結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗在結(jié)核性胸膜炎診斷中的價值

趙忠勤

（遼寧省撫順市第四醫(yī)院結(jié)核二病房，遼寧 撫順 113123）

結(jié)核性胸膜炎是一種肺外結(jié)核病，在我國被列為結(jié)核病的第四類型，是引起患者胸腔積液的主要原因，占比可達(dá)49.5%～54.5%[1]。結(jié)核性胸膜炎沒有特異性的臨床表現(xiàn)，增大了診斷的難度。目前在為結(jié)核性胸膜炎患者實施很短的過程中，最為主要的診斷參考依據(jù)有：胸腔積液的常規(guī)檢查、影像學(xué)表現(xiàn)、臨床表現(xiàn)、病史問詢等，并要結(jié)合臨床治療效果實施判斷，通過這種常規(guī)的診斷方式，其診斷準(zhǔn)確率是比較低的，難以將其與惡性胸腔積液予以良好的鑒別，很容易導(dǎo)致出現(xiàn)誤診，從而引發(fā)嚴(yán)重后果。隨著各項技術(shù)的進(jìn)步與發(fā)展，在結(jié)核性胸膜炎的臨床診斷工作中，逐漸引進(jìn)了病理學(xué)檢查與細(xì)菌學(xué)檢查，隨著一段時間的研究與發(fā)展，這意見逐漸發(fā)展成為結(jié)核性胸膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是在實際的臨床應(yīng)用中，結(jié)核性胸腔積液當(dāng)中所包含的細(xì)菌含量是比較小的，胸腔積液中結(jié)核菌培養(yǎng)及涂片分枝桿菌陽性率是比較低的，再加上胸腔積液中結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)時間比較長，通過胸腔鏡取病理檢查或者是胸膜活檢的方式檢查出的陽性率是比較高的，但是這都是有創(chuàng)的檢查方式，很難在臨床上大規(guī)模的常規(guī)應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及免疫學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，其在大規(guī)模篩查中的適用性越來越高，并且具有快速、簡便的特點，但是還是存在操作不當(dāng)影響檢查結(jié)果、假陽性等缺陷，這導(dǎo)致其在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用存在一定的局限性，探究一種新型的檢測技術(shù)，促使結(jié)核性胸膜炎診斷準(zhǔn)確性的提升具有非常重要的意義。為了提高診斷的準(zhǔn)確率，以本院2015年11月～2017年11月收治的55例結(jié)核性胸膜炎的患者為研究對象，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象選為2015年11月～2017年11月于本院接受診治的結(jié)核性胸膜炎患者、惡性胸腔積液患者、非結(jié)核性胸膜炎患者和健康志愿者各55例，所選患者均無合并其他嚴(yán)重的器官性疾病和精神疾病等。結(jié)核性胸膜炎組有男28例和女27例，年齡20～70歲，平均（42.8±13.5）歲；惡性胸腔積液組有男29例和女26例，年齡24～68歲，平均（43.5±11.8）歲；非結(jié)核性胸膜炎組有男27例和女28例，年齡22～69歲，平均（43.0±11.4）歲；健康志愿者組有男28例和女27例，年齡22～70歲，平均（43.7±11.2）歲。對4組患者的臨床資料進(jìn)行比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。1.2 方法 采集被檢者的外周靜脈血4 ml，放置于抗凝試管中，加入一定量的肝素鋰并使其混合均勻，在4小時內(nèi)完成外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的分離，具體操作如下：取一個離心管，記為1號，注入4 ml RPMI1640培養(yǎng)液，將混合均勻的4 ml抗凝血液樣本導(dǎo)入此離心管中，使二者均勻混合。再取一個離心管，記為2號，注入淋巴細(xì)胞分離液3 ml，將先前完成混合的血壓樣本緩慢倒入2號離心管中淋巴細(xì)胞分離液的上方，然后置于離心機中進(jìn)行離心操作，時間設(shè)置在20 min左右，離心完成后用加樣器吸取白細(xì)胞層，放入一個15 ml的離心管中，記為3號，再加入RPMI1640培養(yǎng)液11 ml，離心7 min，待沉淀完全后取分離出的上清液于離心管4號，加入一定量的無血清培養(yǎng)液，即AIMV，配置細(xì)胞工作液。

以細(xì)胞工作液進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗：在板條上制4孔，分別加入50μl的AIMV、抗原A（ESAT-6：結(jié)核分枝桿菌早期分泌靶向抗原6）、抗原B（CFP-10：培養(yǎng)濾液蛋白10）和陽性對照[2]，在每個孔中均加入100μl的細(xì)胞工作液。將板條放置入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行16～20 h的溫育，箱內(nèi)溫度維持在37℃，CO2濃度為5%。溫育時間到達(dá)后，取出板條，倒出孔中液體，使用磷酸鹽緩沖液沖洗4次后，于每孔加入堿性磷酸酶標(biāo)記過的小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體50μl，再次置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行1 h的溫育，箱內(nèi)溫度設(shè)定在4～8℃，板條取出后再次用磷酸鹽緩沖液沖洗4次。沖洗過后，加入50μl的顯色底物，置于培養(yǎng)箱中在暗處、室溫下溫育7 min，取出板條后用自來水沖洗，晾干，2～3 h后讀取結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) 比較4組被檢者的陽性率，以T-SPOT.TB試劑盒的使用說明書為所測血液樣本結(jié)果的判定依據(jù)，陽性：血液樣本的陰性對照孔斑點形成細(xì)胞（SFC）小于6，且（檢測孔SFC-陰性對照孔SFC）×4的計算值不小于24；陰性：血液樣本的陰性對照孔SFC不小于6，且檢測孔SFC為陰性對照孔SFC的2倍。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理，計數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

以ESAT-6抗原、CFP-10抗原作為刺激物時，結(jié)核性胸膜炎組的陽性率大幅超出惡性胸腔積液組、非結(jié)核性胸膜炎組和健康志愿者，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。ESAT-6/CFP-10聯(lián)合2種抗原檢測的陽性率顯著高于單種抗原檢測的陽性率，對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 4組被檢者的測試結(jié)果統(tǒng)計情況[n（%）]Table 1 4 Statistics of test results for 4 groups of subjects[n(%)]

3 討論

胸膜炎是致病因子侵犯人體的胸膜引起炎癥的疾病，可分為10種類型，結(jié)核性胸膜炎是最為常見的一種，是結(jié)核桿菌及其自溶產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物進(jìn)入機體的胸膜腔而引發(fā)的[3-4]。結(jié)核性胸膜炎患者的臨床表現(xiàn)不存在特異性，難以根據(jù)臨床癥狀來確診。臨床上將在胸腔積液中檢查到抗酸桿菌和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，如果利用細(xì)菌學(xué)方法診斷，檢測的陽性率很低；胸膜活檢的準(zhǔn)確性高，但是對患者的創(chuàng)傷很大[5-6]。因此，臨床上需要一種無創(chuàng)微創(chuàng)、檢測陽性率高的方式來進(jìn)行早期診斷。

本研究中使用的結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗是在酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，檢測原理是基于結(jié)核分枝桿菌的基因中存在著“RD1”的序列，該序列編碼能產(chǎn)生兩種蛋白，分別是本研究中使用的ESAT-6和CFP-10，以這兩種蛋白作為特異性抗原，能將機體中的T淋巴細(xì)胞刺激成為致敏T淋巴細(xì)胞，并分泌出IFN-γ細(xì)胞因子[7-8]；結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗?zāi)軌驈膯渭?xì)胞水平檢測到分泌抗體細(xì)胞或者是分泌細(xì)胞因子細(xì)胞，每個顯色斑點均代表著一個結(jié)核分枝桿菌致敏的T淋巴細(xì)胞，因此，通過斑點的數(shù)目即可判定機體內(nèi)是否存在著致敏T淋巴細(xì)胞，并可計算數(shù)目，從而可知是否存在著結(jié)核分枝桿菌[9]。從研究結(jié)果來看，結(jié)核性胸膜炎組結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗的陽性檢出率高達(dá)85.5%和78.2%，聯(lián)合使用ESAT-6和CFP-10的話，可將陽性率大幅提高至92.7%。已有的研究結(jié)果指出，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的存活期是非常短的，一般在病原體被消滅之后就會消失，所以臨床上對外周血結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗結(jié)果來進(jìn)行評估，也能夠?qū)颊叩呐R床療效評估及病情活動性的監(jiān)測提供一定的參考依據(jù)。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗出現(xiàn)假陰性或者是假陽性的概率也是非常低的，出現(xiàn)假陰性可能與在細(xì)胞免疫發(fā)生前獲取了標(biāo)本存在一定的關(guān)聯(lián)性，有時也會因為少數(shù)免疫系統(tǒng)功能的不健全導(dǎo)致其值與臨界值接近，對于這種情況，對所選取的參考值應(yīng)仔細(xì)考量、慎重選擇，綜合的考慮其他輔助檢查結(jié)果及患者的臨床表現(xiàn)來進(jìn)行進(jìn)一步的判斷，對于假陽性的出現(xiàn)，可能與患者曾今有過結(jié)核分枝桿菌潛伏性感染存在一定的關(guān)聯(lián)性[10]。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法相比，結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗應(yīng)用于結(jié)核性胸膜炎患者臨床診斷中的穩(wěn)定性更高，但是實驗人員操作手法等外在因素也會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響，并且在溫度環(huán)境比較低的情況下，環(huán)境中的效應(yīng)T淋巴數(shù)量會有所減少，若是將獲取的胸水長時間放置，會導(dǎo)致其T淋巴數(shù)量逐漸減少，甚至是消失，因此，臨床診斷過程中，送檢的胸水必須是新鮮采集的。

綜上所述，核感染T細(xì)胞斑點試驗用于結(jié)核性胸膜炎的診斷有較高的準(zhǔn)確率，操作簡單，建議臨床采納和推廣。