煤地質(zhì)環(huán)境微生物總基因組DNA提取方法的優(yōu)化

楊秀清 陳彥梅 吳瑞薇 王保玉 韓作穎

（1. 山西大學(xué)生物技術(shù)研究所化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006；2. 煤與煤層氣共采國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，晉城 048000；3. 易安藍(lán)焰煤與煤層氣共采技術(shù)有限責(zé)任公司，晉城 048000）

煤層氣是成煤過(guò)程中生成的非常規(guī)天然氣，是一種潔凈的化石能源。據(jù)國(guó)際能源機(jī)構(gòu)（IEA）估計(jì)，全世界煤層氣資源量達(dá)263.8×1012m3，約占世界天然氣總儲(chǔ)量的30%以上，而我國(guó)的煤層氣資源量約有30×1012-36.81×1012m3，具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。煤層氣的開(kāi)發(fā)不僅能夠改善能源供給結(jié)構(gòu)，同時(shí)還有助于煤礦的安全開(kāi)采，實(shí)現(xiàn)溫室氣體的減排，具有重大的社會(huì)、環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益。近年來(lái)，世界上各大產(chǎn)煤國(guó)也相繼開(kāi)展了煤層氣的開(kāi)發(fā)與利用。然而，礙于煤層氣生產(chǎn)井的壽命短，如何實(shí)現(xiàn)煤層氣的增產(chǎn)已成為了當(dāng)今煤層氣開(kāi)發(fā)的重要研究?jī)?nèi)容。

根據(jù)成因不同，煤層氣可分為生物成因氣和熱成因氣。其中，生物成因氣是由微生物降解煤或煤層有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生［1］，其存在已在大量煤田中證實(shí)［2-4］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于微生物成氣機(jī)理的研究還多集中在實(shí)驗(yàn)室模擬［5-8］，盡管成績(jī)顯著，但至今有關(guān)煤的生物降解是如何實(shí)現(xiàn)的還不是很清楚，從而阻礙了我們采取策略去刺激煤層微生物產(chǎn)生額外的甲烷。解析產(chǎn)氣微生物群落的多樣性有助于掌握功能微生物的類(lèi)型，為實(shí)現(xiàn)調(diào)控微生物成氣及揭示微生物成氣機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。然而，通過(guò)常規(guī)的分離培養(yǎng)方法，環(huán)境中能培養(yǎng)分離出的微生物僅占環(huán)境樣品總數(shù)的 1%-10%［9］，無(wú)法完整地解析樣品中微生物的種類(lèi)及豐度?；诃h(huán)境微生物總DNA，宏基因組學(xué)、分子指紋圖譜技術(shù)等免培養(yǎng)技術(shù)，為揭開(kāi)不可培養(yǎng)微生物的神秘面紗提供了技術(shù)支撐。然而，一些特殊環(huán)境中較完整的微生物DNA的提取實(shí)屬不易，因此，一種有效的、高質(zhì)量的微生物基因組提取方法成為決定數(shù)據(jù)準(zhǔn)確全面的關(guān)鍵。

煤地質(zhì)環(huán)境樣品組成較復(fù)雜，除了含有煤顆粒外，還存在大量理化性質(zhì)復(fù)雜的物質(zhì)，如腐植酸、煤降解中間產(chǎn)物多環(huán)芳烴、酚類(lèi)等物質(zhì)［10-11］，這些物質(zhì)的存在易使環(huán)境中的微生物吸附在其表面，不易分開(kāi)，從而阻止了細(xì)胞內(nèi)總DNA的釋放。其次，腐植酸、酚類(lèi)等物質(zhì)的存在會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)生抑制，容易造成對(duì)環(huán)境微生物多樣性的偏低估計(jì)［12］。因此，充分裂解樣品中的細(xì)胞、除去樣品中的PCR抑制物，成為了獲得高質(zhì)量微生物總基因組DNA的關(guān)鍵。由于煤地質(zhì)環(huán)境微生物基因組DNA的提取及對(duì)DNA保障的品質(zhì)均具有一定難度，所以，目前還沒(méi)有一種較適合煤地質(zhì)環(huán)境中微生物基因組高效提取的方法。近年來(lái)，關(guān)于煤地質(zhì)環(huán)境中微生物總DNA的提取，多數(shù)學(xué)者均采用土壤試劑盒法［4，13-14］，但試劑盒所針對(duì)的樣品在性質(zhì)和組成上與煤地質(zhì)環(huán)境樣品存在有一定的差異，煤地質(zhì)環(huán)境相對(duì)而言含有更加豐富的有機(jī)質(zhì)雜質(zhì)，高品質(zhì)DNA的提取就會(huì)比其他樣品更加困難，用土壤試劑盒對(duì)煤地質(zhì)環(huán)境微生物基因組DNA進(jìn)行提取未必是一種最佳選擇。重要的是，土壤試劑盒價(jià)格昂貴，科研成本高，使用次數(shù)有限，不適用于大批量樣品的DNA提取。因此，開(kāi)發(fā)適用于煤地質(zhì)環(huán)境中微生物總DNA大量高效提取的方法對(duì)于研究煤層氣田微生物分子生態(tài)學(xué)及生物成氣機(jī)理都具有重要意義。

本研究在參考前人工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)DNA抽提方法（酚-氯仿法）進(jìn)行改進(jìn)，建立了一種經(jīng)濟(jì)可行的可用于煤地質(zhì)環(huán)境中微生物基因組DNA高效提取的方法。并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳及PCR擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)檢測(cè)提取基因組DNA的質(zhì)量，以確定建立基因組DNA提取方法的可行性及可靠性，為研究煤地質(zhì)環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性、生物成氣機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料Rhodococcussp.R04，由山西大學(xué)生物技術(shù)研究所化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。無(wú)煙煤塊煤，取自山西晉煤集團(tuán)寺河礦區(qū)。煤層水樣，取自山西晉煤集團(tuán)寺河礦區(qū)煤層氣井。煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣，取自山西省晉城市煤與煤層氣共采國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基配制 TPM緩沖液（50mmol/L Tris-HCl，1.7% PVP，20 mmol/L MgCl2·6H2O）、STE緩 沖 液（6 g/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA）、Proteinase K、十二烷基磺酸鈉（SDS）、酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1 V/V/V）、氯仿/異戊醇（24∶1 V/V）、異丙醇、75% 乙醇、TE緩 沖 液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）、RNase A、DNA聚合酶。

LB培養(yǎng)基（1 L）：胰蛋白胨10 g；酵母膏5 g；NaCl 5 g。

1.1.3 主要器材及儀器設(shè)備 高壓蒸汽滅菌鍋、小型粉碎機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)、小型珠磨式研磨器Mini-Bead Beater-1、2 mL 戴帽聚丙烯酰胺管、0.1 mm玻璃珠、1.5 mL 離心管、PCR儀、DYY-6C型電泳儀、Gel Doc 2000 UV凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 基因組總DNA的提取 鑒于煤層水樣和煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣獲取來(lái)源珍貴，基因組DNA的提取優(yōu)化試驗(yàn)以本實(shí)驗(yàn)室保存菌種Rhodococcussp.R04及煤粉作為試驗(yàn)材料。

1.2.2Rhodococcussp.R04基因組總DNA的提取優(yōu)化試驗(yàn)

1.2.2.1 材料預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)室中將無(wú)煙煤塊煤用小型粉碎機(jī)粉碎成粉末，獲得煤粉保存待用；Rhodococcussp.R04用5 mL LB培養(yǎng)基于30℃，200 r/min條件下培養(yǎng)12-16 h，于Rhodococcussp.R04菌液中加入適量煤粉，混勻，收集兩者的混合物于無(wú)菌的1.5 mL 離心管中，12 000 r/min離心1 min。用TPM緩沖液洗滌混合物1-2次后，用STE緩沖液洗滌混合物一次，12 000 r/min離心1 min，用STE緩沖液懸浮Rhodococcussp.R04菌體細(xì)胞與煤粉的混合物。

1.2.2.2 菌體細(xì)胞的破碎 將用STE緩沖液懸起的菌體細(xì)胞與煤粉的混合物加入帶螺旋帽的聚丙烯酰胺管中，采用機(jī)械振蕩器Mini-Bead Beater-1對(duì)收集到的菌體細(xì)胞進(jìn)行破碎。設(shè)置5組破碎條件，即2 500 r/min、30 s，2 500 r/min、60 s，2 500 r/min、90 s，4 200 r/min、30 s，4 200 r/min、60 s，進(jìn)行 5組平行試驗(yàn)以?xún)?yōu)化較佳的菌體破碎條件。細(xì)胞破碎后將帶螺旋帽管在冰上靜置數(shù)秒鐘，取上清液移至無(wú)菌的離心管中；再次用STE緩沖液充滿(mǎn)帶螺旋帽管，2 500 r/min運(yùn)行10 s，冰上靜置數(shù)秒鐘，并與第一次的上清液合并。于上清液中加入Proteinase K（終濃度為0.2 mg/mL）和SDS（終濃度為1%），充分混勻后置于55℃水浴鍋內(nèi)孵育1-2 h，繼續(xù)對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行裂解消化。

1.2.2.3 總基因組DNA的抽提、純化及沉淀 向裂解后的液體中加入等體積的酚/氯仿/異戊醇混合液，充分混勻后，12 000 r/min離心15 min，取上清液至新的無(wú)菌離心管中；加入等體積的氯仿/異戊醇混合液進(jìn)行抽提，充分混勻后，12 000 r/min離心10 min以除去酚類(lèi)物質(zhì)和脂類(lèi)物質(zhì)，取上清液至新的無(wú)菌離心管中；向收集的上清液中加入2倍體積的異丙醇，上下顛倒混勻，-20℃沉淀30 min后，12 000 r/min離心10 min，棄上清；用預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀DNA兩次，12 000 r/min離心10 min，然后置于37℃金屬浴上充分干燥；待DNA沉淀干燥后，向離心管中加入100 μL的TE緩沖液溶解DNA，DNA溶解后加RNase A以消除RNA的污染。

1.2.2.4 基因組總DNA的質(zhì)量驗(yàn)證 取5 μL DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度為0.7%），以檢測(cè)提取基因組DNA的大小及完整性。

1.2.3 煤地質(zhì)環(huán)境樣品基因組DNA的提取

1.2.3.1 改良DNA抽提方法 取煤層水樣和煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣各5 mL于冰上靜置，待大顆粒物質(zhì)自然沉降后，取上層懸浮液于1.5 mL滅菌的離心管中，12 000 r/min離心1 min，收集菌體細(xì)胞。TPM緩沖液與STE緩沖液洗滌菌體、細(xì)胞的破碎、基因組DNA的抽提純化、DNA質(zhì)量的驗(yàn)證參考1.2.2.3。其中，機(jī)械振蕩器Mini-Bead Beater-1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎時(shí)采用1.4.1最終優(yōu)化的條件。

取大塊無(wú)煙煤，用小型粉碎機(jī)粉碎后，取1 g煤粉樣品于滅菌的離心管中，依次加入TPM緩沖液與STE緩沖液進(jìn)行樣品的洗滌后，用STE緩沖液重懸樣品，樣品中微生物細(xì)胞的破碎、基因組DNA的抽提純化、DNA質(zhì)量的驗(yàn)證參考1.2.2.3。其中，機(jī)械振蕩器Mini-Bead Beater-1對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行破碎時(shí)采用1.4.1最終優(yōu)化的條件，提取的樣品基因組DNA溶于15 μL的TE緩沖液中。

1.2.3.2 試劑盒法基因組DNA的提取 煤層水樣（5mL）采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit（D5625-01）進(jìn)行基因組DNA的提取，提取過(guò)程參照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，離心收集煤層水樣中的微生物細(xì)胞于裝有Glass beads的1.5 mL離心管中，加入Buffer SLX Mlus高速渦旋振蕩后，加入Buffer DS于70℃水浴中孵育10 min，95℃孵育2 min，6 000 r/min離心3 min，棄沉淀，加入Buffer SP2渦旋混勻，冰浴5 min后離心取上清，加入0.7倍體積的異丙醇，14 680 r/min離心10 min，加入Elution Buffer溶解DNA，加入HTR Reagent渦旋10 s，室溫孵育2 min后離心取上清，加入等體積的XP2 Buffer渦旋混勻后，將混合液轉(zhuǎn)移到套有收集管的Hibind DNA結(jié)合柱中，離心棄濾液，依次用XP2 Buffer及SPW Wash Buffer洗滌DNA沉淀后，用預(yù)熱的Elution Buffer洗脫DNA。最后，取5 μL DNA用0.7%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4 16S rDNA片段的擴(kuò)增

1.2.4.1 細(xì)菌16S rDNA片段的擴(kuò)增 以提取的煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣及無(wú)煙煤樣基因組DNA分別為模板，用通用引物27F、518R（表1）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的V1-V3區(qū)。反應(yīng)體系（50μL）：10×EasyTaqBuffer 5 μL ；dNTPs（2.5 mmol/L）4 μL ；上下游引物（10 μmol/L）各 2 μL ；EasyTaqDNA polymerase 1 μL；DNA模板0.5 μL；最后用無(wú)菌的雙蒸水補(bǔ)至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；35 個(gè)循環(huán)：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4.2 古菌16S rDNA片段的擴(kuò)增 以提取的煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣及無(wú)煙煤樣基因組DNA分別為模板，用通用引物344F、0691R（表1）擴(kuò)增古菌16S rDNA基因的V3-V4區(qū)。PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序同1.2.4.1。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.5 功能基因mcrA片段的擴(kuò)增 以提取的煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣及無(wú)煙煤樣基因組DNA分別為模板，采用特異性引物mcrA-F、mcrA-R（表1）進(jìn)行功能基因片段的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系同1.4.3.1。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán) ：95℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 45 s；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 PCR擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 不同破碎條件下Rhodococcus sp.R04基因組總DNA的提取

以Rhodococcussp.R04和煤粉為試驗(yàn)材料進(jìn)行基因組總DNA提取，對(duì)細(xì)胞破碎條件進(jìn)行了優(yōu)化，不同優(yōu)化條件下基因組總DNA的提取結(jié)果，如圖1所示。由圖1可以看出，在5種破碎力度條件下，均能得到Rhodococcussp. R04的基因組。鑒于破碎強(qiáng)度的不同，提取的基因組DNA都有不同程度的降解及剪切現(xiàn)象。但當(dāng)破碎強(qiáng)度為2 500 r/min 30 s時(shí)，提取基因組DNA的主帶分子量更大，接近23 kb，表明提取的基因組DNA片段更完整，明顯優(yōu)于其他破碎條件下DNA的提取質(zhì)量。煤地質(zhì)環(huán)境樣品包含有大量的有機(jī)質(zhì)雜質(zhì)，易使微生物細(xì)胞吸附在其表面，在進(jìn)行細(xì)胞破碎時(shí)，微生物很難與吸附介質(zhì)分開(kāi)，阻止了細(xì)胞內(nèi)總DNA的釋放，使得基因組總DNA的提取具有一定的難度。采用Rhodococcussp.R04和煤粉的混合物進(jìn)行基因組DNA提取的優(yōu)化試驗(yàn)，是由于兩者的混合物可以較好地模擬煤地質(zhì)環(huán)境樣品，且Rhodococcussp.R04作為一種革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體細(xì)胞壁較厚，其在細(xì)胞壁破碎難度上與煤地質(zhì)環(huán)境微生物存在有一定共性，且為實(shí)驗(yàn)室保有菌種，容易獲得。而煤層水樣和煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣來(lái)源較珍貴，且樣品量少。因此，在進(jìn)行基因組總DNA提取方案的優(yōu)化試驗(yàn)中選用Rhodococcussp.R04及煤粉作為代替樣品進(jìn)行。綜上所述，我們采用2 500 r/min 30 s的機(jī)械破碎條件對(duì)煤層水樣及煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣中的微生物進(jìn)行細(xì)胞破碎。

2.2 煤地質(zhì)環(huán)境微生物基因組總DNA的提取

2.2.1 改良DNA抽提方法 采用改良后的DNA抽提方法進(jìn)行煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣及無(wú)煙煤樣中基因組DNA的提取，菌體細(xì)胞的破碎條件均為2 500 r/min，30 s。DNA提取結(jié)果如圖2所示，在瓊脂糖電泳圖譜上，基因組DNA均有微微拖帶現(xiàn)象，但所有樣品的DNA又有明顯的主帶，表明提取的基因組DNA既有完整的片段，又存在降解現(xiàn)象。其中完整的DNA約占總DNA含量的50%，分子量大小接近23 kb，并且提取量大?？梢钥闯觯诖似扑闂l件下，煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣及無(wú)煙煤樣均能得到較完整的基因組DNA，可用于諸如DNA文庫(kù)構(gòu)建和宏基因組測(cè)序等，且DNA提取重復(fù)性較好，表明改良后的DNA抽提方法在DNA提取上具有較好的穩(wěn)定性。

圖1 不同破碎條件下提取的Rhodococcus sp.R04基因組DNA

圖2 改良法提取煤地質(zhì)環(huán)境樣品基因組DNA

2.2.2 試劑盒法 煤層水樣采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit進(jìn)行基因組DNA的提取，提取結(jié)果如圖3所示。提取的2份煤層水樣基因組DNA都有不同程度的降解，DNA主帶不明顯，片段化嚴(yán)重，瓊脂糖凝膠電泳圖譜表現(xiàn)為嚴(yán)重的拖帶現(xiàn)象（圖3），DNA提取量低，約為改良法的1/10-1/5倍。DNA降解嚴(yán)重，這可能是因?yàn)樵谠噭┖刑崛∵^(guò)程中采用高溫（70℃、95℃）條件對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行裂解，從而導(dǎo)致DNA提取效率較低。相較于改良DNA抽提法提取的煤層水樣及煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣基因組DNA，試劑盒法提取的基因組DNA質(zhì)量明顯低于改良法，不能用于諸如DNA文庫(kù)構(gòu)建和宏基因組測(cè)序等。

圖3 試劑盒法提取煤層水樣基因組DNA

2.3 16S rDNA片段的擴(kuò)增

2.3.1 細(xì)菌16S rDNA片段的擴(kuò)增 以提取的煤層水樣、厭氧富集培養(yǎng)樣及無(wú)煙煤樣的基因組DNA分別為模板進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA V1-V3區(qū)片段的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖4所示。改良法與試劑盒法提取的煤地質(zhì)環(huán)境基因組DNA均能作為模板擴(kuò)增出細(xì)菌16S rDNA V1-V3區(qū)片段，擴(kuò)增的目的片段均清晰明亮。但很明顯，試劑盒法提取的煤層水樣基因組DNA（圖3泳道2）為模板擴(kuò)增的目的條帶的亮度比其他條帶弱（圖4泳道5），進(jìn)一步表明了試劑盒法所提取的DNA質(zhì)量差。

圖4 細(xì)菌16S rDNA V1-V3區(qū)片段的擴(kuò)增

2.3.2 古菌16S rDNA片段的擴(kuò)增 以提取的煤層水樣、厭氧富集培養(yǎng)樣及無(wú)煙煤樣的基因組DNA分別為模板進(jìn)行古菌16S rDNA V3-V4區(qū)片段的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖5所示。改良法與試劑盒法提取的煤地質(zhì)環(huán)境基因組DNA均能作為模板擴(kuò)增出古菌16S rDNA V3-V4區(qū)片段，且PCR反應(yīng)特異性好，擴(kuò)增的目的片段均清晰單一。同2.3.1結(jié)果，試劑盒法提取的煤層水樣基因組DNA（圖3泳道2）為模板擴(kuò)增的目的條帶的亮度比其他條帶弱（圖5泳道5），證明了模板DNA的質(zhì)量差。

圖5 古菌16S rDNA V3-V4區(qū)片段的擴(kuò)增

2.4 功能基因mcrA片段的擴(kuò)增

以提取的煤層水樣、厭氧富集培養(yǎng)樣及無(wú)煙煤樣的基因組DNA分別為模板進(jìn)行古菌功能基因mcrA片段的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖6所示。改良法與試劑盒法提取的煤地質(zhì)環(huán)境基因組DNA均能作為模板擴(kuò)增出古菌的mcrA片段，PCR反應(yīng)特異性好，擴(kuò)增的目的片段均清晰單一。

圖6 古菌功能基因mcrA片段的擴(kuò)增

3 討論

基因組DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，保證基因組DNA的完整性是分子生物研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)在建立基因組DNA提取的改良法中，于菌體細(xì)胞破碎步驟之前，加了煤地質(zhì)環(huán)境樣品預(yù)處理過(guò)程。因?yàn)槊旱刭|(zhì)環(huán)境組成較復(fù)雜，除含有煤顆粒外，還含有各種煤降解中間代謝有機(jī)物、無(wú)機(jī)物及各種離子等，它們的存在會(huì)極大地影響DNA提取效率及質(zhì)量，對(duì)后續(xù)的酶促反應(yīng)產(chǎn)生一定影響。應(yīng)用TPM緩沖液和STE緩沖液對(duì)煤地質(zhì)環(huán)境樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以很好地去除部分雜質(zhì)，減少部分可溶性PCR抑制劑的污染，特別是減少酚類(lèi)物質(zhì)、腐植酸的污染。TPM緩沖液中含有PVP（聚乙烯吡咯烷酮），它是一種合成水溶性高分子化合物，可以從水提物中吸收酚類(lèi)物質(zhì)［20］，易和酚類(lèi)物質(zhì)形成復(fù)雜的氫鍵，隨菌體細(xì)胞外雜質(zhì)共沉淀離心下來(lái)，從而減少酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)提取基因組DNA的污染。此外，PVP還可以有效地結(jié)合去除部分腐植酸類(lèi)物質(zhì)［21］，減少腐植酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)提取DNA的污染。STE緩沖液中含有EDTA，它可以絡(luò)合金屬離子，有效抑制核酸酶的活性，防止DNA在提取過(guò)程中造成降解［22］。

在菌體破碎步驟，采用了機(jī)械振蕩法，及結(jié)合化學(xué)裂解法和酶裂解法進(jìn)行細(xì)胞破碎，通過(guò)對(duì)機(jī)械破碎條件進(jìn)行優(yōu)化，使得菌體細(xì)胞既裂解充分，利于基因組DNA的釋放，又保證了大量DNA片段的完整性。

改良法提取的煤地質(zhì)環(huán)境微生物基因組DNA片段完整性較好，而試劑盒法提取的煤地質(zhì)環(huán)境微生物基因組DNA降解及剪切現(xiàn)象嚴(yán)重，DNA片段化明顯。應(yīng)用細(xì)菌及古菌的特異引物對(duì)改良法和試劑盒法提取的基因組DNA同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能獲得目的片段，表明兩種方法都能從煤地質(zhì)環(huán)境中有效提取細(xì)菌和古菌的基因組DNA，并有效地去除部分抑制劑，不影響PCR擴(kuò)增。試劑盒法提取基因組DNA雖然方便快捷，但價(jià)格昂貴，DNA提取量低，且在高溫條件下（70℃、95℃）提取的煤層水樣中的微生物基因組DNA片段不完整，剪切現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致遺傳信息的缺失，不適用于諸如DNA文庫(kù)構(gòu)建和宏基因組測(cè)序等分析的進(jìn)行。改良法雖然比試劑盒法提取DNA煩瑣一些，但對(duì)于腐植酸等含量較低的煤層水樣、煤層氣厭氧富集培養(yǎng)樣及無(wú)煙煤樣均能夠獲得質(zhì)量較高的基因組DNA片段，且DNA提取量高，可用于煤地質(zhì)環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)及生物成氣機(jī)理研究。此外，改良法所用試劑普通，價(jià)格便宜，適于大批量樣品的實(shí)驗(yàn)室和科學(xué)研究。

4 結(jié)論

通過(guò)改進(jìn)傳統(tǒng)DNA提取方法（酚-氯仿法），并以Rhodococcussp.R04及煤粉為試驗(yàn)材料進(jìn)行細(xì)胞破碎條件的優(yōu)化，建立了一種可用于煤地質(zhì)環(huán)境微生物基因組DNA的高效提取方法，即改良法。改良法提取的DNA片段比試劑盒法更加完整，且可以作為模板進(jìn)行多種特異性PCR擴(kuò)增，表現(xiàn)出了較高的可靠性。