胡桃醌通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin/Snail通路抑制前列腺癌細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化*

趙良中， 崔家博， 馬 靜， 王立國(guó)， 方 芳△

(吉林醫(yī)藥學(xué)院 1檢驗(yàn)學(xué)院, 2附屬醫(yī)院， 吉林 吉林 132013)

我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率近年來呈快速上升趨勢(shì)。晚期前列腺癌會(huì)發(fā)生局部淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移，治療效果差。減少前列腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生率在前列腺癌治療過程中非常重要。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟。有效抑制EMT可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的發(fā)生[1-2]。

胡桃醌(juglone)是從核桃楸中提純的一種天然成分，其具有細(xì)胞毒作用，能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[3-5]。最新研究也表明，胡桃醌具有抑制胰腺癌和卵巢癌細(xì)胞侵襲的作用[6-7]。但胡桃醌是否能抑制前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和EMT及機(jī)制還不清楚。本文通過胡桃醌作用前列腺癌細(xì)胞，分析胡桃醌對(duì)前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和EMT的作用，揭示其作用機(jī)制，為前列腺癌的治療提供新的理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

人前列腺癌LNCaP細(xì)胞購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。胡桃醌購(gòu)自Sigma；RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)CS)購(gòu)自HyClone；兔抗上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、Snail、β-actin 抗體和Wnt通路激活劑LiCl購(gòu)自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技有限公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞LNCaP于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)培養(yǎng)，隔日換液。

2.2細(xì)胞活力的檢測(cè) 采用MTT比色法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L，體積為200 μL，接種于96 孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)。加入不同濃度(6.25、12.5、25、50和100 μmol/L)胡桃醌培養(yǎng)液，每組設(shè)3 復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立正常對(duì)照組。體外培養(yǎng)24 h后MTT法測(cè)定吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%。

2.3Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNCaP細(xì)胞，將200 μL含2×104個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)液(含0.2%血清)加入到Matrigel包被的Transwell上室，分別加入0、12.5和25 μmol/L胡桃醌，下室加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 μL，培養(yǎng)24 h。隨后取出小室，用冰上預(yù)冷的PBS 洗滌3 次去除殘余培養(yǎng)基，用濕棉簽擦去小室上層未穿過的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min 之后，室溫晾干。進(jìn)一步使用結(jié)晶紫染色20 min。隨后用冰上預(yù)冷的PBS洗滌3 次，置于倒置顯微鏡下觀察穿過膜的細(xì)胞數(shù)。

2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LNAaP細(xì)胞，分別加入0、12.5和25 μmol/L的胡桃醌作用細(xì)胞24 h。加入細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮器刮取細(xì)胞，4 ℃超聲裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000×g離心5 min，提取細(xì)胞總蛋白，收集上清液測(cè)蛋白濃度。根據(jù)說明書提取細(xì)胞核蛋白，測(cè)蛋白濃度。取30 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，將凝膠上蛋白移至醋酸纖維素膜，于50 g/L 脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜，加兔抗E-cadherin(1∶1 000)、vimentin(1∶1 000)、Snail(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)和β-actin 抗體(1∶3 000)，4 ℃過夜。次日，TBST 洗膜，分別加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)室溫避光孵育2 h。TBST 洗膜，加底物發(fā)光顯影。使用Quantity One 軟件掃描并做灰度分析。

2.5LiCl和胡桃醌聯(lián)合處理細(xì)胞 采用Wnt通路激活劑LiCl(5 μmol/L)處理細(xì)胞3 h，再加入25 μmol/L胡桃醌作用細(xì)胞24 h，然后利用Western blot法測(cè)Snail和E-cadherin的蛋白表達(dá)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胡桃醌抑制LNCaP細(xì)胞的活力

不同濃度胡桃醌處理LNCaP細(xì)胞24 h 后，與對(duì)照組LNCaP細(xì)胞存活率100%進(jìn)行比較，6.25、12.5、25、50和100 μmol/L胡桃醌作用細(xì)胞的存活率分別為(92.9±5.8)%、(79.2±2.1)%、(62.2±1.2)%、(39.1±3.1)%和(19.5±1.9)%,計(jì)算IC50值為35.89 μmol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胡桃醌對(duì)前列腺癌LNCaP細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用。為了避免高濃度胡桃醌導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選擇了12.5 μmol/L和25 μmol/L胡桃醌作用細(xì)胞。

2 胡桃醌抑制LNCaP細(xì)胞的侵襲能力

Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，12.5和25 μmol/L胡桃醌可顯著抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)，見圖1。

3 胡桃醌抑制LNCaP細(xì)胞EMT

Western blot法檢測(cè)EMT標(biāo)志物E-cadherin和vimentin的表達(dá)。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，12.5和25 μmol/L胡桃醌組的E-cadherin蛋白表達(dá)量增高，25 μmol/L 胡桃醌組的vimentin蛋白表達(dá)量下降(P<0.05或P<0.01),見圖2。這一結(jié)果提示，胡桃醌可能具有逆轉(zhuǎn)前列腺癌細(xì)胞EMT的作用。

Figure 1.The invasion ability of the LNCaP cells treated with juglone at different doses (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1胡桃醌對(duì)LNCaP細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 2.The protein expression of E-cadherin and vimentin in the LNCaP cells treated with juglone at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2胡桃醌對(duì)LNCaP細(xì)胞E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的影響

4 胡桃醌抑制Wnt/β-catenin信號(hào)途徑

與對(duì)照組比較，12.5和25 μmol/L胡桃醌組β-catenin和Snail蛋白表達(dá)降低(P<0.05或P<0.01),見圖3。與25 μmol/L胡桃醌組比較，Wnt激活劑LiCl與胡桃醌聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致Snail蛋白表達(dá)升高，E-cadherin蛋白表達(dá)降低(P<0.01),見圖4。

討 論

腫瘤轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是引起大多數(shù)腫瘤患者死亡的原因之一。EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期階段，使具有黏附形態(tài)及不具移動(dòng)能力的上皮細(xì)胞極性消失,轉(zhuǎn)變?yōu)椴痪哂袠O性的間質(zhì)細(xì)胞，失去細(xì)胞間緊密連接，從而使細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力[8]。組織和器官發(fā)生EMT過程的主要特征包括上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物(如E-cadherin)表達(dá)的減少及間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物(如vimentin)的上調(diào)。E-cadherin具有維持正常上皮細(xì)胞的極性、保持細(xì)胞間緊密連接及防治細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的作用。因此，E-cadherin的表達(dá)下降在EMT發(fā)生過程中起到重要的作用[9]。研究表明，EMT在前列腺癌的轉(zhuǎn)移和治療抵抗中也起到重要的作用，常規(guī)激素療法后殘留的前列腺癌細(xì)胞呈顯著EMT表型[9]。因此，發(fā)現(xiàn)有效的治療前列腺癌EMT的藥物至關(guān)重要。

胡桃醌是從核桃楸中提純的一種天然成分，已被證明在某些腫瘤細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的功能[3-7]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胡桃醌能夠抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞遷移和侵襲，并促進(jìn)E-cadherin表達(dá)及抑制vimentin的表達(dá)的作用。結(jié)果表明，胡桃醌可能具有抑制前列腺癌細(xì)胞EMT、減少腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。在EMT的發(fā)生過程中涉及到多種信號(hào)通路和誘導(dǎo)分子的調(diào)節(jié)，其中Wnt 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)EMT的重要途徑之一[10-11], β-catenin是Wnt途徑的關(guān)鍵分子。Wnt通路活化后，能夠使β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子形成復(fù)合物啟動(dòng)Snail等目的基因的轉(zhuǎn)錄。Snail是重要的促進(jìn)EMT的分子，Snail可以直接結(jié)合在E-cadherin基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域，通過降低E-cadhe-rin表達(dá)促進(jìn)EMT的發(fā)生[11-13]。我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胡桃醌能使β-catenin和Snail蛋白的表達(dá)下降，提示胡桃醌可能通過Wnt途徑抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞EMT。為了進(jìn)一步驗(yàn)證胡桃醌通過Wnt途徑抑制前列腺癌細(xì)胞EMT的作用，我們使用了Wnt通路激活劑LiCl處理LNCaP細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LiCl能夠拮抗胡桃醌誘導(dǎo)的Snail蛋白的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)。

Figure 3.The protein expression of β-catenin and Snail in the LNCaP cells treated with juglone at different doses. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖3胡桃醌對(duì)LNCaP細(xì)胞β-catenin和Snail蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.The protein expression of Snail and E-cadherin in the LNCaP cells treated with juglone and LiCl. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsjuglone group.

圖4胡桃醌與LiCl聯(lián)合作用對(duì)LNCaP細(xì)胞Snail和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌可能通過阻滯Wnt/β-catenin/Snail信號(hào)通路抑制前列腺癌細(xì)胞的EMT，從而降低前列腺癌細(xì)胞侵襲。本研究明確胡桃醌抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用，并將其應(yīng)用與前列腺癌的臨床研究和治療，提供一定的理論基礎(chǔ)。