數(shù)字PCR在功能核酸精準(zhǔn)檢測中的研究進(jìn)展

劉曉 朱鵬宇 王垚 朱水芳 付偉

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)并合成了一類具有一定的特殊功能的核酸分子，包含但不限于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的外源插入片段、微生物中的致病基因、核酸適配體（Aptamer）及脫氧核酶（DNAzyme）等，人們把這一類對(duì)生物體或體外檢測反應(yīng)具有特殊功能的核酸分子叫做功能核酸［1-3］。功能核酸的出現(xiàn)開拓了人們的視野也加深了理解，普遍意識(shí)到核酸除了作為遺傳信息的載體和運(yùn)轉(zhuǎn)載體以外還可以廣泛應(yīng)用：轉(zhuǎn)化事件插入產(chǎn)生新型性狀表達(dá)，微生物入侵寄主后致病基因的增殖與表達(dá)，核酸適配體與脫氧核酶的出現(xiàn)為非核酸物質(zhì)檢測的發(fā)展提供廣闊空間［4-6］，同時(shí)還有醫(yī)療診斷［7-8］等領(lǐng)域。功能核酸的開發(fā)對(duì)人類認(rèn)知疾病類型以及開發(fā)新型診斷技術(shù)有著重大價(jià)值與意義。

PCR是一種體外酶促擴(kuò)增特異性DNA的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。從1985年美國科學(xué)家 Kary Mullis開發(fā)了第一代以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行定性分析的實(shí)驗(yàn)方法后［9］，PCR方法被不斷改進(jìn)：由定性的分析方法發(fā)展到定量測定，從原先只能擴(kuò)增幾個(gè)kb的基因到已能擴(kuò)增幾十個(gè)kb的DNA片段。到目前為止，PCR技術(shù)已有十幾種之多。在這種背景下，第三代基于分割體系的絕對(duì)定量PCR應(yīng)運(yùn)而生，其中通過有限稀釋法和根據(jù)泊松分布統(tǒng)計(jì)原理來準(zhǔn)確計(jì)算DNA濃度的方法，稱為數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）。1992年dPCR初具雛形，Sykes等［10］使用有限稀釋、PCR和泊松分布的方法在非淋巴細(xì)胞和正常體細(xì)胞的背景下檢測到了低豐度lgH重鏈突變基因，進(jìn)行了精細(xì)的定量研究，但當(dāng)時(shí)并沒有明確指出dPCR這一個(gè)概念。直到1999年Vogelstein等［9］首次建立了dPCR基本實(shí)驗(yàn)流程和重要原則：以終點(diǎn)信號(hào)的有無作為判斷依據(jù)，正式提出了dPCR的概念。Vogelstein等通過對(duì)樣品的有限稀釋，檢測了結(jié)腸癌患者糞便樣品中KRAS基因突變的同時(shí)提出了dPCR的一種優(yōu)勢：稀釋提高了對(duì)反應(yīng)抑制劑的耐受程度。2003年，Devin等［11］又提出了BEAMing技術(shù)（珠子、乳劑、擴(kuò)增和磁力），利用包被鏈霉親和素的磁性珠子和生物素標(biāo)記的寡核苷酸形成微乳液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該技術(shù)為今后的微滴式dPCR的產(chǎn)生奠定一定的基礎(chǔ)。本文將對(duì)數(shù)字PCR技術(shù)及其在現(xiàn)階段不同領(lǐng)域中的功能核酸檢測研究現(xiàn)狀進(jìn)行歸納和綜述，并對(duì)數(shù)字PCR未來的發(fā)展前景進(jìn)行展望，旨為促進(jìn)數(shù)字PCR在功能核酸檢測領(lǐng)域進(jìn)一步的應(yīng)用。

1 數(shù)字PCR

數(shù)字PCR是一種基于單分子擴(kuò)增以及原始反應(yīng)分割的一種PCR擴(kuò)增手段。通過將原始的反應(yīng)體系進(jìn)行有限的大量分割，將參與擴(kuò)增的組分和體系中的模板分配到單個(gè)的反應(yīng)小體系中。通過PCR的擴(kuò)增，當(dāng)小的反應(yīng)體系中存在目標(biāo)分子時(shí)，會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物并釋放出熒光信號(hào)，反之，當(dāng)體系中不存在目標(biāo)分子時(shí)，該小反應(yīng)體系為陰性。后續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，需要根據(jù)所有體系中的熒光值確定陽性體系與陰性體系的數(shù)量，從而根據(jù)兩者數(shù)量的比較，計(jì)算出原始體系中所含有的目標(biāo)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)［12-13］（圖 1）。

當(dāng)原始體系中模板的含量相當(dāng)少時(shí)，理論上每一個(gè)陽性體系內(nèi)部只含有單個(gè)目標(biāo)分析，此時(shí)，最終結(jié)果的陽性亮點(diǎn)數(shù)就可以近似等于體系中的目標(biāo)分子數(shù)。但是大部分情況下，樣品中目標(biāo)分子的量不會(huì)太低，此時(shí)單個(gè)陽性體系中的目標(biāo)分子的數(shù)量可能會(huì)達(dá)到2個(gè)，甚至更多。這時(shí)就需要通過泊松分布（Poisson distribution）的原理來計(jì)算體系中的總的目標(biāo)分子的拷貝數(shù)。根據(jù)泊松分布的原理，反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)可以通過公式1計(jì)算［14］：

其中，A為反應(yīng)體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)，X為數(shù)字PCR的陽性體系數(shù)，N為總體系數(shù)。

通過公式可以看出，隨著反應(yīng)陽性體系數(shù)（X）的增加，體系中目標(biāo)分子的拷貝數(shù)相對(duì)于X會(huì)有較大的差距，隨著X的持續(xù)增加，數(shù)字PCR結(jié)果的不確定度也隨著提高，總體來說，數(shù)字PCR陽性體系的數(shù)量不得超過總體系數(shù)量的80%。另一個(gè)方面，N的增加會(huì)使整個(gè)數(shù)字PCR體系具有較大的線性范圍，并可以提高反應(yīng)的靈敏度、穩(wěn)定性以及可重復(fù)性。

在常規(guī)的定量PCR實(shí)驗(yàn)中，引物的擴(kuò)增效率會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物量以及定量結(jié)果產(chǎn)生較大的影響［15］。但是對(duì)于數(shù)字PCR來說，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析只取決于最終所有小體系的熒光信號(hào)而與引物的擴(kuò)增效率幾乎沒有關(guān)系。所以對(duì)于數(shù)字PCR來說，實(shí)驗(yàn)結(jié)果很少會(huì)受到引物設(shè)計(jì)因素的影響。

綜上所述，相對(duì)于常規(guī)的定量PCR，數(shù)字PCR具有極強(qiáng)的絕對(duì)定量能力，可以不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接對(duì)樣品進(jìn)行目標(biāo)分子的定量，并且具有很高的靈敏度、穩(wěn)定性以及可重復(fù)性?？梢院芎玫膽?yīng)用在各個(gè)領(lǐng)域的核酸分子絕對(duì)定量檢測中。

2 商業(yè)化數(shù)字PCR平臺(tái)及其特點(diǎn)

發(fā)展到現(xiàn)在，市面上常見的dPCR主要有兩種：微滴式dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式dPCR（chip dPCR，cdPCR）技術(shù)（圖1）。

cdPCR主要以Fluidigm公司的BioMark HD系統(tǒng)以及Life Technology公司的QuantStudio 3D系統(tǒng)為代表（圖2）。Bio Mark系統(tǒng)［16］采用微泵閥式芯片，以聚二甲基硅氧烷為芯片材料，主要依靠微流控通道與閥門的開閉進(jìn)行原始體系分割，在芯片的反應(yīng)倉進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后通過類似于基因芯片的方法掃描每個(gè)通孔的熒光信號(hào)，進(jìn)行目的序列含量的計(jì)算。QuantStudio 3D系統(tǒng)［17］采用陣列微池式芯片，反應(yīng)液由進(jìn)樣孔直接進(jìn)入各微反應(yīng)池。芯片式dPCR生成微滴體積均一，具有較高的穩(wěn)定性，體系之間影響較小，但技術(shù)操作復(fù)雜，通量有限且實(shí)驗(yàn)成本較高。

圖1 2011年-2017年數(shù)字PCR平臺(tái)應(yīng)用變化趨勢

圖2 芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)宏觀結(jié)構(gòu)（A）微觀結(jié)構(gòu)（B）

ddPCR主要有Bio-rad公司開發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬個(gè)微滴，Rain Drop可以分割成100萬-1 000萬個(gè)微滴［18］（圖3）。ddPCR原理是通過將一個(gè)待分析的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個(gè)油包水小微滴從而對(duì)原始體系進(jìn)行分割，樣品中的核酸分子隨機(jī)分配到大量獨(dú)立的微滴中，每個(gè)微滴中含有一個(gè)或不含待檢核酸分子。對(duì)微滴體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以后，分析每個(gè)微滴的熒光信號(hào)，進(jìn)行有或無的判斷，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理，通過讀取靶標(biāo)和內(nèi)參核酸的陽性微滴個(gè)數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡單，可以實(shí)現(xiàn)高通量的檢測，也保證一定程度上的微滴檢測穩(wěn)定性。

圖3 微滴式數(shù)字PCR原理

與常規(guī)的PCR的方法相比，ddPCR有很好的優(yōu)勢。（1）絕對(duì)定量。常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測都需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于樣品測定在各種條件上不會(huì)完全一致，會(huì)造成PCR擴(kuò)增效率的差異，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而ddPCR不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)影響，可以進(jìn)行絕對(duì)定量。（2）樣品需求量低。在檢測珍貴樣品和樣品核酸存在降解時(shí)具有明顯的優(yōu)勢。（3）高靈敏度。ddPCR本質(zhì)上是將一個(gè)傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)分成了數(shù)萬個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)，在這些反應(yīng)中可以精確地檢測到很小的目的片段的差異、單拷貝甚至是低濃度混雜樣品，且能避免非同源異質(zhì)雙鏈的形成［19］。（4）高耐受性。由于目的序列被分配到多個(gè)微滴中，顯著降低了體系間的影響以及背景序列和抑制物對(duì)反應(yīng)的干擾，擴(kuò)增基質(zhì)效應(yīng)大大減小。盡管dPCR技術(shù)具備較好前景，但由于96孔板或384孔板加樣的復(fù)雜操作為精確測量帶來了困難，且相較于實(shí)時(shí)熒光PCR來說成本較高，距廣泛應(yīng)用還有一定距離。

3 數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因外源插入片段檢測中的應(yīng)用

3.1 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測與鑒定

商業(yè)作物育種一般通過常規(guī)方法或遺傳轉(zhuǎn)化引入所需性狀，尤其是不存在于植物基因組的新特性。目前隨著市場轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的逐步釋放，我國必須有涵蓋轉(zhuǎn)基因的插入、穩(wěn)定性及性狀表達(dá)等所有方面的詳盡檔案。目前被大部分國際組織認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因定量檢測方法是基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光PCR，但dPCR作為新興、準(zhǔn)確的技術(shù)受到越來越多人的青睞?；赥aqman探針的ddPCR是在同一個(gè)孔內(nèi)同時(shí)進(jìn)行內(nèi)參基因與目的基因的擴(kuò)增，通過不同信號(hào)的陽性液滴比率對(duì)目的基因進(jìn)行定量。

基于數(shù)字PCR靈敏度和穩(wěn)定性較高的優(yōu)勢，付偉等［20］于2015年開發(fā)了一種基于數(shù)字PCR的轉(zhuǎn)基因成分定性篩查檢測體系，通過以CaMV35s啟動(dòng)子以及NOS終止子作為擴(kuò)增的目的片段，這兩個(gè)篩選元件可以涵蓋95%以上的國內(nèi)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因品系（圖4）。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)進(jìn)行了靈敏度、室內(nèi)穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)室間穩(wěn)定性、特異性及盲樣檢測的驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明，檢測體系可以精準(zhǔn)穩(wěn)定的對(duì)質(zhì)量百分比為0.1%的轉(zhuǎn)基因樣品實(shí)現(xiàn)篩查檢測，絕對(duì)檢測限可以低至單拷貝。相對(duì)于常規(guī)篩選檢測體系，具有精準(zhǔn)、穩(wěn)定、結(jié)果呈現(xiàn)形式簡單等優(yōu)點(diǎn)。相對(duì)于常規(guī)基于數(shù)字PCR的轉(zhuǎn)基因成分檢測體系，本研究消除了樣品前處理過程對(duì)檢測體系的影響，可以更快速、更準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因成分的初步篩查。

圖4 基于數(shù)字PCR的轉(zhuǎn)基因成分定性篩查檢測體系［20］

相較于傳統(tǒng)的PCR檢測技術(shù)，數(shù)字PCR具有微滴數(shù)絕對(duì)定量的能力，因此數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因成分定量分析及鑒定方面也有了巨大的研究進(jìn)展。朱鵬宇等［21］于2016年基于Fluidigm芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)，開發(fā)了一種不依賴于樣品前處理步驟的轉(zhuǎn)基因玉米成分絕對(duì)定量檢測體系（圖5），該研究前期驗(yàn)證了不同的影響因素對(duì)于體系的干擾，如SNP位點(diǎn)，樣品前處理步驟等。在體系建立完成以后，又針對(duì)8種不同的轉(zhuǎn)基因品系篩選出了最適合搭配的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的引物和探針，進(jìn)而建立了針對(duì)8種不同的轉(zhuǎn)基因品系的二重?cái)?shù)字PCR絕對(duì)定量檢測體系。該檢測可以精準(zhǔn)、快速的對(duì)未知樣品中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量檢測，操作步驟少，結(jié)果穩(wěn)定性高。

Chen等［22］采用雙通道ddPCR定量檢測方法對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻“汕優(yōu)63”的成分進(jìn)行分析，擴(kuò)增“汕優(yōu)63”的內(nèi)源基因和菌株特異性序列，準(zhǔn)確定量檢測“汕優(yōu)63”的成分。吳瀟等［23］以轉(zhuǎn)基因大豆中結(jié)構(gòu)特異性基因?yàn)榘谢颍胐dPCR對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定量，并確定檢測靈敏度高于國標(biāo)中qPCR方法。Iwobi等［24］將ddPCR應(yīng)用于選定的轉(zhuǎn)基因食品和飼料樣品，表現(xiàn)出了ddPCR方法的良好性能。

除了常規(guī)數(shù)字PCR轉(zhuǎn)基因成分檢測體系之外，有更強(qiáng)適用性的新型數(shù)字PCR的檢測技術(shù)也得到了學(xué)者們的關(guān)注。牛晨啟等［25］于2018年通過結(jié)合通用引物技術(shù)與數(shù)字PCR技術(shù)，開發(fā)了一種單通用引物多重?cái)?shù)字PCR（Single universal primer-multiplexddPCR，SUP-M-ddPCR）轉(zhuǎn)基因檢測方法（圖6）。研究中，反應(yīng)體系添加了兩種熒光探針，用來識(shí)別轉(zhuǎn)基因序列的熒光探針（紅色）和用來識(shí)別玉米內(nèi)參序列的熒光探針（黃色）。體系中還同時(shí)有通用引物和5對(duì)修飾特異引物，即每一對(duì)特異引物的5′末端修飾一段相同的通用序列，來擴(kuò)增P-35S、T-NOS、NPTII、PAT四種轉(zhuǎn)基因篩選元件和玉米內(nèi)參adh1基因。這個(gè)混合體系被分散在數(shù)字PCR的20 000個(gè)微滴中獨(dú)立發(fā)生反應(yīng)，在PCR過程前10個(gè)循環(huán)的第一階段，反應(yīng)體系中同時(shí)存在修飾特異引物和通用引物，修飾特異引物發(fā)揮作用，擴(kuò)增出兩端有通用引物的目標(biāo)序列，第二階段通用引物發(fā)揮巨大的作用，保證各個(gè)目標(biāo)序列有統(tǒng)一的擴(kuò)增效率。通用引物可以有效地減少多對(duì)引物之間的干擾。最后通過熒光信號(hào)的讀取來對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測和定量。該方法的優(yōu)點(diǎn)是高通量，其中選取的4種轉(zhuǎn)基因序列，覆蓋了超過93%的目前已批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因品系，可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣品進(jìn)行初步篩查。

圖5 基于Fluidigm芯片式數(shù)字PCR平臺(tái)的轉(zhuǎn)基因成分絕對(duì)定量檢測體系［21］

3.2 轉(zhuǎn)基因外源插入片段拷貝數(shù)鑒定

dPCR具有高精確度的特點(diǎn)，使用dPCR定量目標(biāo)基因與參考基因的雙重反應(yīng)并計(jì)算它們的比值，得到目標(biāo)基因拷貝數(shù)，在不同實(shí)驗(yàn)室質(zhì)檢具有很高的重復(fù)性，使其成為測量拷貝數(shù)的首選方法［26-28］。

dPCR可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基因組拷貝數(shù)的準(zhǔn)確測定。甘蔗是一種基因組較大且染色體具有高度多倍性和非整倍性的栽培種植物［29-30］，沒有已經(jīng)準(zhǔn)確測得拷貝數(shù)的基因，使用常規(guī)PCR很難檢測。Yue等［31］通過ddPCR比較3種不同甘蔗品種中內(nèi)源基因的絕對(duì)量，評(píng)估3種基因?qū)截悢?shù)分析的適用性，推導(dǎo)出ATC基因可以成為未來基因拷貝數(shù)變異和Q208A和Q240A功能基因劑量研究的合適內(nèi)源參考基因，并評(píng)估了ddPCR在高通量轉(zhuǎn)基因測定中的應(yīng)用（圖7）。種質(zhì)Bru1基因的拷貝數(shù)變異能夠使甘蔗產(chǎn)生真菌病害甘蔗褐銹病的抗性，McCor［32］利用篩選的抗性甘蔗進(jìn)行ddPCR拷貝數(shù)分析，說明ddPCR有望用于估計(jì)作物等位基因劑量，為育種等進(jìn)一步研究提供有效信息。

2015 年，F(xiàn)élixurquídez等［33］基于雙熒光通道數(shù)字PCR技術(shù)開發(fā)了一種鑒定轉(zhuǎn)基因玉米中外源基因拷貝數(shù)的鑒定方法（圖8），該方法以外源NOS終止子與玉米內(nèi)源hmg基因?yàn)榘袠?biāo)序列，通過反應(yīng)退火溫度等反應(yīng)條件的優(yōu)化，可以對(duì)質(zhì)量百分比在0.08%以上的轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行穩(wěn)定的拷貝數(shù)定量。

圖6 單通用引物多重?cái)?shù)字PCR轉(zhuǎn)基因檢測方法［25］

圖7 抗性甘蔗中數(shù)字PCR等位基因分析結(jié)果圖［31］

3.3 基因編輯

基因編輯通過序列特異性核酸酶誘導(dǎo)DNA產(chǎn)生切口或雙鏈斷裂，依賴于同源定向修復(fù)（Homology directed repair，HDR）或非同源末端連接（Nonhomologous end joining，NHEJ）實(shí)現(xiàn)定向修復(fù)［34-36］。ddPCR可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜背景的分區(qū)，通過有限稀釋，使得低豐度的目的序列能夠被靈敏的檢出，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)含量較低的基因編輯事件的檢測（圖9）。數(shù)字PCR檢測基因編輯的方法主要是將TaqMan PCR測定與ddPCR相結(jié)合，在靶標(biāo)基因同一個(gè)擴(kuò)增子內(nèi)設(shè)計(jì)了一個(gè)通用引物對(duì)和編輯位點(diǎn)特異性TaqMan探針，與不同的熒光基團(tuán)結(jié)合，據(jù)雙重?zé)晒庑盘?hào)判斷編輯情況，區(qū)分野生型和誘變型DNA序列從而篩選誘變事件。

CRISPR-Cas9技術(shù)通常在修復(fù)編輯位點(diǎn)中存在有兩種不同的修復(fù)機(jī)制HDR和NHEJ，其中前者相對(duì)于后者可以產(chǎn)生更加精準(zhǔn)的基因片段修復(fù)結(jié)果。由于這兩種修復(fù)方式幾乎是存在于相同的編輯片段中的，因此目前常見基因編輯檢測技術(shù)是無法對(duì)這兩種修復(fù)方式的結(jié)果進(jìn)行同時(shí)鑒定的。為了克服常用檢測技術(shù)的缺陷，Yuichiro等［37］開發(fā)了一種可以系統(tǒng)、快速的鑒定HDR與NHEJ修復(fù)位點(diǎn)的數(shù)字PCR檢測體系（圖10）。這個(gè)研究中，Yuichiro以經(jīng)過CRISPR-Cas9技術(shù)處理過的海拉細(xì)胞系（HeLa cells）為研究對(duì)象，通過在基因編輯片段中的NHEJ位點(diǎn)、HDR位點(diǎn)以及內(nèi)源親本位點(diǎn)為靶標(biāo)序列設(shè)計(jì)探針，實(shí)現(xiàn)了通過一對(duì)引物的擴(kuò)增就可以實(shí)現(xiàn)基因編輯位點(diǎn)檢測以及NHEJ與HDR分型的目的。該研究可以穩(wěn)定實(shí)現(xiàn)對(duì)1 000個(gè)野生型基因組中的單拷貝NHEJ/HDR位點(diǎn)的基因分型研究。

圖8 雙熒光通道數(shù)字PCR檢測方法［33］

Findlay等［38］通過在原始序列Cas9酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)探針并采用ddPCR檢測敲除誘導(dǎo)干細(xì)胞相關(guān)蛋白編碼基因的改變，得到了敏感且特異的篩選基因編輯的方法，并通過ddPCR的陽性熒光信號(hào)比對(duì)實(shí)現(xiàn)了不同TALEN策略的效率評(píng)估。Mock等［39］以敲除了CCR5基因的人細(xì)胞為例，采用新一代測序（New generation sequencing，NGS）取得TALEN誘導(dǎo)的NHEJ的靶標(biāo)序列，并針對(duì)這段被剪切過的序列設(shè)計(jì)NHEJ敏感的探針，使得產(chǎn)生NHEJ的靶標(biāo)序列不產(chǎn)生熒光信號(hào)。由核酸酶介導(dǎo)的基因編輯（GEF-dPCR）利用兩個(gè)不同標(biāo)記的探針放置在基因編輯目標(biāo)位點(diǎn)的一個(gè)擴(kuò)增子內(nèi)，以同時(shí)檢測野生型和非同源末端連接影響的等位基因，通過dPCR結(jié)果來評(píng)估GEF-dPCR頻率，并利用這種新設(shè)計(jì)的GEF-dPCR來測量CCR5基因中的TALEN介導(dǎo)的基因敲除，以及CCR2中預(yù)期的脫靶位點(diǎn)，以一個(gè)比較好的靈敏度和較大的線性范圍對(duì)基因編輯進(jìn)行量化。Miyaoka等［40］使用野生型和突變體等位基因的質(zhì)粒模板混合物對(duì)數(shù)百個(gè)親本細(xì)胞中含有單個(gè)點(diǎn)突變的細(xì)胞進(jìn)行了檢測，并發(fā)現(xiàn)ddPCR在野生型背景中的適應(yīng)性可以在檢測到0.1%的突變等位基因，靈敏度比單獨(dú)TaqMan PCR高100倍。ddPCR在HEK293T細(xì)胞中使用PHOX2B和PKP2靶向的TALEN強(qiáng)力檢測到TALEN誘導(dǎo)的點(diǎn)突變，并且比Surveyor測定更敏感。

圖9 探針檢測方法［36］

總體來說，目前ddPCR檢測基因編輯技術(shù)大多采用已知原始序列與模板序列設(shè)計(jì)HDR與NHEJ敏感的探針的方法，再經(jīng)過背景不斷稀釋，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因編輯產(chǎn)物有無以及編輯效率的判定。

圖10 數(shù)字PCR法NHEJ/HDR位點(diǎn)基因分型實(shí)驗(yàn)原理（A）及實(shí)驗(yàn)結(jié)果（B）［37］

4 數(shù)字PCR在診斷學(xué)功能核酸檢測鑒定中的應(yīng)用

dPCR具有高靈敏度和精確性的優(yōu)勢，除了痕量核酸分子檢測、稀有突變等方向，在目前低豐度，背景來源復(fù)雜的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里也有很廣泛的應(yīng)用。它可以提供研究人員探索復(fù)雜的遺傳背景的可能性，發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證新的疾病關(guān)聯(lián)，開辟分子診斷新的方向。

4.1 痕量核酸樣品的檢測與鑒定

臨床腫瘤診斷主要以篩查患者外周血中特異突變的分子標(biāo)志物為手段，其重點(diǎn)是血液中游離的腫瘤DNA的液體活檢［41］。由于其具有背景復(fù)雜且高度片段化的特點(diǎn)，就要求采用靈敏度高、克服背景序列的檢測方法。目前已有很多文獻(xiàn)報(bào)道dPCR成功運(yùn)用在各種癌基因的檢測中，趙釗等［42］通過數(shù)字PCR檢測非小細(xì)胞肺癌組織中的表皮生長因子受體EGFR基因T790M突變的差異。Feng等［43］也檢測了79個(gè)腫瘤組織和配對(duì)血漿樣本的血漿EGFR狀態(tài)，并與Super ARMS的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證兩者結(jié)論具有一致性。Sedlak等［44］利用ddPCR對(duì)以染色體重組方式存在的人類皰疹病毒6型的人體血漿樣本進(jìn)行檢測，靈敏度高達(dá)100%。

Beck等［45］證明抑制物DNA增加的量與移植排斥反應(yīng)有關(guān)，同時(shí)推測了通過dPCR量化腫瘤衍生的細(xì)胞游離DNA（cfDNA）可能提供檢測治療功效的結(jié)果。應(yīng)用定量分子測量對(duì)移植管理和監(jiān)測病毒載量治療實(shí)體瘤對(duì)提供全新的變化。布魯菌病常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷方法為菌株分離培養(yǎng)，但受環(huán)境影響大。郭瑛等［46］首次采用dPCR的方法對(duì)其進(jìn)行探索性的技術(shù)檢測，綜合分析布魯菌恢復(fù)期病例及dPCR檢測血清布魯菌DNA含量，評(píng)估dPCR取代血培養(yǎng)是有前景的但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。Deborah等［47］利用ddPCR對(duì)攜艾滋病嬰兒血液HIV核酸水平進(jìn)行持續(xù)性檢測，最終證實(shí)全球首例功能性治愈的艾滋病患兒?？梢钥闯龊芏噌t(yī)學(xué)工作者逐步嘗試用dPCR的方法替代原有檢測方法實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確高效的診斷，目前商品化的ddPCR已被大量應(yīng)用于腸病毒，巨細(xì)胞病毒，結(jié)核桿菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等臨床領(lǐng)域［48-50］。

4.2 拷貝數(shù)變異的檢測與鑒定

數(shù)字PCR可以絕對(duì)定量的特點(diǎn)，使其在鑒定拷貝數(shù)變異方面相較于常規(guī)的PCR技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，現(xiàn)階段，數(shù)字PCR已經(jīng)在腫瘤相關(guān)基因拷貝數(shù)變異鑒定方面取得了廣泛的應(yīng)用。

CNV通常是指DNA部分（包括基因）的重復(fù)與缺失，Benjamin等［51］首次應(yīng)用ddPCR在高通量樣品條件下對(duì)二代測序技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，此后隨著與NGS等方法的聯(lián)用來進(jìn)行CNV位點(diǎn)的驗(yàn)證越來越得到認(rèn)可。目前研究表明劑量的變化會(huì)影響基因的表達(dá)［52］與表型［53-54］。隨著拷貝數(shù)的增加，量化劑量效應(yīng)變得具有挑戰(zhàn)性，更具準(zhǔn)確性的dPCR被采用。Maria等［55］研究唾液淀粉酶基因的高度多態(tài)拷貝數(shù)變異體，他們利用ddPCR加轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法分析用于檢測潛在的基因劑量效應(yīng)（圖11）。發(fā)現(xiàn)AMY1拷貝數(shù)與淀粉酶的量呈顯著正相關(guān)，對(duì)降低肥胖風(fēng)險(xiǎn)有顯著影響［56］。也說明了其他形式的DNA變異包括拷貝數(shù)變異可能解釋遺傳性的缺失。

Miotke等［57］開發(fā)了一種單色熒光dPCR的方法，使用非特異性雙鏈結(jié)合染料EvaGreen（EG），通過操縱目標(biāo)和參照擴(kuò)增子的長度實(shí)現(xiàn)區(qū)分它們的熒光信號(hào)并獨(dú)立量化（圖12）。Miotke等通過檢查原癌基因FLT3中的拷貝數(shù)和BRAF中常見的V600Epoint突變來證明這種方法的有效性。擴(kuò)增子的長度改變導(dǎo)致雙鏈DNA存在的堿基對(duì)改變。由于EG染料的熒光幅度與dsDNA存在量成正比，具有較長擴(kuò)增子的微滴比具有較短擴(kuò)增子的微滴熒光更明亮。這種檢測方法可以減小投入，提供了商業(yè)推廣的可能性。

除了這些比較常見的方法，還有學(xué)者開發(fā)了具有針對(duì)性的測定方法。Taly等［58］開發(fā)了一種不同濃度的相同熒光基團(tuán)反應(yīng)測定7種突變的多重方法（圖13），結(jié)合ddPCR可以實(shí)現(xiàn)簡單的格式來篩選多個(gè)基因座的可能性?？梢酝ㄟ^改變TaqMan探針的濃度和性質(zhì)來調(diào)節(jié)終點(diǎn)熒光強(qiáng)度，這使得可以識(shí)別和計(jì)數(shù)含有每個(gè)獨(dú)特可擴(kuò)增靶標(biāo)的液滴。

5 數(shù)字PCR在微生物檢測方向的應(yīng)用

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的估計(jì)，全世界每年的食源性疾病患者大部分都是由致病微生物引起的，從原材料加工到流通貯藏各個(gè)環(huán)節(jié)都有可能感染，相比于常規(guī)的微生物檢測需要繁復(fù)的增菌、分離和生物學(xué)鑒定，PCR技術(shù)更加快速靈敏且特異性強(qiáng)。ddPCR定量檢測食源性微生物是目前發(fā)展的一個(gè)方向。張永江等［59］根據(jù)馬鈴薯S病毒的外殼蛋白基因保守序列設(shè)計(jì)引物探針；陳嘉茵等［60］采用逆轉(zhuǎn)錄微滴式數(shù)字PCR可以靈敏地檢測出受污染食品中低病毒含量。Rothrock等［61］用ddPCR對(duì)商業(yè)家禽處理水樣進(jìn)行沙門氏菌檢測；Bian等［62］對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果表明方法最低檢測下限為10 CFU/mL。ddPCR方法在實(shí)際應(yīng)用中有很好的特異性與靈敏度，在食源性微生物中有很大發(fā)展空間。qPCR在炭疽桿菌質(zhì)粒拷貝數(shù)檢測中差異很大［63-64］。Straub等［65］采用 ddPCR 對(duì)炭疽桿菌質(zhì)粒pXO1和pXO2進(jìn)行了拷貝數(shù)測定。將qPCR與ddPCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)dPCR結(jié)果更接近于直接測序數(shù)據(jù)。

ddPCR還可以實(shí)現(xiàn)自然界中多個(gè)細(xì)菌多個(gè)基因的鑒定與分類。Ottesen等［66］用編碼參與白蟻和腸道菌群共生的關(guān)鍵酶基因作為實(shí)驗(yàn)鉤，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)未知核糖體RNA并鑒定了復(fù)雜環(huán)境中攜帶目的基因片段的菌群，Hua等［67］利用ddPCR分析土壤中黃曲霉毒素和無毒黃曲霉菌混合物的群體比率，由于黃曲霉無毒素菌株與產(chǎn)黃曲霉菌菌株具有競爭關(guān)系，可用于后續(xù)生物防治。

6 數(shù)字PCR在非核酸靶標(biāo)物質(zhì)中的檢測中的應(yīng)用

圖11 數(shù)字PCR檢測拷貝數(shù)［55］

圖12 單色熒光數(shù)字PCR檢測方法［57］

圖13 單色熒光多重檢測方法［58］

生物傳感器是一類可以實(shí)現(xiàn)不同種類信號(hào)之間轉(zhuǎn)化的裝置，其中核酸傳感器是一類可以將非核酸信號(hào)轉(zhuǎn)化為核酸信號(hào)的核酸分子。常見的核酸傳感器包括重金屬核酶傳感器、核酸適配體生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器等。以重金屬核酸傳感器為例，傳統(tǒng)的重金屬檢測技術(shù)通常是基于ICP-MS等大型儀器的，隨著便攜性更強(qiáng)的重金屬傳感器的開發(fā)，針對(duì)不同重金屬離子的核酸檢測技術(shù)已經(jīng)越來越得到學(xué)者們的關(guān)注。

許文濤團(tuán)隊(duì)［68-69］結(jié)合數(shù)字PCR技術(shù)與重金屬傳感器，開發(fā)了針對(duì)銅離子的開型（Turn-on）生物傳感器檢測技術(shù)以及汞離子的閉型（Turn-off）生物傳感器檢測體系。該研究以銅離子（Cu2+）和汞離子（Hg2+）為研究對(duì)象，通過體系優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了生物傳感器步驟從重金屬離子信號(hào)到核酸信號(hào)最為高效的轉(zhuǎn)化（圖14）。后續(xù)通過對(duì)核酸信號(hào)進(jìn)行數(shù)字PCR的絕對(duì)定量鑒定以及信號(hào)轉(zhuǎn)化率計(jì)算，實(shí)現(xiàn)了對(duì)兩種重金屬離子的絕對(duì)定量。對(duì)于兩種重金屬離子，本檢測體系的定量檢測限可以達(dá)到500 fmol和40 fmol，定性檢測限達(dá)到50 fmol與10 fmol，線性范圍均超過3個(gè)數(shù)量級(jí)。該檢測體系的檢測限以及線性范圍表明該檢測體系可以滿足絕大多數(shù)樣品中兩種重金屬離子的檢測需要。

另一方面，為滿足汞離子和銀離子的邏輯門檢測方法的需要，程楠等［70］首次通過數(shù)字PCR產(chǎn)生的數(shù)字信號(hào)建立了一系列的絕對(duì)定量邏輯門檢測監(jiān)測體系（圖15）。由于汞離子和銀離子特殊的生物化學(xué)性質(zhì)，依賴T-Hg-T和C-Ag-C的錯(cuò)配堿基配對(duì)，實(shí)現(xiàn)了重金屬信號(hào)向核酸信號(hào)的轉(zhuǎn)化。通過進(jìn)一步的體系優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)重金屬離子的絕對(duì)定量檢測和不同類型邏輯門的設(shè)計(jì)（YES門、AND門和OR門）。

圖14 基于生物傳感器和數(shù)字PCR的銅離子以及汞離子絕對(duì)定量檢測體系原理圖

圖15 數(shù)字PCR-邏輯門檢測體系基礎(chǔ)反應(yīng)原理［71］

7 小結(jié)

數(shù)字PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用逐漸顯現(xiàn)出一些不足之處。首先，相對(duì)于常規(guī)檢測技術(shù)來說，由于數(shù)字PCR熒光通道的局限性導(dǎo)致其檢測通量不會(huì)很高，這決定了在多樣品多靶標(biāo)的篩查中，數(shù)字PCR技術(shù)通常具有較高的工作量；另外，數(shù)字PCR較為昂貴的實(shí)驗(yàn)成本也同樣制約了數(shù)字PCR的發(fā)展；而且，由于數(shù)字PCR平臺(tái)商業(yè)化還沒有特別成熟，所以數(shù)字PCR平臺(tái)的自動(dòng)化操作還沒有得到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，同時(shí)數(shù)字PCR平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)化檢測技術(shù)開發(fā)的滯后也制約了數(shù)字PCR技術(shù)在各領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展；另一方面，由于現(xiàn)階段數(shù)字PCR內(nèi)部的平臺(tái)眾多，各個(gè)平臺(tái)的數(shù)據(jù)分析處理方式不盡相同，所以如何對(duì)不同數(shù)字PCR平臺(tái)之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)范的協(xié)同分析也是數(shù)字PCR發(fā)展的重點(diǎn)。不過由于數(shù)字PCR較于常規(guī)檢測技術(shù)不可替代的優(yōu)勢，尤其是在背景復(fù)雜的樣品方面［71］，其不斷發(fā)展也將對(duì)功能核酸檢測領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，在分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等基礎(chǔ)研究和應(yīng)用方面發(fā)揮更大的作用。