5型肺炎鏈球菌莢膜多糖與CRM197蛋白結合疫苗的制備及免疫原性的研究①

張 利 彭少丹 孟 欣 朱 濤 王浩猛 李軍強

(天津科技大學，天津300457)

肺炎鏈球菌簡稱為肺炎球菌，為革蘭氏陽性菌，其主要致病因子為莢膜多糖。有莢膜菌株的毒力是無莢膜菌株的105倍[1,2]。根據莢膜多糖的抗原結構可將肺炎球菌分為至少90個血清型，其中約30個血清型的菌株可引發(fā)多種侵襲性疾病[3,4]，包括菌血癥、腦膜炎、肺炎球菌性肺炎、侵襲性肺炎球菌病等。肺炎球菌在兒童和老年人群中的發(fā)病率較高[5]；一般情況，感染肺炎球菌引發(fā)的IPD患者的死亡率為10%～25%[6]，且隨著患者年齡的增長，IPD的死亡率呈上升趨勢，在美國≥65歲人群IPD的死亡率高達50%[7]。

目前市場上的兩種肺炎疫苗分別為肺炎多糖疫苗和肺炎多糖蛋白結合疫苗。我國成都生物制品研究所成功研制了23價肺炎多糖疫苗，于2006年上市；該疫苗在我國的血清型覆蓋率約80%[8,9]，缺點是難以有效的預防嬰幼兒侵襲性肺炎鏈球菌感染。主要原因是多糖抗原為胸腺非依賴型抗原，而2歲及2歲以下的嬰幼兒免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，故對大多數(shù)莢膜多糖的抗體應答反應較弱，僅產生低水平的特異性抗體。通過與載體蛋白的偶聯(lián)，可使胸腺非依賴性多糖抗原變?yōu)樾叵僖蕾囆钥乖?，從而有效克服多糖疫苗難以激發(fā)嬰幼兒有效免疫反應的缺陷?；菔涎兄频?價肺炎結合疫苗的臨床經驗證明，結合疫苗可使兒童和未接種的成年人肺炎球菌性疾病的發(fā)病率大幅下降。調查顯示，該疫苗的推廣使用，使5歲以下的兒童中由肺炎球菌引起的侵襲性疾病的發(fā)病率下降了79%，其中疫苗中所包含的血清型的發(fā)病率下降了99%[10]。

一般多糖蛋白結合采用CNBr作為偶聯(lián)劑，但是CNBr為毒性化學試劑，本文開拓性的嘗試以還原胺化法進行肺炎結合疫苗的制備，得到的5型結合物在大鼠上產生較好的免疫原性，該研究思路，對于開發(fā)肺炎結合疫苗提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 肺炎鏈球菌5型莢膜多糖、CRM197蛋白、磷酸鋁佐劑(康希諾生物股份公司)、氫氧化鋁佐劑(德國Brenntag公司)、高碘酸鈉[阿法埃莎(天津)化學有限公司]；氰基硼氫化鈉、BSA、辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠抗體(美國Sigma公司)；SSI-5型多抗血清(丹麥國家血清研究所)；Sprague Dawley(SD)大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。

1.1.2儀器 Sartocon Slice型切向流(TFF)超濾(截留分子量100 kD、材質Hydrosart)系統(tǒng)、PB-10 pH計[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司)；752型紫外分光光度計、MK3型酶標儀(美國Thermo公司)；Sigma3k15臺式冷凍離心機(美國Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1結合物的制備

1.2.1.1PN5PS的活化 將肺炎5型多糖溶解于100 mmol/L、pH5.0醋酸鈉緩沖液中，濃度為2 g/L，分別加入終濃度為0.10、0.25、0.50、1.00 g/L的高碘酸鈉(NaIO4)，避光，25℃孵育24 h，反應結束后采用Sartocon Slice型切向流(TFF)超濾系統(tǒng)純化，得到不同活化度的活化多糖。

1.2.1.2PN5PS與CRM197的結合 將上述活化多糖與CRM197蛋白按照0.8∶1質量比進行結合，緩沖體系為0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，氰基硼氫化鈉的終濃度為1.5 g/L，避光，30℃孵育72 h，再次加入等量氰基硼氫化鈉，于30℃孵育20～24 h。

1.2.2活化產物及結合物的分析 用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法檢測活化糖的醛基含量，蒽酮-硫酸法檢測多糖含量，Lowry法檢測蛋白含量，結合物中糖及蛋白的質量除以投入的糖和蛋白質量來計算結合物的糖及蛋白回收率；結合物的相對分子量通過高效液相色譜(HPLC)測定，層析柱為TSK-GEL，流動相為0.2 mol/L NaCl(pH7.2)，流速為0.5 ml/min，Shodex RI detector檢測；聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)定性分析結合物中游離蛋白的含量?；罨鹊挠嬎愎綖椋篋O=Cps/(Mi × nCHO)，其中Cps：活化多糖濃度(μg/ml)，Mi：肺炎鏈球菌血清型5莢膜多糖單體分子量(920 g/mol)，nCHO：活化多糖的醛基濃度(μmol/ml)。

1.2.3結合物中游離糖含量 脫氧膽酸鈉酸沉淀法檢測多糖蛋白結合物中游離糖含量，具體為將結合產物進行稀釋，使得最終的蛋白濃度小于或等于300 mg/L，取樣品3.5 ml與0.7 ml 1%的脫氧膽酸鈉混合，冰浴30 min，用0.1 mol/L HCl調節(jié)pH到2.5，9 500 r/min，4℃離心30 min，分離上清和沉淀，沉淀用0.1 mol/L NaOH復溶。上清檢測多糖含量，沉淀檢測蛋白含量，當?shù)鞍壮恋砺试?5%～105%時，即認為實驗有效，可進行游離多糖含量的計算。計算公式為：游離糖含量%=(上清中糖含量g)/(稀釋后結合物中糖含量g)×100%。

1.2.4抗原性檢測 采用免疫雙擴散法檢測不同結合比結合物中5型莢膜多糖的抗原活性是否發(fā)生改變。其中中央孔為SSI-5型多抗血清，邊緣孔為5型純化多糖、不同結合比的結合物及生理鹽水。

1.2.5動物免疫 以生理鹽水作為陰性對照組、沛兒13(13價肺炎結合疫苗)作為陽性對照組、實驗組為不同結合比的結合物實驗組、結合物-氫氧化鋁佐劑吸附組和結合物-磷酸鋁佐劑吸附組，其中含佐劑的供試品中多糖濃度為5.5 μg/ml，鋁含量為0.25 mg/ml；將檢疫合格體重為160～200 g的SPF級雌性SD大鼠隨機分組，每組5只。腹部皮下注射供試品，免疫兩次，間隔2周，每針每次100 μl。免疫第28天后，摘眼球采血并分離血清。所有分離的血清樣品存放于-20℃冰箱備用。

1.2.6特異性IgG抗體檢測 采用間接ELISA法測定大鼠血清中抗5型肺炎多糖的特異性IgG抗體。將5型肺炎多糖溶解于包被液中至終濃度為10 μg/ml，加入96孔酶標板，每孔100 μl，4℃過夜后，洗滌液洗滌3次；然后加入1%BSA進行封閉。待檢血清起始稀釋200倍，依次2倍倍比稀釋后進行檢測，37℃孵育1 h；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗大鼠二抗(1∶10 000)，37℃孵育1 h，顯色15 min 后加終止液終止反應，在酶標儀450 nm波長處讀數(shù)。選待檢血清的吸光度值與生理鹽水對照組的大鼠血清的吸光度值之比≥2.1時為cut off值計算抗體效價，此時待檢血清對應的最大稀釋倍數(shù)即為抗體滴度，以10為底取對數(shù)后進行統(tǒng)計學分析。

1.3統(tǒng)計學處理 采用JMP統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據進行分析，使用t檢驗法，P<0.05表示差異具有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1結合物理化結果分析 研究了高碘酸鈉加入量對多糖活化的影響，由表1結果可知，反應體系中高碘酸鈉含量增加，多糖的活化度降低，同時引入的醛基含量增加，但是過高的高碘酸鈉會導致醛基含量的降低，活化度呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。

表1中的活化多糖和載體蛋白結合后，結合物的各項指標檢測結果見表2，游離蛋白檢測結果見圖1。

從表2可以看出更低的活化度，可以使結合反應較徹底，多糖和蛋白回收率高，游離糖含量較低；活化度過高時，結合效率較低，結合物中游離糖含量高；圖1的結合物游離蛋白檢測結果顯示，DO為17.5時的結合物游離蛋白含量最高。

表1活化多糖生化指標檢測結果

Tab.1Determinationresultofpolysaccharidederivatives

NaIO 4(g/L)Concentrationof aldehyde(μmol/L)Concentrationof Ps(μg/ml)DO0.1064.671041.1117.50.25114.781003.189.50.50148.52997.437.31.00117.47974.928.3

表2結合物的結合特性檢測結果

Tab.2Determinationresultofconjugation

DOConcentrationof Ps(μg/ml)Concentrationof Pro(μg/ml)Ratio ofPs/ProRecoveryof Ps %Recoveryof Pro%Percentof free Ps%17.5677.16249.672.739.5911.1345.249.5461.24389.421.240.4817.2430.267.3789.23415.401.957.4229.5719.118.3368.50465.120.825.5625.8225.13

不同活化度結合物的分子量檢測結果見圖2，結果表明高碘酸鈉濃度在0.10 g/L時，結合物的分子量最大，而濃度在1.0 g/L時結合物分子量相對較小，結合物分子量和多糖活化時加入的高碘酸鈉的量有關。

2.2結合物的抗原性評價 以多糖為陽性對照，分析評價了不同結合物的抗原性，由圖3結果可知，生理鹽水未與5型肺炎鏈球菌多抗血清產生沉淀線，而5型純化多糖、不同結合比的結合物均與5型肺炎鏈球菌多抗血清產生沉淀線，說明5型純化糖通過還原胺化法制備的結合物并沒有明顯改變其抗原性。

2.3多糖蛋白結合物免疫原性評價 由圖4的免疫數(shù)據顯示，結合比為0.8的結合物免疫原性弱于陽性苗，有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖4A)，結合比為1.2、1.9、2.7的結合物抗體水平和陽性苗抗體水平無顯著差異(圖4B～D)。

圖2 不同結合物分子量檢測結果Fig.2 Result of molecular weight of conjugation

圖3 5型莢膜多糖、結合物的瓊脂雙擴散Fig.3 Double agar diffusion of capsular polysaccha-ride,conjugationNote: 1.Capsular polysaccharide;2.Ps/Pro 2.7 conjugation;3.Ps/Pro 1.2 conjugation;4.Ps/Pro 1.9 conjugation;5.Ps/Pro 0.8 conjugation;6.0.9% NaCl；Ps/Pro.The proportion of polysaccha-ride and protein in the product.

圖4 不同結合比及吸附不同鋁佐劑的結合物免疫大鼠后血清中抗體水平Fig.4 Antibody level in sera of rats immunized by conjugates with different Ps/Pro ratio and aluminum adjuvantsNote: A.Ps/Pro 0.8 conjugation;B.Ps/Pro 1.2 conjugation;C.Ps/Pro 1.9 conjugation;D.Ps/Pro 2.7 conjugation;AP.Conjugation adsorbed to aluminum phosphate;AH.Conjugation adsorbed to aluminum hydroxide;**.P<0.01；***.P<0.001.

結合物吸附佐劑后，其抗體水平的平均值略高于無佐劑組，但差異無統(tǒng)計學意義；相比氫氧化鋁佐劑，磷酸鋁佐劑組誘導產生的抗體水平含量相對較高，但差異無統(tǒng)計學意義。

比較磷酸鋁佐劑吸附不同結合比的結合物免疫原性的區(qū)別， 結果見圖5： 結合比在1.2～2.7的吸附抗原抗體滴度平均值均高于結合比為0.8的吸附抗原，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或0.001)。綜上所述，5型肺炎多糖蛋白結合物的糖蛋白比在1.2～2.7之間具有一定的免疫原性，糖蛋白比為1.9時最強。

圖5 磷酸鋁佐劑吸附不同結合比的結合物免疫大鼠后血清中抗體水平Fig.5 Antibody level in sera of rats immunized by conj-ugates with different Ps/Pro ratio absorbed to aluminum phosphate Note: **.P<0.01；***.P<0.001.

3 討論

結合疫苗中廣泛應用的載體蛋白主要是白喉類毒素、破傷風類毒素。如陳曉航等[11]將5型肺炎球菌莢膜多糖與白喉類毒素結合制備了結合疫苗，黃鎮(zhèn)等[12]則采用破傷風類毒素作為載體蛋白探索肺炎結合疫苗的藥效學。然而類毒素作為載體具有一定的局限性，首要就是類毒素脫毒不徹底會有毒性殘留，安全性風險比較高，而在脫毒過程中蛋白本身的結構會發(fā)生改變，或自身發(fā)生交聯(lián)形成多聚體，從而影響蛋白的性質。本研究采用白喉類毒素的無毒突變體(CRM197)作為載體蛋白，優(yōu)點是不具有毒性且擁有白喉類毒素的免疫原性，無脫毒過程，始終維持單體形式，易于質量控制。因此CRM197作為載體蛋白是目前國際上疫苗研制的熱點，成功的例子有Hib結合疫苗、流腦結合疫苗等[13]。

國內常采用CNBr作為多糖蛋白結合疫苗制備中的活化劑，CNBr對多糖分子的活化位點是隨機的，而且CNBr的活化反應速度較快，反應過程不易控制，同時反應pH為堿性，使得多糖抗原的完整性受到一定的破壞[14]。本研究采用NaIO4作為5型肺炎鏈球菌莢膜多糖的活化劑，反應條件溫和，工藝易操作。

結合疫苗的免疫原性受到多種因素的影響，如多糖的活化程度、分子量大小、結合物中多糖與蛋白的比例、交聯(lián)程度、游離糖及游離蛋白的含量等[15]。因此在結合疫苗的制備過程中，對多糖與蛋白反應過程的各個階段進行質量控制是十分必要的，如在多糖活化及結合反應過程中，確定合適的反應條件以實現(xiàn)水解片段的均一性，結合效率的最大化，減少副反應物的生成等。本實驗中通過NaIO4法制備得到的結合物中游離糖、游離蛋白含量較低，糖及蛋白回收率較高，其免疫原性與上市的13價肺炎多糖結合疫苗類似，為以后研究多價肺炎結合疫苗奠定基礎。