鹽酸益母草堿對(duì)破骨細(xì)胞生成的作用及機(jī)制研究*

張 怡，田坤明（遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州遵義563000）

骨質(zhì)疏松癥是全球公共健康衛(wèi)生問題。在中國(guó)，年齡在60歲以上約有23％左右、80歲以上50％的人被診斷為骨科疾病[1]。骨質(zhì)疏松癥是由于破骨細(xì)胞活動(dòng)增加，導(dǎo)致骨密度降低，從而增加骨折風(fēng)險(xiǎn)[2]。骨密度降低的直接原因就是由于破骨細(xì)胞活躍所致的骨吸收效應(yīng)，超過了成骨細(xì)胞的新骨形成速度。

目前，一些中藥在抗骨質(zhì)疏松方面已經(jīng)取得了顯著療效，包括淫羊藿[3]、女貞子[4]和補(bǔ)骨脂[5]等。女性在絕經(jīng)后缺少雌性激素會(huì)增加破骨細(xì)胞的骨吸收能力[6]。鹽酸益母草堿（LH）基于益母草堿結(jié)構(gòu)化學(xué)合成，于植物益母草中發(fā)現(xiàn)[7]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，益母草堿可以提高雌二醇激素水平[8]，但益母草堿對(duì)于骨質(zhì)疏松癥的治療作用及機(jī)制仍缺乏報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)主要探討LH在體外對(duì)破骨細(xì)胞的成熟分化影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 LH購自安徽新星藥業(yè)發(fā)展有限公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色使用白細(xì)胞酸性磷酸酶染色試劑盒購自Sigma公司，核因子κB抑制蛋白（IκBα）、磷脂酰肌醇 3?激酶（PI3K）和蛋白激酶 B（Akt）的磷酸化和非磷酸化抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；小鼠重組核因子κB受體活化因子配體（RANKL）購自PeproTech公司，RAW264.7細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 為形成破骨細(xì)胞樣細(xì)胞，將RAW264.7細(xì)胞接種在 α?MEM培養(yǎng)基并且加入RANKL（100 ng∕mL）4～6 d，接種密度為 1×105。培養(yǎng)條件為5％CO2及37℃無菌環(huán)境中。

1.2.2 TRAP染色 RAW264.7細(xì)胞先用RANKL處理48 h，然后用不同濃度（0.5、1.0、2.0 μmol∕L）的 LH 處理48 h。隨后固定在3.7％多聚甲醛10 min，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行TRAP染色，在顯微鏡下3個(gè)或4個(gè)TRAP核染色陽性的細(xì)胞就是破骨細(xì)胞。

1.2.3 MTT實(shí)驗(yàn) 采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞增殖。將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，接種密度為每孔0.5×105個(gè)，每組并且設(shè)置4個(gè)副孔。接種24 h之后，分2組處理。第1組用不同濃度LH（0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol∕L）處理 RAW264.7 細(xì)胞 48 h。第 2 組用 2.0 μmol∕L LH 處理 RAW264.7 細(xì)胞 24、48、72 h。磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）洗滌細(xì)胞，每孔R(shí)AW264.7細(xì)胞中加入20 μL的5 mg∕mL MTT試劑，放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。丟棄MTT溶液，加入200 μL二甲基亞砜（DMSO）溶液，然后在搖床上搖蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm處檢測(cè)吸光度值。

1.2.4 Western blotting實(shí)驗(yàn) 取LH干預(yù)組（RANKL+LH組）及非LH干預(yù)組（RANKL組）細(xì)胞，棄掉細(xì)胞中培養(yǎng)基，用PBS洗2次。每個(gè)小皿加入80 μL裂解液，在冰上裂解 30 min。刮蛋白，離心（13 min、4 °C、13 000 r∕min）收集蛋白裂解液。雙環(huán)辛酸（BCA）工作液根據(jù)0.5 mg∕mL牛血清蛋白（BSA）制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后檢測(cè)不同處理細(xì)胞蛋白濃度。制備上樣蛋白（40 μg）。在8％SDS?PAGE凝膠中分離，之后電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜用5％脫脂牛奶在室溫封閉1 h，PBS洗3次，每次5 min。孵育磷酸化芳香胺N（anti?phospho）?IκBα、anti?phospho?PI3K 和 anti?phospho?Akt抗體，以及非磷酸化的 anti?IκBα、anti?PI3K 和 anti?Akt抗體，甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）用作內(nèi)參。放置于4℃環(huán)境，過夜，PBS洗3次，每次5 min。孵育相應(yīng)的二抗，PBS洗3次，每次5min，最后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用表示，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TRAP染色 RANKL刺激RAW264.7分化為破骨細(xì)胞，TRAP染色陽性為多核破骨細(xì)胞。在RAW264.7細(xì)胞中，TRAP染色表明，與RANKL組比較，不同濃度LH顯著抑制破骨細(xì)胞分化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖 1A、B。

圖1 TRAP對(duì)RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行染色

2.2MTT實(shí)驗(yàn) MTT實(shí)驗(yàn)表明，LH能夠顯著抑制RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞增殖，與對(duì)照組（0.0 μmol∕L LH組）比較，其他不同濃度LH組的RAW264.7細(xì)胞存活率顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并且對(duì)RAW264.7細(xì)胞抑制作用呈時(shí)間、劑量依賴性。見圖2A、B。

2.3 Western blotting實(shí)驗(yàn) Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組（0 min）比較，RANKL 顯著上調(diào) p?IκBα表達(dá)，尤其是在第10分鐘，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在相同處理時(shí)間（5、10、15 min），與 RANKL 組比較，LH處理之后可以顯著抑制p?IκBα的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3A、B。

與對(duì)照組（0 min）比較，在RANKL處理5、10 min時(shí)，顯著上調(diào)p?PI3K和p?Akt表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在相同處理時(shí)間（5、10、15、30、60 min），與RANKL組比較，LH處理之后可以顯著抑制p?PI3K和p?Akt表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 3C、D?1、D?2。

圖2 LH對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖影響

圖3 LH對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

LH是基于從益母草中提取的益母草結(jié)構(gòu)。在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，益母草是廣泛用于婦科疾病，例如流產(chǎn)之后子宮異常出血[9]、產(chǎn)后出血[10]及痛經(jīng)[11]。本研究表明，LH能夠明顯抑制RANKL介導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。在分子機(jī)制水平方面，LH抑制RANKL激活的NF?κB活性，影響IκBα磷酸化和降解，抑制PI3K∕AKT信號(hào)通路的激活。

作者用破骨細(xì)胞前體RAW264.7研究LH對(duì)破骨細(xì)胞形成的影響。在骨髓微環(huán)境中，RANKL能夠驅(qū)使破骨細(xì)胞前體分化為成熟破骨細(xì)胞[12]，故本研究采用RANKL刺激RAW264.7分化為破骨細(xì)胞。而TRAP染色與MTT實(shí)驗(yàn)都表明，LH能夠顯著抑制破骨細(xì)胞形成，并且呈劑量、時(shí)間依賴性。

核因子κB在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成中發(fā)揮著重要的作用，缺失核因子κB亞基p50和p52導(dǎo)致骨硬化不能夠形成破骨細(xì)胞[13]。PI3K∕Akt信號(hào)通路可以被RANKL 激活，從而調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生存和分化[14?15]。而RANKL 誘導(dǎo)的 Akt又是依賴于 TRAF6?Src?PI3K∕Akt的相互作用，故本研究探討了LH對(duì)RANKL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IκBα、PI3K和Akt蛋白磷酸化的影響。結(jié)果顯示，RANKL誘導(dǎo)的Akt活性對(duì)LH極度敏感，LH抑制RANKL介導(dǎo)的PI3K上調(diào)。

本研究結(jié)果表明，LH可以通過下調(diào)IκBα、PI3K和Akt蛋白的磷酸化，從而抑制IκBα、PI3K和Akt蛋白活性，抑制破骨細(xì)胞生成。其可能用于臨床治療破骨細(xì)胞相關(guān)疾病如骨質(zhì)疏松癥等。