血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9在肺結(jié)核鑒別診斷中的價(jià)值分析①

廖 彥 林 翀 林明冠 鐘業(yè)騰 陳少文 蘇應(yīng)仙 何 晶

(海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,?？?70311)

肺結(jié)核是常見的呼吸道傳染病。研究顯示2015年全球的新發(fā)肺結(jié)核病例達(dá)1 040萬例，300多萬例患者死于結(jié)核病或包括結(jié)核菌感染在內(nèi)的雙重感染[1,2]。第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國肺結(jié)核患者占全球肺結(jié)核患者的1/4，其中傳染性肺結(jié)核患者占40%，我國每年新發(fā)肺結(jié)核病例130萬例，死亡病例數(shù)達(dá)到了13萬，耐藥肺結(jié)核感染病例高達(dá)46%，是結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象最嚴(yán)重的國家之一[3]。及時(shí)診斷和治療的肺結(jié)核患者可達(dá)到較高的臨床治愈率[4]，但在臨床工作中，肺結(jié)核與其他肺部疾病的鑒別診斷仍然是一個(gè)棘手的問題。影像學(xué)診斷是診斷肺結(jié)核的主要方式，在此基礎(chǔ)上，對(duì)患者痰結(jié)核病菌進(jìn)行顯微鏡分析能夠進(jìn)一步提高肺結(jié)核的檢出率，臨床醫(yī)生根據(jù)患者的臨床癥狀、痰結(jié)核菌檢驗(yàn)結(jié)核、肺部影像學(xué)檢查結(jié)果可進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷[5]。但是，一些特殊的肺結(jié)核患者可出現(xiàn)異常的全身或者呼吸系統(tǒng)臨床表現(xiàn)，極易出現(xiàn)誤診或漏診，特別是長(zhǎng)期以來人們往往關(guān)注涂片陽性肺結(jié)核患者，而忽視了對(duì)涂片陰性肺結(jié)核的防控和治療，易引起感染的傳播和蔓延[6]。近年來，隨著高分辨力CT等新型影像診斷技術(shù)相繼應(yīng)用于臨床，肺結(jié)核的診斷效率得到一定的提高，但仍然不足以滿足臨床需求，這也迫使臨床工作者對(duì)肺結(jié)核的診斷從經(jīng)驗(yàn)性、X線影像和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)手段為主的階段向分子生物學(xué)診斷發(fā)展[7]。結(jié)核菌患者還會(huì)出現(xiàn)炎癥相關(guān)蛋白酶類物質(zhì)的表達(dá)異常[8]。基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一類可降解的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白酶，在結(jié)構(gòu)上具有極大同源性，是一組依賴Zn2+和Ca2+的超家族成員，對(duì)維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要意義，而在炎癥性疾病中，MMPs發(fā)揮溶解細(xì)胞外基質(zhì)和破壞基膜的作用。MMP-9參與了炎癥、血管形成和腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等病理生理過程[9]。近年來的相關(guān)研究結(jié)果顯示，MMP-9在肺損傷和肺纖維化等病理過程均扮演著重要的角色，MMPs和其組織抑制因子(Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases,TIMPs)比例的失衡是包括肺結(jié)核在內(nèi)的多種慢性肺部疾病發(fā)生和進(jìn)展的重要機(jī)制[10]，故有望作為肺結(jié)核的診斷標(biāo)志物，但也有的研究報(bào)道稱肺癌患者也可出現(xiàn)MMP-9的異常表達(dá)，因此，MMP-9是否能用于肺結(jié)核與肺癌、肺炎等的鑒別診斷仍然是一項(xiàng)飽受爭(zhēng)議的問題。基于此種研究現(xiàn)狀，本研究針對(duì)血清MMP-9在肺結(jié)核鑒別診斷中的價(jià)值進(jìn)行了研究和分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2015年8月～2017年9月醫(yī)院收治的確診為肺結(jié)核、肺炎、肺癌患者及在醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康志愿者各60例作為研究對(duì)象，分別作為肺結(jié)核組、肺炎組、肺癌組和對(duì)照組，所有研究對(duì)象均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn) 肺結(jié)核患者均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)制訂的國際結(jié)核病控制條例及國家衛(wèi)計(jì)委制訂的肺結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)痰液細(xì)菌學(xué)檢查、X線影像學(xué)檢查、肺組織病理學(xué)檢查或隨訪觀察確診。肺炎患者均符合人民衛(wèi)生出版社出版的《內(nèi)科學(xué)(第8版)》中的社區(qū)獲得性肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，均經(jīng)X線影像學(xué)檢查、痰液病原菌或血清支原體抗體檢查確診。肺癌患者均經(jīng)纖維支氣管鏡檢查、術(shù)后病理學(xué)檢查確診，并經(jīng)肺部CT或MRI等影像學(xué)檢查證實(shí)。肺結(jié)核和肺癌患者均為初診病例，入組前未接受抗結(jié)核或抗腫瘤治療。對(duì)照組研究對(duì)象均為同期在醫(yī)院接受健康體檢者，均經(jīng)臨床檢查排除肺部疾病。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 合并肝腎功能異常、自身免疫病或免疫缺陷、惡性腫瘤、肺外結(jié)核、其他肺部疾病或先天畸形、其他部位慢性炎癥的患者；具有結(jié)核病史、肺部手術(shù)史的患者；年齡小于18歲；妊娠或哺乳期患者。

1.2研究方法 所有受試者臨床干預(yù)前抽取靜脈血。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)對(duì)血清中的MMP-9水平進(jìn)行檢測(cè)，ELISA試劑盒由美國Abeam公司生產(chǎn)。①按1∶2 000的稀釋度對(duì)血清樣本進(jìn)行稀釋，取100 μl稀釋后的血清樣本與標(biāo)準(zhǔn)品、空白對(duì)照加入預(yù)包被抗體的96孔板；②于37℃下孵育2 h后每孔加入250 μl洗液洗板3次；③吸干水分后每孔加入100 μl生物素標(biāo)記抗體，于37℃下孵育1 h后再次洗板；④每孔加入100 μl鏈霉素標(biāo)記抗體，于37℃下孵育1 h后再次洗板，每孔加入100 μl底物后于37℃下孵育20～30 min；⑤每孔加入100 μl終止液后采用微孔板分光光度計(jì)(美國Bio-Rad公司生產(chǎn))于450 nm波長(zhǎng)下讀取檢測(cè)樣品的吸光度；⑥通過標(biāo)準(zhǔn)品曲線讀取被測(cè)樣品中的MMP-9水平。

2 結(jié)果

2.1四組研究對(duì)象臨床資料的比較 四組研究對(duì)象性別和吸煙史的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中，肺癌組患者的年齡大于其他三組，肺結(jié)核組患者的BMI低于其他三組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2四組研究對(duì)象血清MMP-9水平的比較 對(duì)照組、肺結(jié)核組、肺炎組、肺癌組研究對(duì)象的血清MMP-9水平分別為(1 976.36±907.44)ng/ml、(4 350.45±2 574.75)ng/ml、(2 135.68±1 263.56)ng/ml和(2 590.38±1 532.84)ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.000，P<0.001)，其中，肺結(jié)核組患者的血清MMP-9水平顯著高于其他三組(P<0.001)，肺炎組患者與對(duì)照組或肺癌組研究對(duì)象的血清MMP-9水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.606、0.141)，肺癌組患者的血清MMP-9水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)。

2.3不同臨床病理特征肺結(jié)核、肺癌患者的血清MMP-9水平的比較 不同痰培養(yǎng)結(jié)果、病變類型、病變范圍的肺結(jié)核患者及不同組織類型的肺癌患者的血清MMP-9水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而臨床分期較高、分化程度較低、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者的血清MMP-9水平顯著高于臨床分期較低、分化程度較高、未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、3。

2.4血清MMP-9在肺結(jié)核鑒別診斷中的價(jià)值分析 血清MMP-9在肺結(jié)核與健康人+肺炎+肺癌、健康人、肺炎、肺癌、肺炎+肺癌鑒別診斷中的AUC分別為0.739、0.769、0.751、0.699、0.725(P<0.05)。見表4、圖1。

表1四組研究對(duì)象臨床資料的比較

Tab.1Comparisonofclinicaldataamongfourgroupsinvolvedinthisstudy

Clinical dataTuberculosisgroup(n=60)Controlgroup(n=60)Pneumoniagroup(n=60)Lung cancergroup(n=60)F value/χ2 valueP valueAges (year)44.26±9.643)43.23±10.753)45.67±11.063)59.28±5.741)2)3)15.036<0.001Gender (male,%)28(46.67)30(50.00)29(48.33)26(43.33)0.5850.900BMI(kg/m2)22.36±3.322)3)4)24.17±4.231)24.06±4.141)23.84±3.711)6.7350.009Smoking history (case,%)19(31.67)17(28.33)19(31.67)20(33.33)0.3680.947

Note：vs the lung cancer groups,1)P<0.05;vs the control group,2)P<0.05;vs the pneumonia group，3)P<0.05;vs the lung cancer group,4)P<0.05.

Clinicopathological featuresnSera MMP-9 levelst valueP valueSputum Positive74 512.24±2713.620.3060.695Negative534 225.85±2281.21Pathology typesEmpty114 407.75±2839.520.1380.864Non-empty494 286.87±2572.23ScopeSingle leaf354 284.48±2059.560.5110.482Multiple leaf254 603.35±2781.15

表3不同臨床病理特征肺癌患者的血清MMP-9水平的比較

Tab.3ComparisonofseralevelsofMMP-9inpatientswithlungcancerwithdifferentclinicopathologicalfeatures

Clinicopathological features nSera MMP-9t valueP valueTissue typesNon-small cell lung cancer492 417.82±1 339.870.4490.563Small cell lung cancer112 628.19±1 672.53Clinical stagesⅠ-Ⅱ131 887.35±1 068.423.6890.001Ⅲ-Ⅳ473 927.06±1 904.89Degree of differentiation Poorly254 171.18±1 865.524.928<0.001Middle and high352 002.44±1 536.71Distant metastasisYes214 382.62±1 775.845.901<0.001No392 054.43±1 256.87

表4血清MMP-9在肺結(jié)核鑒別診斷中的價(jià)值

Tab.4DiagnosticvalueofseraMMP-9intuberculosis

Diagnostic typeAUCSE value95%CIP valueCutoff value(ng/ml)SensitivitySpecificityTuberculosis vs health+pneumonia+lung cancer0.7390.0440.653～0.826<0.0014127.830.5330.922Tuberculosis vs health0.7690.0470.677～0.860<0.0013524.380.6000.900Tuberculosis vs pneumonia0.7510.0460.661～0.840<0.0014284.640.5330.900Tuberculosis vs lung cancer0.6990.0490.604～0.794<0.0015008.970.4330.967Tuberculosis vs pneumonia + lung cancer0.7250.0450.637～0.813<0.0014273.390.5170.908

圖1 血清MMP-9在肺結(jié)核鑒別診斷中的ROC曲線Fig.1 ROC curve of serum MMP-9 in differential diagnosis of pulmonary tuberculosisNote: A.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis group in comparison of health control group,the pneumonia group and the lung cancer group；B.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis groups in comparison of the health control group；C.The ROC curve of serum MMP-9 in in diagnosis of the pulmonary tuberculosis groups in comparison of the pneumonia group；D.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis and the lung cancer group；E.The ROC curve of serum MMP-9 in diagnosis of the pulmonary tuberculosis and the pneumonia group,the lung cancer group.

3 討論

本研究顯示肺結(jié)核和肺癌患者血清MMP-9水平均顯著高于健康人群，肺結(jié)核患者的血清MMP-9水平要顯著高于肺癌患者。張錦萍[11]研究顯示，初治肺結(jié)核患者可出現(xiàn)血清MMP-9水平的顯著升高，尤其痰菌陽性、肺內(nèi)病變廣泛、肺內(nèi)病變有空洞患者的血清MMP-9水平較高，在接受抗結(jié)核治療后，患者的MMP-9水平會(huì)出現(xiàn)顯著下降，特別是轉(zhuǎn)陰患者的下降幅度更大，這提示了血清MMP-9水平的動(dòng)態(tài)變化與肺結(jié)核患者的活動(dòng)程度和病情轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。陳健兒等[12]研究顯示，在肺結(jié)核患者的肺部組織中，也存在著MMP-9的過表達(dá)，活動(dòng)性肺結(jié)核患者肺組織中的MMP-9表達(dá)水平更高。袁國平等[13]的研究結(jié)果顯示，結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中的MMP-9水平要高于病毒性腦膜炎和非感染性神經(jīng)系統(tǒng)患者，而且在疾病急性期的水平要高于恢復(fù)期，這可用于鑒別診斷結(jié)核性腦膜炎。但關(guān)于MMP-9在肺結(jié)核鑒別診斷中的研究則不多，一些研究中報(bào)道了MMP-9在鑒別診斷結(jié)核性胸液、惡性胸液、漏出性胸液中具有一定的價(jià)值，但也有研究結(jié)果顯示，在肺癌患者的血清樣本和腫瘤組織中也可檢出MMP-9水平升高，其水平與肺癌的組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，并可在手術(shù)之后出現(xiàn)顯著下降[14-16]。這些研究結(jié)果提示了肺癌患者的血清MMP-9水平也可出現(xiàn)升高，這可能影響其在肺結(jié)核與肺癌鑒別診斷中的臨床價(jià)值，但從本研究結(jié)果可以看出，相對(duì)肺癌患者，肺結(jié)核患者的血清MMP-9水平升高更加劇烈，這能夠?yàn)榕R床診斷提供參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，血清MMP-9在人群的肺結(jié)核篩查和肺結(jié)核與肺炎、肺癌的鑒別診斷中均可能具有一定的價(jià)值，其中，在人群的肺結(jié)核篩查中的價(jià)值最高，而在與肺癌的鑒別診斷中價(jià)值最低，但在Cutoff值下，血清MMP-9的診斷靈敏度偏低，而診斷特異度較高，因此，在應(yīng)用時(shí)還需要結(jié)合其他臨床檢查和標(biāo)志物檢測(cè)來提高靈敏度。近年來，關(guān)于MMP-9與肺結(jié)核發(fā)病的相關(guān)性機(jī)制研究較為缺乏，但針對(duì)其他慢性肺部疾病的研究卻在一定程度上揭示了MMP-9在肺部疾病持續(xù)性炎癥損傷中的作用。于嘉琛等[17]研究顯示，在慢性哮喘小鼠模型的支氣管上皮細(xì)胞中可出現(xiàn)MMP-9高表達(dá)，MMP-9表達(dá)增加與血清類黏蛋白1樣蛋白3(ORMDL3)基因的表達(dá)上調(diào)具有相關(guān)性，而二者的表達(dá)增高可能共同參與了氣道壁厚度等慢性哮喘氣道重塑進(jìn)程。安鐘健等[18]的研究結(jié)果顯示，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)/血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)/MMP-9信號(hào)通路可能是誘導(dǎo)大鼠模型肺纖維化的重要通路之一。潘娜等[19]的研究結(jié)果顯示，MMP-9與慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)氣道炎癥的關(guān)系也十分緊密，MMP-9的過表達(dá)可能是導(dǎo)致COPD急性發(fā)作的重要原因之一?？挡试频萚20]的研究結(jié)果顯示，在COPD的發(fā)生和急性加重過程中，患者血清MMP-9水平的上升還與Th17細(xì)胞功能異常存在一定相關(guān)性，二者相互影響，加重COPD的自體免疫反應(yīng)?？梢?，在多種慢性氣道及肺組織異構(gòu)性疾病中，MMP-9表達(dá)水平的升高均發(fā)揮了促進(jìn)炎癥損害、加劇免疫功能紊亂、誘導(dǎo)病情加重的作用。同時(shí)，國外研究針對(duì)MMP-9在其他部位結(jié)核發(fā)生和發(fā)展過程中的作用也進(jìn)行了一定的報(bào)道，Ong等[21]的研究結(jié)果顯示中性粒細(xì)胞分泌的MMP-9造成了血腦屏障的核心成分IV型膠原的破壞，從而降低腦組織對(duì)病原菌的抵抗能力。Chen等[22]研究顯示，結(jié)核菌能夠激活ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)TLR2、TNF-α的表達(dá)從而引起人體細(xì)胞MMP-9表達(dá)水平的升高，這一病理變化與積液和胸膜纖維化具有密切的相關(guān)性，很有可能促進(jìn)了肺結(jié)核的發(fā)病和進(jìn)展，這些研究結(jié)果都提示了結(jié)核菌可通過對(duì)人體細(xì)胞的入侵和分泌相關(guān)毒素來促進(jìn)組織MMP-9的高表達(dá)，進(jìn)而加劇病變局部及全身的免疫失衡和炎癥損害，監(jiān)測(cè)患者的血清MMP-9水平有助于輔助診斷結(jié)核菌的感染和損害。

綜上所述，肺結(jié)核患者表現(xiàn)為血清MMP-9水平的顯著升高，其升高幅度高于肺癌或肺炎患者，可作為一種血清標(biāo)志物用于肺結(jié)核的鑒別診斷和篩查，但應(yīng)注意適當(dāng)提高診斷的靈敏度。