環(huán)孢霉素A誘導大鼠心肌纖維化和對基質金屬蛋白酶及其抑制劑表達的影響*

趙 麗， 尹新華

(1復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院心血管內(nèi)科， 上海 200011； 2哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科， 黑龍江 哈爾濱 150081)

環(huán)孢霉素A(cyclosporine A，CsA)作為有效的免疫抑制劑自應用于臨床以來促進了器官移植的巨大發(fā)展[1]，同時還用于腎病綜合癥和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的治療[2-3]。但隨著CsA臨床應用的深入，研究者發(fā)現(xiàn)其對心、肝和腎等臟器具有毒性作用[4];近年來發(fā)現(xiàn)其亦可導致心肌損傷;我們既往的研究和相關報道也指出其具有心肌損傷作用，并可導致心肌纖維化[5]。到目前為止，CsA導致心肌損傷和心肌纖維化的研究較少，而且其相關機制并不明確。有研究認為心肌纖維化與基質金屬蛋白酶/金屬蛋白酶組織抑制物(matrix metalloproteinases/tissue inhibitor of metalloproteinases，MMPs/TIMPs)的失衡有關[6]。MMPs/TIMPs表達的變化體現(xiàn)在人體的多種病變過程中，在組織重塑、細胞遷移、血管生成和炎癥等過程中發(fā)揮重要作用[7]。本研究的目的在于探討CsA誘導的心肌纖維化與TIMPs/MMPs的關系和CsA誘導心肌纖維化的發(fā)生機制，為CsA在臨床長期安全應用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 設計類型

本研究設計類型為4×3析因設計，其中A因素為環(huán)孢霉素A,B因素為時間，A因素有4個水平(0、低劑量、中劑量和高劑量)，B因素有3個水平(第1周、第2周和第3周)。

2 動物及分組

SPF級健康雌性6～8周齡Wistar大鼠，體重(200±25) g，購自哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心,動物合格證號為；SCXK(黑)2008-002。將CsA注射液(250 mg/5 mL)溶于生理鹽水中，大鼠隨機分為4組，對照(control)組、CsA低劑量(low dose)組、中劑量(middle dose)組和高劑量(high dose)組。對照組給予腹腔注射生理鹽水1 mL，CsA各劑量組分別給予腹腔注射 5、12.5和25 mg·kg-1·d-1CsA。分別在第1、2和3 周時腹腔注射10%水合氯醛(30 mL/kg)，在大鼠行麻醉手術后，開胸迅速取出心臟，利用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)清洗。應用HE染色觀察心肌組織形態(tài)結構、Masson染色觀察心肌膠原沉積情況及心肌纖維化的程度、免疫組織化學和Western blot法檢測MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2蛋白的表達情況。本研究經(jīng)過哈爾濱醫(yī)科大學動物倫理委員會審核批準。

3 主要試劑及儀器

CsA注射液購自哈爾濱血液研究所；多聚甲醛購自Sigma；抗MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2 的I 抗及 II 抗試劑盒購自上海志立生物科技有限公司；RIPA組織細胞快速裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、30%丙烯酰胺(29∶1)、1.0 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)電泳緩沖液、1.0 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)電泳緩沖液、10% SDS和10% 過硫酸銨購自上?；鶢栴D生物有限公司；蛋白預染Marker購自Fermentas；NC膜和發(fā)光液購自Millipore；抗MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2抗體購自Abcam；抗GAPDH抗體購自CST；羊抗兔HRP標記 II 抗、驢抗山羊HRP標記 II 抗和羊抗鼠HRP標記 II 抗購自碧云天生物科技有限公司。電泳儀(Mini Protean 3 Cell)購自Bio-Rad；電轉儀(PS-9)購自大連競邁科技有限公司；Tanon-5200成像系統(tǒng)(Tanon)； 光學顯微鏡(Olympus)；Images Advanced 3.0病理攝片系統(tǒng)(Motic)。

4 主要方法

4.1HE染色觀察心肌組織形態(tài)結構及纖維化程度 用手術刀片在大鼠心臟中下1/3交界處沿心臟橫軸切開，保留左右心室至心尖部，將切取的心臟置于多聚甲醛溶液中，靜止48 h，準備制作蠟塊；其余心臟組織立即液氮速凍。將多聚甲醛中心肌組織制成約4 mm×4 mm×4 mm大小的組織塊，用10%甲醛常溫下固定24 h后流水沖洗，然后逐級乙醛脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，用光學切片機連續(xù)切取全心切片。經(jīng)過染色，分色，中性樹膠固片后，在光學顯微鏡下觀察。

4.2Masson染色觀察心肌膠原沉積情況 切片在二甲苯中脫蠟10 min，移入二甲苯和乙醇(1∶1)混合液中5 min。乙醇梯度密度脫水。0.5%的蘇木素染色10 min，水洗后1%的鹽酸乙醇分色60 s再水洗，用1/400氨水促藍并水洗至無氨味，用橘黃G媒染60 s，用水快速洗，麗春紅染色5 min水洗2 min，1%的磷鎢酸分色6 min，水快速洗，甲基藍染色10 min，水洗干凈，95%的乙醇分色40 s，100%的乙醇脫水2次，每次3 min，二甲苯透明2次，每次10 min，樹膠封片。膠原纖維染成藍色，胞質、肌細胞和紅細胞染成紅色，胞核染成藍褐色。采用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，測量心肌膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)，CVF=心肌間質膠原面積/所測視野面積。每張心肌切片標本均隨機取5個視野(×400)測量，取平均值，對心肌間質進行膠原定性及半定量分析。

4.3免疫組織化學檢測MMPs/TIMPs蛋白的表達 蠟塊切片于80 ℃烤箱中烤片5 min，二甲苯脫蠟3次，每次10 min，梯度乙醇脫水各10 min，蒸餾水沖洗2次。配制新鮮的3%的過氧化氫液，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min。蒸餾水沖洗2次，加抗原修復液，高壓修復，室溫冷卻。蒸餾水沖洗1次，PBS沖洗3次各5 min，準備濕盒，擦片后加 I 抗，4 ℃過夜。4 ℃冰箱取出濕盒，PBS沖洗3次各5 min；擦片，加 II 抗，每片50 μL左右；室溫下靜置20 min，PBS沖洗3次，每次5 min， DAB鏡下顯色。自來水沖洗5 min，蘇木素復染，自來水沖洗10 min，梯度乙醇脫水各3 min，二甲苯透明各5 min，封片。細胞核染成藍色，心肌細胞及間質淡染，MMP2、MMP9、TIMP1和TIMP2蛋白染成棕色，呈細顆粒狀，在細胞質內(nèi)表達，采用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)，測量積分吸光度(integrated absorbance，IA)。每張心肌切片標本均隨機取5個視野(×400)測量，取平均值。

4.4Western blot檢測MMPs/TIMPs蛋白的表達 將大鼠心肌組織剪成細小的碎片，按每20 mg組織加入250 μL裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑)，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清，進行BCA蛋白定量后貯存于-80 ℃冰箱。根據(jù)目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度。每孔上樣量約為50 μg蛋白。根據(jù)蛋白定量結果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min后離心取上清上樣。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液。將樣品緩慢加到對應的孔內(nèi)，注意勿溢出加樣孔。濃縮膠80 V，20 min，分離膠120 V，60 min。通過半干式轉膜，25 V轉膜30 min。封閉4 ℃過夜。根據(jù)說明書，各抗體稀釋度為 1∶1 000(MMP2、MMP9和TIMP2)、 1∶500(TIMP1)和1∶2 000(GAPDH,用作內(nèi)參照)，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，4 ℃孵育過夜。孵育 I 抗的膜用TBST洗滌3次，每次5 min。隨后根據(jù)用量，按照1∶1 000稀釋HRP標記的 II 抗，與膜37 ℃孵育1 h。用TBST洗滌3次，每次5 min。最后通過Tanon-5200成像系統(tǒng)進行ECL化學發(fā)光檢測。

5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用4×3析因設計方差分析、多元方差分析及SNK多重比較，分析處理因素和時間因素之間的交互作用、主效應和單獨效應。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 動物模型復制結果

給予 CsA 后，大鼠相繼出現(xiàn)進食和飲水減少，毛發(fā)光澤減少，稀疏脫落，精神萎糜不振，體重明顯減輕，注射第2周，高劑量組大鼠死亡2只；注射第3周，中劑量組和高劑量組各死亡1只。剖檢死亡大鼠，可見肝膿腫和肺膿腫。癥狀表現(xiàn)及死亡率與劑量相關。

2 HE染色結果

在第3周，對照組大鼠心肌細胞呈橢圓形，細胞核大，呈圓形或橢圓形，位于細胞中央，染色均勻，肌漿豐富；CsA低劑量組心肌細胞出現(xiàn)不同程度的水腫，胞漿嗜酸性改變、呈細顆粒狀，心肌細胞空泡變；CsA中劑量組部分心肌橫紋消失，核濃縮，心肌灶狀壞死，出現(xiàn)間質纖維化；CsA高劑量組出現(xiàn)明顯的心肌細胞纖維化。CsA用藥組心肌組織病理損傷隨劑量增加和時間延長而加重，見圖1。

3 Masson染色結果

對照組心肌細胞排列規(guī)則、細胞漿均染、細胞大小均等，心肌間質見少量正常纖維化。CsA低劑量組心肌細胞排列紊亂，部分心肌細胞體積縮小，血管周圍纖維化增加，部分間質可見纖維化，CVF值較對照組明顯增高(P<0.05)，有明顯膠原沉積。CsA中劑量組心肌細胞排列紊亂加重，部分心肌細胞凋亡明顯，可見體積縮小的心肌細胞的數(shù)量增多，膠原沉積的面積增加(P<0.05)，纖維化從血管周圍向間質延伸。CsA高劑量組心肌細胞損傷最重，心肌細胞可見大面積的凋亡壞死，可見已經(jīng)壞死凋亡的區(qū)域有膠原大量沉積(P<0.05)，被纖維化所替代，間質纖維化程度重，并可見炎癥細胞浸潤，見圖2、表1。

Figure 1.The images of the myocardium with HE staining at the 3rd week of CsA exposure (×400).

圖1CsA作用第3周各實驗組大鼠心肌組織的HE染色觀察

Figure 2.The images of the myocardium with Masson staining at the 3rd week of CsA exposure (×400).

圖2CsA作用第3周各實驗組心肌組織的Masson染色觀察

表1 CsA對大鼠心肌纖維化的影響

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCsA (low dose) group.

4 免疫組織化學檢測MMPs/TIMPs蛋白表達結果

4.1MMP2蛋白表達結果 對照組細胞質內(nèi)僅見極少量的染成棕色的MMP2蛋白。CsA各劑量組的IA值明顯高于對照組(P<0.05)，相同劑量CsA組隨用藥時間的延長,IA值均表現(xiàn)出由第1周時的高峰逐漸下降、第3周時達到最低的相同變化規(guī)律(P<0.05)，見圖3、表2。

4.2TIMP2蛋白表達結果 對照組各時點細胞質內(nèi)僅見極少量棕染的TIMP2蛋白。CsA在導致大鼠心肌纖維化過程中TIMP2蛋白的表達增加(P<0.05)，大部分TIMP2蛋白的IA值表現(xiàn)出在同一劑量下較前一用藥時點顯著升高，同一用藥時點較前一CsA用藥組劑量的差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見圖4、表3。

4.3MMP9蛋白表達結果 對照組細胞質內(nèi)有大量棕染的MMP9蛋白，表明MMP9的表達水平增高。各用藥組在第1周時IA值明顯減低(P<0.05)，第2周時增高，第3周時又明顯下降，此時也可以看到胞漿內(nèi)細顆粒狀棕染部分隨用藥時間的延長而變化。同一時間，各用藥組表達水平的差異部分有統(tǒng)計學顯著性(P<0.05),見圖5、表4。

Figure 3.The expression of MMP2 in the myocardial tissues of different groups was detected by the method of immunohistochemistry at the 3rd week of CsA exposure (×400).

圖3CsA作用第3周各實驗組MMP2免疫組織化學檢測結果

表2CsA誘導大鼠心肌纖維化時MMP2蛋白的表達

Table 2.The expression of MMP2 protein in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by immunohistochemical staining (Mean±SD.n=5)

Group IA1st week2nd week3rd weekControl43.11±17.3425.79±8.3961.49±33.09CsA (low dose)1 367.10±418.08*1 097.60±376.77*553.59±185.22*△CsA (middle dose)1 768.10±195.49*872.03±154.55*▲521.98±207.58*△CsA (high dose)1 604.60±490.81*1 270.80±269.11*935.04±306.94*#△

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

Figure 4.The expression of TIMP2 in the myocardial tissues of different groups was detected by the method of immunohistochemistry at the 3rd week of CsA exposure (×400).

圖4CsA作用第3周各實驗組TIMP2免疫組織化學檢測結果

表3CsA誘導大鼠心肌纖維化時TIMP2蛋白的表達

Table 3.The protein expression of TIMP2 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by immunohistochemical staining (Mean±SD.n=5)

Group IA1st week2nd week3rd weekControl154.56±33.4634.04±12.1632.14±9.00CsA (low dose)1 323.03±325.02*2 035.95±287.81*▲1 565.50±404.02*△CsA (middle dose)1 150.80±181.54*1 049.40±308.43*&1 590.40±278.32*&△CsA (high dose)855.39±162.45*#2 157.50±272.75*#▲3 606.80±381.11*#△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

Figure 5.The expression of MMP9 in the myocardial tissues of different groups was detected by the method of immunohistochemistry at the 3rd week of CsA exposure (×400).

圖5CsA作用第3周各實驗組MMP9免疫組織化學檢測結果

4.4TIMP1蛋白表達結果 對照組在各時點的細胞質內(nèi)可見大量棕染的TIMP1蛋白，與對照組相比，CsA用藥組的IA值明顯減低(P<0.05)，各用藥組在1周時TIMP1蛋白的IA值明顯減低，第2周時增高，第3周時又明顯下降(P<0.05)，第2周和第3周時，CsA高劑量組與CsA低劑量組相比IA值有明顯增加(P<0.05),見圖6、表5。

表4CsA誘導大鼠心肌纖維化時MMP9蛋白的表達

Table 4.The protein expression of MMP9 in the myocardum with CsA-induced fibrosis determined by immunohistochemical staining (Mean±SD.n=5)

Group IA1st week2nd week3rd weekControl3 800.10±798.024 093.60±586.254 212.80±355.22CsA (low dose)2 060.40±365.55*4 107.30±613.07▲1 585.50±402.36*△CsA (middle dose)3 172.30±481.61*&4 455.40±478.78▲1 883.30±286.63*△CsA (high dose)2 113.60±346.55*#4 079.00±515.87▲2 022.50±633.32*△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

Figure 6.The expression of TIMP1 in the myocardial tissues of different groups was detected by the method of immunohistochemistry at the 3rd week of CsA exposure (×400).

圖6CsA作用第3周各實驗組TIMP1免疫組織化學檢測結果

表5CsA誘導大鼠心肌纖維化時TIMP1蛋白的表達

Table 5.The protein expression of TIMP1 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by immunohistochemical staining (Mean±SD.n=5)

Group IA1st week2nd week3rd weekControl3 568.00±413.723 107.30±496.012 738.80±200.78CsA (low dose)798.95±190.04*1 504.30±496.98*▲774.13±206.99*△CsA (middle dose)965.88±387.74*1 094.71±271.89*643.68±155.86*&CsA (high dose)1 048.99±178.91*1 807.30±289.35*#▲1 266.20±237.74*#△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

5 Western blot檢測MMPs/TIMPs蛋白的表達結果

5.1MMP2蛋白表達結果 各用藥組與對照組比較表達明顯增高(P<0.05)；各用藥組在第1周高表達，隨時間延長表達逐漸減低(P<0.05)；同一時點，各用藥組隨劑量增加表達增高(P<0.05),見圖7、表6。

5.2TIMP2蛋白表達結果 各用藥組與對照組比較表達明顯增高(P<0.05)；各用藥組隨時間延長表達逐漸增高(P<0.05)；同一時點，各用藥組隨劑量增加表達增高(P<0.05),見圖7、表7。

5.3MMP9蛋白表達結果 各用藥組與對照組比較表達減低(P<0.05)；各用藥組在第1周低表達，第2周表達增高，第3周表達降低(P<0.05)；同一時點，各用藥組表達變化的差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05),見圖7、表8。

5.4TIMP1蛋白表達結果 部分用藥組與對照組比較表達減低(P<0.05)；各用藥組在各時點變化不具有統(tǒng)計學意義；同一時點，部分用藥組隨CsA劑量的增加表達增高(P<0.05)，見圖7、表9。

討 論

心臟移植是目前治療終末期心臟病重要而有效的方法，CsA 是心臟移植后常用的免疫抑制劑，但其肝、腎臟毒性特別是致心肌損傷的副作用甚至是心肌纖維化已經(jīng)限制了其臨床應用，本研究的目的在于探討CsA誘導的心肌纖維化與TIMPs、MMPs關系和CsA誘導心肌纖維化的發(fā)生機制。心臟間質主要由細胞外基質構成，包括膠原和蛋白多糖等，其中I、III型膠原是細胞外基質的主要成分[8]。正常生理情況下，膠原的合成和降解處于動態(tài)的平衡當中，當膠原合成增加或降解減少時均可引起膠原的沉積，而降解大于合成時，則會破壞膠原的網(wǎng)絡結構[9]，導致纖維化的發(fā)生。MMPs/TIMPs是膠原的降解系統(tǒng)，其中MMPs/TIMPs表達的改變或MMPs/TIMPs比例失衡都可以導致膠原的合成和降解異常，從而引起心室重構、心肌纖維化[10]。若MMPs過表達或MMPs/TIMPs比值增高，則使膠原過度降解，由缺乏連接結構的纖維所取代而引起心室壁變薄、心腔擴大。若MMPs低表達或MMPs/TIMPs比值減低，則膠原的合成大于降解而使膠原過度沉積，導致心室壁增厚，心肌的重量明顯增加[11]。因此，MMPs和TIMPs表達的變化貫穿于心室重構、心肌纖維化的全部過程，不同的發(fā)展階段，其表達有不同的特征。

Figure 7.The images of Western blot for determining the protein expression levels of MMP2, MMP9, TIMP2 and TIMP1 in the myocardium in different groups at different time points. C: control group; L: low dose of CsA group; M: middle dose of CsA group; H: high dose of CsA group. C1, L1, M1 and H1: corresponding groups at the 1st week; C2, L2, M2 and H2: corresponding groups at the 2nd week; C3, L3, M3 and H3: corresponding groups at the 3rd week.

圖7Westernblot檢測不同時點和組別心肌組織MMP2、MMP9、TIMP2和TIMP1蛋白的相對表達量

我們的研究發(fā)現(xiàn)，MMPs、TIMPs及MMPs/TIMPs在CsA誘導的大鼠心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中呈階段性的變化。CsA各用藥組第1周時即有心肌細胞不同程度的水腫，胞漿嗜酸性改變，隨用藥時間延長部分心肌橫紋消失，核濃縮、心肌灶狀壞死，心肌細胞體積縮小、凋亡、膠原逐漸沉積，間質纖維化；同時大劑量組短時間和低劑量組長時間用藥也出現(xiàn)了明顯的纖維化。MMP2在CsA誘導的大鼠心肌纖維化的初期即有高表達，其表達達到高峰，而隨著給藥時間的延長其表達量逐漸減少，但較對照組相比表達仍增高。我們推測心肌在CsA長時間大劑量的作用下產(chǎn)生大量的氧自由基及各種細胞因子和生長因子，如白細胞介素和腫瘤壞死因子及轉化生長因子等，在這些因素的作用下刺激成纖維細胞分泌合成大量的膠原，同時也分泌合成MMP2來降解過多的膠原。隨著損傷的持續(xù)存在，過高表達的MMP2又可刺激組織產(chǎn)生腫瘤壞死因子及轉化生長因子等，使膠原合成增加，形成惡性循環(huán)，最終膠原合成的速率大于降解的速率而發(fā)生膠原沉積，結果是同一劑量組其降解在病理性損傷的早期階段被激活并達到高峰，在纖維化形成階段被抑制。而同一時點，隨劑量的增加，其降解在高劑量組也達到高峰。研究結果提示MMP2不僅在膠原的降解過程中起重要作用，也參與了膠原合成的調節(jié)，結果是MMP2表達增高的同時伴有纖維化的發(fā)生。TIMP2作為MMPs的內(nèi)源性的組織性抑制劑，抑制除了MMP9以外的所有的MMPs，對MMP2具有特異性[12]。TIMPs除了具有抑制MMPs的作用外，還具有生長因子樣作用及調控細胞增殖和凋亡的作用。在組織中，TIMP2的表達只受MMP2的影響，隨MMP2表達的改變而變化。同一劑量組在CsA誘導的大鼠心肌纖維化的初期其表達增高，在纖維化形成的過程當中逐漸增高，與MMP2相比，纖維化初始階段其表達低于MMP2，在纖維化形成時其表達高于MMP2。在纖維化的初期TIMP2為抑制MMP2的過表達其合成和分泌也增加，隨用藥時間的延長，TIMP2的合成和分泌大于MMP2的量，而使降解減少，膠原的合成大于降解，發(fā)生纖維化，也說明TIMP2與MMP2表達的不同步即兩者之間存在失衡；從同一時點觀察，兩者的失衡導致的纖維化也很明顯。TIMP2與MMP2表達的不同步即兩者的失衡導致纖維化除了上述原因外，也與TIMPs-MMPs形成復合物在一定條件下再激活MMPs有關。轉化生長因子可促進I、II及Ⅳ型膠原和蛋白多糖的合成，抑制細胞外基質的降解，促進TIMPs的表達，促進整合素的表達，增強細胞-基質的相互作用。以上因素共同促進了TIMP2的過表達，而 MMP2/TIMP2失衡，導致了纖維化的發(fā)生發(fā)展。

表6CsA誘導大鼠心肌纖維化時MMP2蛋白的表達

Table 6.The protein expression of MMP2 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by Western blot (Mean±SD.n=3)

Group Relative protein expression (MMP2/GAPDH)1st week2nd week3rd weekControl0.132±0.0060.146±0.0050.117±0.009CsA (low dose)0.365±0.006*0.346±0.011*▲0.250±0.010*△CsA (middle dose)0.554±0.009*&0.514±0.020*&▲0.445±0.011*&△CsA (high dose)0.602±0.013*#0.556±0.009*#▲0.509±0.008*#△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

表7CsA誘導大鼠心肌纖維化時TIMP2蛋白的表達

Table 7.The protein expression of TIMP2 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by Western blot (Mean±SD.n=3)

Group Relative protein expression (TIMP2/GAPDH)1st week2nd week3rd weekControl0.174±0.0060.157±0.0070.144±0.009CsA (low dose)0.313±0.009*0.458±0.034*▲0.543±0.007*△CsA (middle dose)0.440±0.017*&0.569±0.020*&▲0.662±0.015*&△CsA (high dose)0.472±0.008*#0.662±0.012*#▲0.756±0.036*#△

*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsCsA (low dose) group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

表8CsA誘導大鼠心肌纖維化時MMP9蛋白的表達

Table 8.The protein expression of MMP9 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by Western blot (Mean±SD.n=3)

Group Relative protein expression (MMP9/GAPDH)1st week2nd week3rd weekControl0.964±0.0360.933±0.0240.848±0.031CsA (low dose)0.404±0.010*0.719±0.023*▲0.291±0.012*△CsA (middle dose)0.420±0.012*0.726±0.008*▲0.264±0.012*△CsA (high dose)0.345±0.008*0.687±0.015*▲0.297±0.008*△

*P<0.05vscontrol group;▲P<0.05vs1st week;△P<0.05vs2nd week.

表9CsA誘導大鼠心肌纖維化時TIMP1蛋白的表達

Table 9.The protein expression of TIMP1 in the myocardium with CsA-induced fibrosis determined by Western blot (Mean±SD.n=3)

Group Relative protein expression (TIMP1/GAPDH)1st week2nd week3rd weekControl0.697±0.0250.707±0.0340.562±0.176CsA (low dose)0.421±0.132*0.464±0.1380.373±0.120CsA (middle dose)0.528±0.0930.537±0.091*0.463±0.070CsA (high dose)0.573±0.080#0.612±0.048#0.557±0.017

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCsA (middle dose) group.

CsA各用藥組的MMP9蛋白表達在第1周時下降，隨后第2周時升高，第3周時又下降的趨勢。而TIMP1作為MMPs的組織性抑制劑，也表現(xiàn)出同樣的趨勢。López 等[13]通過組織活檢也發(fā)現(xiàn)高血壓患者血漿 TIMP1 水平與心肌纖維化程度有著直接關系。TIMP1作為MMPs的組織性抑制劑，其作用是降解除MMP2、膜型MMP外所有的MMPs，對MMP9具有特異性[14]。多數(shù)研究認為，MMP2/TIMP2與心肌肥厚、心肌纖維化相關，而MMP9/TIMP1與心臟擴大的關系更密切。從我們的實驗結果可以看出，在纖維化初期，MMP2的表達增高更明顯，且在纖維化的形成過程中MMP2/TIMP2的變化與之關系更緊密，因此也可以解釋在纖維化初期時MMP9表達降低的原因。但隨著用藥時間的延長、損傷的加重，基膜和彈力纖維的降解也增加，同時已激活的MMPs之間也可以相互激活，因此MMP9的表達也增高，TIMP1為抑制MMP9的表達其分泌也增加，說明兩者在纖維化的形成中也起一定的作用。但隨著膠原逐漸沉積、纖維化程度逐漸加重，MMP9和TIMP1轉而下降，故認為MMP9和TIMP1可能在以后心室的擴張中起更關鍵的作用。我們也發(fā)現(xiàn)，同一時間，TIMP1增高的趨勢大于MMP9，說明隨劑量的增加，MMP9/TIMP1的失衡同樣也參與了纖維化的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，MMP2、TIMP2、MMP9和TIMP1表達的變化及MMPs/TIMPs的失衡在CsA致大鼠心肌纖維化的過程中起重要作用。其致纖維化的作用機制主要是MMPs、TIMPs的自我調節(jié)和相互影響。因此可以通過糾正MMPs/TIMP的失衡，抑制由CsA引起的心肌纖維化，從而達到修復心肌功能的目的。