扶正解毒通絡(luò)方對人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制研究①

趙忠偉 曲 寧 楊 明 張景洲

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,長春130021)

經(jīng)臨床研究表明，肝細(xì)胞癌的死亡率和發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升的趨勢，且其死亡率和發(fā)病率在各種惡性腫瘤中仍居高不下，各國人民受其影響很大。“毒損肝絡(luò)”的基本理論認(rèn)為是毒邪作祟、阻滯于肝絡(luò)，出現(xiàn)絡(luò)虛、毒侵，而化毒為害是絡(luò)病遷延和深化的關(guān)鍵所在。基于以上理論，根據(jù)本科室多年臨床經(jīng)驗擬方扶正解毒通絡(luò)方，選用姜黃、當(dāng)歸、黃芪、桂枝等中藥，使血和氣行、血絡(luò)通暢。肝絡(luò)通達(dá)，則絡(luò)虛可補(bǔ)，毒瘀可祛，從而達(dá)到扶正解毒通絡(luò)的治療目的。目前對于肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病機(jī)制的說法很多，針對其發(fā)病機(jī)制有著大量的研究，但可以確定的是，肝細(xì)胞癌無論是在體外培養(yǎng)的還是在體內(nèi)存在的，都存在著一種現(xiàn)象即細(xì)胞凋亡，其凋亡的程度與快速退化組織中的凋亡相類似。本文通過制備大鼠血清，觀察扶正解毒通絡(luò)方低劑量、中劑量、高劑量含藥血清對HepG2人肝癌細(xì)胞增殖情況的影響，對HepG2人肝癌細(xì)胞早期凋亡情況的影響，對HepG2人肝癌細(xì)胞內(nèi)Bax及Bcl-2 mRNA水平的影響，對細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白水平的影響。以探討扶正解毒通絡(luò)方對HepG2人肝癌細(xì)胞的作用及機(jī)制，為中醫(yī)藥治療HCC提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 MTT購于美國Sigma公司；試劑Bax、Bcl-2購于美國CST公司；Caspase-3購于英國Abcam公司；SIRT3購于香港Abcam有限公司；Fas購于美國SANTA CRUI公司；P53購于上海賽信通生物試劑有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1扶正解毒通絡(luò)方灌胃溶液的制備 扶正解毒通絡(luò)方由姜黃20 g、黃芪10 g、當(dāng)歸9 g、桂枝10 g組成。將藥物水煎3次，然后合并濃縮至含生藥0.4 g/ml濃度。

1.2.2扶正解毒通絡(luò)方含藥血清的制備 SD大鼠雄性24只，隨機(jī)分成空白組、扶正解毒通絡(luò)方低劑量、中劑量、高劑量共4組，每組6只?？瞻捉M給予蒸餾水1 ml/100 g灌胃，低劑量組、中劑量組、高劑量組給予扶正解毒通絡(luò)方1 g/kg、2 g/kg、4 g/kg灌胃，連續(xù)5 d，每日2次，于第4天結(jié)束后禁食禁水，第5天給藥結(jié)束后，將大鼠麻醉(0.3 ml/100 g水合氯醛)，然后進(jìn)行腹主動脈取血。靜置4 h(室溫)，取其上清血。與同組動物血清相融合，56℃加熱30 min，即可成功滅活，將其用0.22 μm微孔濾膜于無菌環(huán)境中進(jìn)行過濾除菌及分裝，置于-20℃的冰箱中保存。

1.2.3HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 待細(xì)胞在培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中達(dá)到指數(shù)生長期時，消化法(0.25%胰蛋白酶-EDTA)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。PBS吸除剩余培養(yǎng)液置于37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育，鏡下觀察，盡快滴入培養(yǎng)液(含血清)，1 000×g離心5 min，取上清，重懸計數(shù)，置于新培養(yǎng)瓶以3×105～5×105cells/ml細(xì)胞數(shù)接種，置于培養(yǎng)箱，運用上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)，2～3 d 進(jìn)行一次傳代。

1.2.4細(xì)胞活力檢測 采用MTT法檢測細(xì)胞活力，取生長狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為4.5×104～5×104cells/ml范圍內(nèi)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種100 μl，實驗分為正常血清組、正常對照組、扶正解毒通絡(luò)方低劑量、中劑量、高劑量含藥血清組和陽性對照組(順鉑)共6組，每組6孔。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d(37℃，5%CO2)，正常對照組加入培養(yǎng)液100 μl、正常血清組加入大鼠血清培養(yǎng)液100 μl，扶正解毒通絡(luò)方低、中、高含藥血清組分別加入其對應(yīng)的含藥大鼠血清培養(yǎng)液100 μl，陽性對照組加入順鉑溶液(10 μg/ml)100 μl。并將等量的含血清培養(yǎng)液滴入到設(shè)定的6個平行孔中，其平行孔全部設(shè)為調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)(24 h),加入MTT(20 μl，5 mg/ml)，分別置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h(37℃，5%CO2)棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，酶標(biāo)分析儀速度調(diào)至中速、波長570 nm，振蕩5 min，測定6孔中的OD值，計算各組不同濃度含藥血清的抑制率[1]。

1.2.5RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2 mRNA水平 采用Trizol提取腫瘤細(xì)胞RNA，將Trizol 1～2 ml 加入到60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中靜置3 min，取上清液置1.5 ml EP管中；2 000×g離心5 min，去沉淀；加入200 μl氯仿，震蕩15 min，混勻，靜置15 min；4℃下12 000×g離心15 min，4℃下加入0.5 ml 異丙醇，室溫靜置10 min；4℃ 12 000×g離心10 min，去上清液，RNA沉于管底；加入75%的乙醇，輕震蕩，沉淀；4℃下8 000×g離心5 min，去上清液，干燥10 min(室溫)；每管用被DEPC(50 μl)處理過的水溶解RNA，10 min(55～60℃)；測定A260和A280處的OD值，判斷RNA的純度并定量；將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；熒光實時定量PCR。

1.2.6免疫印跡(Western blot)檢測細(xì)胞中Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白水平 提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定細(xì)胞總蛋白濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜,封閉,加入一抗與靶蛋白結(jié)合,酶標(biāo)記的二抗和一抗結(jié)合,顯色。

2 結(jié)果

2.1扶正解毒通絡(luò)方含藥血清對HepG2人肝癌細(xì)胞增殖的影響 與正常對照組比較，正常血清組人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖無影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與正常血清組比較，扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組都能顯著抑制肝癌細(xì)胞的過度增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2含藥血清對HepG2人肝癌細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA水平的影響 與正常對照組比較，正常血清組人肝癌細(xì)胞HepG2胞內(nèi)Bcl-2和Bax mRNA水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與正常血清組比較，扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組HepG2胞內(nèi)Bc1-2基因轉(zhuǎn)錄減少，Bax基因轉(zhuǎn)錄增加，見圖2、3。

2.3含藥血清對HepG2人肝癌細(xì)胞Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白水平的影響與正常對照組比較，正常血清組人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白表達(dá)水平無明顯改變；與正常血清組比較，扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白表達(dá)增加(圖4)。

圖1 含藥血清對肝癌細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of medicated serum on proliferation of HepG2 cellNote: Compared with normal control group,*.P<0.05，**.P<0.01.

圖2 含藥血清對肝癌細(xì)胞Bcl-2 mRNA水平的影響Fig.2 Effect of medicated serum on level of Bcl-2 mRNA of HepG2 cellNote: Compared with normal control group,**.P<0.01.

圖3 含藥血清對肝癌細(xì)胞Bax水平的影響Fig.3 Effect of medicated serum on level of Bax of HepG2 cellNote: Compared with normal control group,**.P<0.01.

圖4 蛋白Western blot結(jié)果Fig.4 Protein Western blot resultsNote: 1.Normal control group；2.Normal serum group；3.Low dose group；4.Middle dose group；5.High dose group；6.Positive control group.

3 討論

臨床的惡性腫瘤中，HCC是非常常見的惡性腫瘤之一，與人類所處的生存環(huán)境不斷被污染和破壞有關(guān)，而且這種趨勢越來越明顯的加重，最終導(dǎo)致了大量癌癥特別是肝癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。目前為止，醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為手術(shù)切除仍然是治愈早期肝癌的最理想方法，然而，即使是對患者腫物進(jìn)行根治性切除，60%以上的HCC患者在術(shù)后5年內(nèi)仍將會發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。盡管目前對于HCC患者來說，腫瘤分化程度、腫瘤大小、是否存在血管侵襲等臨床因素與HCC患者治療方案的選擇及預(yù)后關(guān)系密切，但是HCC的發(fā)病機(jī)制目前仍不是十分清楚，因此，探討HCC的發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，尋找肝癌早期診斷、早期治療的方法和途徑，是目前肝細(xì)胞癌研究過程中的重要任務(wù)之一。

根據(jù)中醫(yī)絡(luò)病學(xué)理論，我們提出了“毒損肝絡(luò)”學(xué)說，用于治療肝細(xì)胞癌，我們認(rèn)為毒邪作祟、最終阻滯于肝絡(luò)，出現(xiàn)絡(luò)虛、毒侵，而瘀毒成為致病因素，成為絡(luò)病遷延不愈和疾病不斷深化的病機(jī)關(guān)鍵。其中，毒邪是HCC的啟動因子，即“邪毒”造成“肝絡(luò)之損”，最終又導(dǎo)致“肝絡(luò)之變”；“瘀”是重要的樞紐因子，是這些慢性肝病發(fā)病甚至癌變的中心環(huán)節(jié)，也是“肝炎發(fā)展為肝硬化甚至變?yōu)楦伟标P(guān)鍵所在[2]。所以治療原則上以通絡(luò)為基礎(chǔ)，兼以扶正解毒，故選用姜黃、黃芪、當(dāng)歸、桂枝等中藥，使血和氣行，血絡(luò)通暢。肝絡(luò)疏通調(diào)暢，則絡(luò)虛得補(bǔ)，瘀毒得祛，達(dá)到通絡(luò)治療的目的。中藥具有的療效很多，例如祛邪扶正、補(bǔ)益元氣等，且研究表明，中藥在抑制腫瘤細(xì)胞生長的同時不會對其他正常細(xì)胞有所損傷。扶正解毒通絡(luò)方是以中醫(yī)學(xué)“毒損肝絡(luò)”理論為基礎(chǔ)，根據(jù)多年臨床經(jīng)驗?zāi)毘龅目垢伟灧?，既往的臨床研究表明，扶正解毒通絡(luò)方可具有延長患者生存期，提高患者生存質(zhì)量的功效。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡、壞死是抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖的重要方式，其中凋亡是一種細(xì)胞死亡的正常方式，其具有一定的程序性特點，是機(jī)體清除異常分化細(xì)胞或衰老細(xì)胞的重要方法[3]。中藥復(fù)方扶正解毒通絡(luò)方的前期臨床研究表明，該方在肝細(xì)胞癌的治療中能夠改善患者的臨床癥狀，延長腫瘤患者的生存期，提高患者生存質(zhì)量，降低患者肝功中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶等，一定程度上提高機(jī)體的免疫力，可有效抑制腫瘤的生長。

死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑是正常細(xì)胞在凋亡調(diào)控過程中依賴的三個進(jìn)化保守的信號傳導(dǎo)途徑。凋亡的發(fā)生是由caspase家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，即caspase在凋亡誘導(dǎo)信號的作用下，啟動型caspase先激活，從而發(fā)揮水解酶的活性，激活下游的效應(yīng)型caspase，一旦效應(yīng)型caspase被激活，就可以大范圍的水解細(xì)胞內(nèi)的靶物質(zhì)，從而降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，使細(xì)胞不可逆地走向死亡。細(xì)胞的凋亡分為凋亡誘導(dǎo)、調(diào)控執(zhí)行和效應(yīng)三個階段，最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行者是caspase-3[4]。Bcl-2和Bax通過調(diào)控線粒體膜的通透性從而控制細(xì)胞色素C的釋放，達(dá)到調(diào)控下游caspase-3蛋白酶活化的目的，介導(dǎo)細(xì)胞的存活或者死亡[5]。本實驗研究表明，與正常對照組比較，正常血清組人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、活化的caspase-3基因及蛋白表達(dá)水平無明顯改變；與正常血清組比較，扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組HepG2胞內(nèi)Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄減少，蛋白表達(dá)減少;Bax基因轉(zhuǎn)錄增加，蛋白表達(dá)增加;活化的caspase-3蛋白表達(dá)增加。

Fas是細(xì)胞凋亡的重要信號分子，能夠和FasL或Fas抗體結(jié)合，觸發(fā)Fas所在靶細(xì)胞在短時間內(nèi)發(fā)生凋亡[6]。在Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，caspase起關(guān)鍵性作用，caspase-3首先被激活，然后激活caspase-6,7，最終導(dǎo)致多種死亡底物的降解，完成誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程[7]；沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)是Sirtuins家族中的成員；P53在腫瘤生長抑制過程中也發(fā)揮了重要的作用。

本實驗結(jié)果顯示，與正常血清組比較，扶正解毒通絡(luò)方低、中和高劑量含藥血清和陽性對照組HepG2細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Bax、活化的caspase-3、SIRT3、P53及Fas蛋白表達(dá)增加。因此，我們推測扶正解毒通絡(luò)方通過上調(diào)SIRT3的表達(dá)，激活Fas，進(jìn)而誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)錄增加，增加Bcl-2/Bax比值，啟動caspase途徑，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡水平上升[8，9]。同時，SIRT3的增加還可以誘導(dǎo)P53表達(dá)的增加，繼續(xù)誘導(dǎo)Bax基因表達(dá)增加[10]，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[11,12]。