diabetes complicated with acute myocardial ischemia,T2DM-AMI)大鼠模型為研究對象，經(jīng)GXB干預(yù)，連續(xù)檢測模型大鼠AMI后7 d外周血中CEPCs含量以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase,eNOS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)含量變化，繪制7 d動(dòng)態(tài)變化曲線，以明確GXB對EPCs的動(dòng)員作用及機(jī)制，并從祖細(xì)胞層次闡明中藥祛痰散結(jié)的可能作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性 Wistar 大鼠，220～250 g，SPF級，由山東魯抗動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號：SCXK(魯)20130001.飼養(yǎng)環(huán)境：室溫 23～25 ℃，相對濕度為35%～65%.

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，168只大鼠隨機(jī)分為3組，對照、模型、GXB組，每組56只.每組再分為7個(gè)亞組，即1～7亞組，每亞組8只大鼠.GXB組每天給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 g/kg的GXB灌胃給藥，對照組和模型組給予同容積生理鹽水.T2DM造模成功后，各組大鼠連續(xù)給藥7 d.第7天給藥30 min后，實(shí)施冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)，對照組實(shí)施假手術(shù).手術(shù)后各組大鼠繼續(xù)灌服GXB或生理鹽水，直至被處死.

1.2 藥品與試劑

瓜蔞薤白半夏湯(GXB)：瓜蔞240 g、薤白900 g、半夏120 g、黃酒250 mL，加水至蓋過藥材浸泡2～3 h，水開后小火煎煮20 min，倒出第1份藥液.加熱水浸過藥物煎煮15 min倒出第2份藥液，合并兩次的水煎液濃縮至為生藥質(zhì)量濃度1 g/mL的煎液.

PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD34單克隆抗體(Abcam，ab187284), FITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠VEGFR-2抗體(Abcam，ab184903)；鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)：SIGMA 公司；總膽固醇(TC)測定試劑盒、甘油三酯(TG)測定試劑盒、高密度脂蛋白(HDL)測定試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)測定試劑盒：北京信利來生物科技有限公司，20131212；肌酸激酶(CK)試劑盒、肌酸激酶同工酶 MB(CK-MB)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、α劑羥丁酸脫氫酶試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司(20130612).

高脂乳配制：參考石鶴坤等[10]方法，膽固醇、豬油、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶、吐溫-80、丙二醇、水體積比為10∶20∶2∶1∶20∶20∶30.方法是將豬油加熱融化，加入膽固醇、膽酸鈉和丙基硫氧嘧啶，攪拌均勻，再加入吐溫-80、丙二醇和蒸餾水，待固體完全溶解后，冷卻至室溫，得乳劑.

1.3 造模方法

高血脂模型大鼠制備：造模組大鼠灌服每天高脂乳，用量為10 mL/kg同時(shí)喂以普通飼料.空白對照組灌服相當(dāng)劑量的生理鹽水并喂以普通飼料.分別于灌服高脂乳后第 14、21天，乙醚麻醉大鼠后眼眶取血，連續(xù)兩次測定血漿 TC，TG，LDL，HDL.測試數(shù)據(jù)取平均值，其中 TC，TG，LDL 升高，HDL 降低，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，即視為高脂血癥動(dòng)物模型制作成功.

2型糖尿病大鼠模型制備：將造模成功的高脂血癥大鼠，過夜禁食后稱體質(zhì)量. 大鼠腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 mg/kg STZ.3 d后，大鼠空腹18 h，尾靜脈采集血樣，檢測血空腹葡萄糖含量.同時(shí)，所有大鼠給予葡萄糖水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2 g/kg)灌胃，進(jìn)行口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test, OGTT)，2 h后測取餐后血糖.將空腹血糖濃度大于10 mmol/L或者餐后血糖濃度大于16.7 mmol/L 的大鼠視為高血糖造模成功大鼠.

T2DM-AMI模型的制備：糖尿病大鼠模型成立后，進(jìn)行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎，并在手術(shù)后停止給予高脂乳.參考趙啟韜等[11]的方法，大鼠質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔麻醉后，連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，進(jìn)行氣管插管，行人工呼吸.左側(cè)第3、4 肋間開胸，剪開心包，暴露心肌，并將圓形無創(chuàng)傷縫合針6/0絲線置于左冠狀動(dòng)脈前降支起始部下2 mm處，結(jié)扎，以心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功的標(biāo)志.

1.4 5項(xiàng)心肌酶譜檢測

腹腔動(dòng)脈取血5～8 mL，低溫分離血漿(4 ℃，3 000 r/min，15 min)，取上層血漿，按各試劑盒說明書進(jìn)行操作，用半自動(dòng)生化分析儀分別測定血漿5項(xiàng)心肌酶(CK、CK-MB、LDH、AST、α-HBDH)含量.

1.5 內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員檢測

在冠脈結(jié)扎手術(shù)后的1～7 d，分別對上述3組的1～7亞組大鼠，連續(xù)實(shí)施水合氯醛麻醉、腹主動(dòng)脈取血、處死、取心臟，并利用流式細(xì)胞儀檢測每只大鼠每毫升血液中CEPCs的數(shù)量.

1.6 流式細(xì)胞儀檢測

CEPC細(xì)胞表面既表達(dá)干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，如CD34等，也表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，如vWF等[12].因此，本研究將表面同時(shí)表達(dá)CD34、vWF的單核細(xì)胞(MNC)作為內(nèi)皮祖細(xì)胞.取新鮮全血，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的乙二胺四乙酸二納(ethylenediaminetetra acetic acid disodium salt,EDTA-2Na)抗凝，以PE-CD34抗體和異硫氰酸熒光素標(biāo)記的血管假性血友病因子(FITC-vWF)抗體共同孵育30 min；溶血素(雙蒸水1∶10稀釋)室溫避光裂解10 min.然后加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS)終止反應(yīng)，1 200 r/min離心5 min，棄上清.重復(fù)清洗后PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測.

1.7 酶聯(lián)免疫檢測

ELISIA 試劑盒檢測血漿中 VEGF、eNOS、NO的水平，具體操作按照試劑盒說明進(jìn)行.

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本校正t檢驗(yàn)和完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 大鼠血脂水平測定

于灌服高脂乳后第 14天、 21天，對各組大鼠乙醚麻醉后眼眶取血，連續(xù)兩次測定血漿 TC、TG、LDL和HDL，測試數(shù)據(jù)取平均值.結(jié)果如表1所示，與對照組比較，模型大鼠血漿 TC、TG和LDL 含量顯著升高，血漿 HDL 濃度水平均有明顯下降(P<0.01)，說明高脂模型造模成功.

組別 nTCTGLDLHDL對照組81.38±0.142.16±0.130.39±0.110.78±0.12模型組89.14±1.019.63±1.201)3.56±1.431)0.34±0.061)

1)與對照組比較P<0.01

2.2 大鼠血糖濃度的測定

連續(xù)3 d注射SZT，最后一次注射SZT后的18 h，以及OGTT實(shí)驗(yàn)后2 h, 大鼠尾靜脈取血.結(jié)果如下所示，模型組大鼠空腹血糖和餐后血糖升高極為顯著,說明糖尿病模型造模成功.

組別n空腹18 hOGTT 2 h對照組84.69±0.8710.32±1.21模型組818.33±3.451)29.44±2.761)

1)與對照組比較P<0.05

2.3 各組大鼠心肌酶水平

利用生化試劑盒檢測各組大鼠血漿中5項(xiàng)心肌酶活性，檢測數(shù)據(jù)表明，與對照組相比，模型組大鼠血清5項(xiàng)心肌酶活性均顯著升高(P<0.01).GXB可明顯降低該模型鼠血清心肌酶活性.

組別nCKCK-MBASTLDHα-HBDH對照組8278.65±14.02219.56±18.1160.84±23.40136.23±16.40132.21±10.26模型組8898.71±26.551)672.32±35.561)203.56±32.121)535.20±14.281)275.09±28.151)GXB組8391.11±73.812)407.03±64.422)74.75±29.042)303.46±49.962)137.62±24.242)

1)與對照組比較P<0.01；2)與模型組比較P<0.01

1)與對照組比較P<0.01；2)與模型組比較P<0.01

2.4 GXB對T2DM-AMI大鼠CEPCs動(dòng)員的作用

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如表4，圖2所示，對照組CEPCs含量7 d內(nèi)無明顯變化.模型組大鼠該細(xì)胞含量手術(shù)后第3天急劇升高，第4天達(dá)到峰值，隨即迅速下降.GXB組大鼠CEPCs數(shù)量心肌缺血后前4 d升高幅度和模型組相似，同樣是在缺血后第4天達(dá)到峰值，但達(dá)到峰值后仍一直維持在較高水平，下降幅度很小(P<0.05).從冠狀動(dòng)脈結(jié)扎手術(shù)后第5天起，GXB組大鼠血液中CEPCs的含量就一直顯著高于模型組(P<0.05).

組別n1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d對照8569.42±48.22352.13±46.23462.79±103.5429.86±79.16479.83±39.87376.94±46.26448.47±86.47模型8569.42±48.22450.37±76.55331.05±49.461751.14±186.441)987.80±106.351)616.99±84.47607.07±59.35GXB8390.26±65.12607.46±49.31498.08±28.251605.43±158.331)1467.67±165.351)2)1239.72±145.21)2)1271.51±187.41)2)

1)與對照組比較P<0.05; 2)與模型組比較P<0.05

1)與模型組比較P<0.05；2)與對照組比較P<0.05

Fig.2 Changes of circulating endothelial progenitor cells in the blood of rats in each group within 7 days

2.5 大鼠血漿VEGF質(zhì)量濃度變化

采用用ELISIA試劑盒檢測各組大鼠血漿VEGF含量，數(shù)據(jù)表明，對照組含量一直無明顯變化，處于基線水平，平穩(wěn)波動(dòng)；模型組含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，其中第4天達(dá)到頂峰并開始下降，而GXB組大鼠血漿VEGF含量上升幅度大、速度快，AMI后第5天即達(dá)到峰值，從第4天起就一直顯著高于模型組大鼠(表5、圖3，P<0.05).

2.6 大鼠血漿eNOS活性變化

血漿eNOS活性檢測數(shù)據(jù)表明，對照組含量一直無明顯變化，平穩(wěn)波動(dòng).模型組大鼠血漿eNOS活性逐步上升，于AMI后第3天達(dá)到峰值并開始下降，但從 AMI 后第2天起一直顯著高于對照組大鼠.GXB組大鼠血漿該酶活性 AMI 手術(shù)后第2天即顯著高于模型組大鼠，而且該酶活性于AMI第3天后仍持續(xù)升高，第4天達(dá)到峰值并開始下降；但直至處死前一直顯著高于對照組和模型組(圖4、表6，P<0.05).

組別n1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d對照8304.66±36.21310.12±49.25324.68±26.54331.46±31.11312.41±26.40301.08±19.20310.95±27.44模型8297.97±29.87328.46±65.30357.52±45.211)386.60±54.691)368.03±16.541)309.12±59.501)309.19±64.111)GXB8310.20±24.23346.66±36.14402.40±48.52486.76±43.102)506.87±56.112)538.19±34.332)518.80±47.122)

1)與對照組比較P<0.05; 2)與模型組比較P<0.05

1)與模型組比較P<0.05；2)與對照組比較P<0.05

Fig.3 Changes of plasma VEGF levels in rats in each group

2.9 大鼠血漿NO含量變化

對照組大鼠血漿NO含量一直無明顯變化，平穩(wěn)波動(dòng).模型組含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，其中第4天達(dá)到頂峰并開始下降，但AMI后7 d內(nèi)一直顯著高于對照組大鼠.GXB組大鼠血漿NO含量變化曲線與模型組大鼠類似，即從第2天即明顯升高，第4天達(dá)到峰值，其后開始下降，但整體處于較高水平，且顯著高于模型組 (表7、圖5，P<0.05).

組別n1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d對照組81.75±0.241.88±0.331.59±0.251.72±0.361.47±0.061.80±0.111.67±0.21模型組82.19±0.252.39±0.351)2.92±0.251)2.42±0.341)2.83±0.361)2.67±0.151)2.39±0.181)GXB組82.94±0.251)3.40±0.361)2)3.32±0.441)4.61±0.121)2)4.18±0.341)2)3.82±0.251)2)3.69±0.311)2)

1)與對照組比較P<0.05; 2)與模型組比較P<0.05

1)與模型組比較P<0.05；2)與對照組比較P<0.05

Fig.4 Changes of plasma eNOS activity in each group of rats

1)與模型組比較P<0.05；2)與對照組比較P<0.05

圖5 各組大鼠血漿NO含量變化

Fig.5 Changes of plasma NO in rats in each group

組別n1 d2 d3 d4 d5 d6 d7 d對照組823.54±0.6622.45±3.1025.23±2.5523.34±3.9824.62±1.5821.18±2.5523.89±1.97模型組824.11±3.4725.91±2.6635.36±2.981)36.14±4.121)32.39±3.871)28.61±1.1121.91±3.14GXB組828.07±2.6834.37±5.661)50.22±4.321)2)52.65±5.361)2)46.70±3.781)2)51.08±3.651)2)42.13±5.781)2)

1)與對照組比較P<0.05; 2)與模型組比較P<0.05

3 討論

隨著疾病譜的逐漸演變，2型糖尿病已經(jīng)成為當(dāng)代社會(huì)的常見病.在諸多并發(fā)癥中，心血管疾病是糖尿病患者致死的主要原因.關(guān)于心血管疾病的發(fā)病機(jī)制，“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說”被多數(shù)學(xué)者接受.現(xiàn)代研究證明，骨髓中EPC動(dòng)員的過程與VEGF、eNOS和NO等細(xì)胞因子有關(guān)[13-14].對eNOS-/-小鼠注入野生型EPCs后，被阻斷的血管新生恢復(fù)正常，表明EPC的動(dòng)員依賴于eNOS[15].2型糖尿病患者骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員呈現(xiàn)負(fù)性調(diào)節(jié)，患者 CEPCs數(shù)目隨病變的程度而下降.研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者外周血中EPCs的數(shù)量與患者空腹血糖及糖化血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為EPCs數(shù)量減少，這種減少與EPCs壽命縮短或骨髓EPCs動(dòng)員減少有關(guān)，其中壽命縮短可能由于細(xì)胞增殖減少和細(xì)胞死亡加速所致[16].

關(guān)于中藥對EPCs動(dòng)員的體內(nèi)研究，多數(shù)是靜態(tài)研究，即選取某一時(shí)間點(diǎn)，檢測對照組、模型組、藥物干預(yù)組患者或模型動(dòng)物組細(xì)胞含量，分析各組間的差異.而骨髓EPCs的動(dòng)員是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，靜態(tài)的研究不能全面反應(yīng)藥物對該過程的干預(yù)作用.而本實(shí)驗(yàn)對T2DM-AMI模型大鼠7 d內(nèi)EPCs動(dòng)員的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了描述,更加準(zhǔn)確地反映EPCs動(dòng)員情況.

GXB是防治AMI、冠心病和高脂血癥的常用的復(fù)方中藥，它安全、有效而且價(jià)格低廉，因而被中醫(yī)臨床廣泛使用.本課題組前期研究表明GXB對高血脂合并急性心肌梗死大鼠干預(yù)效果顯著[17].本課題通過設(shè)計(jì)高血糖、高血脂伴急性心肌缺血大鼠模型，以GXB干預(yù)，不同時(shí)間點(diǎn)采集外周血，測定CEPCs含量，繪制其變化曲線，明確GXB對EPCs動(dòng)員功能的影響.檢測各組動(dòng)物體內(nèi) EPCs動(dòng)員的關(guān)鍵細(xì)胞因子的表達(dá)水平，研究GXB對EPCs動(dòng)員關(guān)鍵細(xì)胞因子的調(diào)控作用.本研究發(fā)現(xiàn)GXB可以增加T2DM-AMI大鼠外周血CEPCs的濃度，上調(diào)血漿VEGF，eNOS和NO表達(dá)水平.該發(fā)現(xiàn)表明GXB可能通過上調(diào)血漿中VEGF，eNOS，NO的表達(dá)或分泌來調(diào)節(jié)骨髓EPCs的動(dòng)員.