衰老對(duì)小鼠腸黏膜上皮屏障功能影響的實(shí)驗(yàn)研究①

王漢琨 張 丁 宋 莉 于 莉 宋銀宏 王德成

(三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院/三峽大學(xué)感染與損傷研究所，宜昌443002)

腸道作為機(jī)體抵御病原體的第一道屏障，包括上皮屏障、生物屏障、免疫屏障和化學(xué)屏障四個(gè)部分，是保護(hù)人體抵御病原體入侵的重要防線[1]。衰老過(guò)程中人體的先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能都會(huì)顯著下降，尤其對(duì)腸道免疫功能的影響較大，進(jìn)而導(dǎo)致腸道的吸收功能和黏膜免疫功能都會(huì)發(fā)生一系列的改變[2]，這是引起老年人腸道疾病高發(fā)的原因之一。有研究表明[3]，老年人腸道蠕動(dòng)變慢、大小便失禁，腸胃炎相關(guān)疾病的患病率較高，給老年人正常的生活造成了極大的困擾。小鼠一般壽命為18個(gè)月左右，其生長(zhǎng)過(guò)程約分為三個(gè)階段：1～2月齡為性成熟期，2～6月齡為青年期，6月齡之后就逐漸進(jìn)入衰老期，有較多研究選取12月齡到15月齡小鼠為衰老小鼠[4]。通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)衰老對(duì)小鼠腸道影響的相關(guān)文獻(xiàn)較少，因此，本實(shí)驗(yàn)選取1月齡、6月齡、10月齡，12月齡小鼠研究其腸道形態(tài)學(xué)變化、腸道黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的變化，以及小鼠小腸組織中Occludin的表達(dá)變化，探討衰老對(duì)小鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫屏障功能的影響，并且提供部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 脫水機(jī)(TP1020)、超薄切片機(jī)(ULTRACUTR)購(gòu)自Leica公司(德國(guó))；攤片烤片機(jī)(CS-V1)購(gòu)自宏業(yè)醫(yī)用(病理)儀器有限公司(湖北孝感)；Olympus BX53顯微鏡、cellSens Entry圖像采集系統(tǒng)購(gòu)自O(shè)lympus公司(日本)；小鼠單克隆抗體Occludin購(gòu)自Santa Cruz；兔抗鼠二抗、DAB試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；雄性SPFC57BL/6小鼠購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠32只，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按不同生長(zhǎng)階段分為1月齡組、6月齡組、10月齡組、12月齡組，各組8只。小鼠被處死前禁食24 h，自由飲水。使用10%水合氯醛麻醉小鼠后處死，快速打開(kāi)腹腔，取十二指腸、空腸、回腸各1 cm，使用生理鹽水清洗干凈，放入包埋盒中，固定于4%多聚甲醛中，放入4℃冰箱24 h，之后組織放入半自動(dòng)脫水機(jī)脫水。組織包埋，半自動(dòng)切片機(jī)制備切片，厚4 μm，每個(gè)蠟塊切取5張切片，黏附在載玻片上，65℃烤箱烤4～6 h，裝入切片盒備用。

1.2.2組織染色和檢測(cè)方法 HE染色：常規(guī)二甲苯脫蠟，蘇木精復(fù)染3 min，流水沖洗30 min，伊紅染色1 min，鹽酸酒精分化，常規(guī)梯度酒精脫水至透明，自然風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片。

PAS染色：常規(guī)二甲苯脫蠟，1%高碘酸染色10 min，流水沖洗5 min，雙蒸水沖洗，之后加入schiff試劑，避光反應(yīng)10 min，流水沖洗5 min，雙蒸水中靜置10 min，蘇木精復(fù)染，自來(lái)水潤(rùn)洗10 min，鹽酸酒精分化，常規(guī)梯度酒精脫水，自然風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片。

甲苯胺藍(lán)染色：常規(guī)二甲苯脫蠟，蒸餾水潤(rùn)洗3次，0.1%甲苯胺藍(lán)染液浸染30 min，自來(lái)水潤(rùn)洗5 min，1%冰醋酸分化，常規(guī)梯度酒精脫水，自然風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片。

Olympus BX53顯微鏡下觀察，使用cellSens Entry圖像采集系統(tǒng)拍照，每只小鼠十二指腸、空腸、回腸切片各取20個(gè)不連續(xù)視野，每個(gè)視野中選取5根排列整齊且形態(tài)較好的腸絨毛，使用Image-Pro Plus6.0病理圖像分析軟件，參照周一珺等[5]的方法測(cè)量絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度；參照陳靜等[6]和Mahadeva等[7]的統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞數(shù)量；苯胺藍(lán)染色統(tǒng)計(jì)肥大細(xì)胞數(shù)量。

免疫組織化學(xué)染色：常規(guī)二甲苯脫蠟，檸檬酸鹽水溶液水浴修復(fù)30 min,之后冷卻至室溫，雙蒸水潤(rùn)洗，3%H2O237℃孵育箱內(nèi)孵育15 min，5%小牛血清室溫封閉60 min，滴加一抗4℃冰箱內(nèi)孵育過(guò)夜，二抗室溫濕盒內(nèi)孵育60 min，DAB顯色 1 min，蘇木精復(fù)染10 s，鹽酸酒精分化，常規(guī)梯度酒精脫水，自然風(fēng)干，中性樹(shù)膠封片。Olympus BX53顯微鏡下觀察，使用cellSens Entry圖像采集系統(tǒng)拍照。使用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行光密度分析，計(jì)算陽(yáng)性率(IOD)。

2 結(jié)果

2.1不同月齡小鼠小腸黏膜層形態(tài)變化

2.1.1小腸絨毛高度 HE染色結(jié)果表明，相同月齡，十二指腸到回腸的絨毛長(zhǎng)度呈依次降低趨勢(shì)。隨著月齡的增高，十二指腸、空腸、回腸各組的絨毛長(zhǎng)度逐漸降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.1.2小腸絨毛寬度 HE染色結(jié)果表明，十二指腸6月齡組絨毛最寬，1月齡組到6月齡組呈增高趨勢(shì)，6月齡組到12月齡組絨毛長(zhǎng)度逐漸降低(P<0.05)；空腸和回腸各組絨毛寬度逐漸降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.1.3小腸隱窩深度 HE染色結(jié)果表明，十二指腸的隱窩寬度呈增高趨勢(shì)(P<0.05)?？漳c和回腸的隱窩寬度呈先增高后降低趨勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2不同月齡小鼠小腸上皮淋巴細(xì)胞數(shù)量變化 HE染色后光鏡下觀察，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞主要分布于腸絨毛上皮細(xì)胞之間，多數(shù)位于上皮細(xì)胞基膜附近，少量見(jiàn)于上皮游離面。該細(xì)胞較小，胞核大而圓、深染(圖1箭頭指示)，胞漿較少，見(jiàn)圖1A～D。同一腸段，不同月齡淋巴細(xì)胞數(shù)量呈先升高后降低趨勢(shì)，且6月齡組小鼠小腸各段上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞最多(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3不同月齡小鼠小腸上皮杯狀細(xì)胞數(shù)量變化 PAS染色光鏡下觀察，杯狀細(xì)胞分散于柱狀細(xì)胞之間，經(jīng)PAS染色后呈鮮紅色(圖2箭頭指示)，其頂部胞質(zhì)為大量糖原顆粒擁塞而膨隆，見(jiàn)圖2A～D。隨著月齡的增高，十二指腸、空腸、回腸各組的杯狀細(xì)胞數(shù)量逐漸降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4不同月齡小鼠小腸肥大細(xì)胞數(shù)量變化 苯胺藍(lán)染色光鏡下觀察肥大細(xì)胞為藍(lán)紫色， 主要分布在腸壁固有層中(圖3中箭頭指示)，細(xì)胞呈現(xiàn)圓形或者橢圓形，也有個(gè)別呈現(xiàn)梭形，見(jiàn)圖3A～D。隨著月齡升高，十二指腸、空腸、回腸各組的肥大細(xì)胞數(shù)量呈先增高后降低趨勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

GroupsDuodenumJejunumIleumVillous height1 month736.07±47.83650.98±39.89420.43±16.186 months635.78±77.90573.87±61.01366.25±27.511)10 months546.95±54.021)482.27±37.611)302.19±32.471)12 months476.47±19.301)377.12±21.001)266.19±15.751)Villous width1 month119.76±8.76127.11±10.69112.47±8.576 months153.98±19.901)114.58±10.8699.55±7.8510 months133.46±5.76112.35±6.8599.38±13.4812 months121.66±13.702)103.67±6.311)93.33±5.371)Crypt depth1 month135.94±20.47161.57±21.63168.76±17.286 months189.07±26.85212.01±31.061)199.07±24.2710 months195.59±25.091)201.09±28.66192.96±20.2612 months214.22±3.461)190.91±9.92189.35±16.79

Note：Compared with 1 month,1)P<0.05;compared with 6 months,2)P<0.05.

圖1 不同月齡小鼠小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量Fig.1 Small intestine intraepithelial lymphocytes in mice of different months of ageNote: A.1 month group；B.6 months group；C.10 months group；D.12 months group(×200).

2.5免疫組化檢測(cè)不同月齡小鼠黏膜組織中的Occludin蛋白 光電顯微鏡下觀察，在1月齡組和6月齡組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞間可見(jiàn)大量棕黃色或者棕褐色的Occludin蛋白表達(dá)(圖4中箭頭指示)；10月齡組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少量棕黃色或者棕褐色的Occludin蛋白表達(dá)；而12月齡組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)棕黃色或者棕褐色的Occludin蛋白表達(dá)更為少見(jiàn)。12月齡組和10月齡組與6月齡組相比，小腸黏膜內(nèi)Occludin蛋白表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

GroupsDuodenumJejunumIleum1 month6.13±0.587.26±0.487.66±0.766 months10.19±0.641)11.73±0.581)11.41±0.681)10 months9.54±0.231)10.44±0.611)2)9.93±0.571)2)12 months7.89±0.251)2)9.62±0.851)2)8.64±0.622)

Note：Compared with 1 month,1)P<0.05;compared with 6 months,2)P<0.05.

GroupsDuodenumJejunumIleum1 month8.40±0.939.30±0.6711.79±0.736 months8.00±0.848.90±0.488.65±0.841)10 months7.90±1.088.67±0.868.44±0.711)12 months7.70±1.028.62±0.128.25±0.391)

Note：Compared with 1 month,1)P<0.05.

GroupsDuodenumJejunumIleum1 month2.68±0.652.18±0.421.86±0.476 months6.45±1.711)5.75±0.871)5.45±0.611)10 months4.78±0.891)2)4.77±0.411)4.15±0.381)2)12 months2.33±0.142)2.27±0.572)1.65±0.622)

Note：Compared with 1 month,1)P<0.05;compared with 6 months,2)P<0.05.

圖2 不同月齡小鼠小腸上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量Fig.2 Intestinal epithelial goblet cells in mice of different months of ageNote: PAS staining A.1 month group;B.6 months group;C.10 months group;D.12 months group (×200).

圖3 不同月齡小鼠小腸肥大細(xì)胞數(shù)量Fig.3 Small intestine mast cells in mice of different months of ageNote: Aniline blue staining.A.1 month group;B.6 months group;C.10 months group；D.12 months group (×400).

3 討論

機(jī)體衰老伴隨有腸黏膜免疫功能下降、腸道通透性以及腸道微生物群的變化[8]，隨著機(jī)體衰老，小腸的形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫功能會(huì)發(fā)生一系列改變，進(jìn)而導(dǎo)致許多腸道相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展。本研究選取小鼠自然衰老模型，觀察1月齡、6月齡、10月齡、12月齡小鼠小腸不同部位，研究其形態(tài)學(xué)改變，黏膜免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量變化及緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)分布情況。

小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性影響其正常功能的發(fā)揮，而小腸絨毛長(zhǎng)度、絨毛寬度、隱窩深度等則是衡量小腸黏膜完整性的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究顯示，隨著月齡增加，小鼠小腸各段絨毛高度均呈降低趨勢(shì)?？漳c和回腸絨毛寬度從1月齡組到12月齡組呈下降趨勢(shì)；十二指腸絨毛寬度1月齡組到6月齡組呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且6月齡組絨毛寬度最寬，6月齡組到12月齡組呈下降趨勢(shì)。結(jié)果表明，小腸絨毛的高度和寬度會(huì)隨著年齡的增加發(fā)生一定的改變，影響小腸的消化吸收功能。有研究表明，隱窩深度變淺代表小腸細(xì)胞分化率變高，分泌能力和化學(xué)消化能力得到了加強(qiáng)[9]。本研究結(jié)果顯示，空腸和回腸的隱窩深度由1月齡組到6月齡組呈升高趨勢(shì)，6月齡組到12月齡組逐漸降低，而十二指腸隱窩深度從1月齡組到12月齡組呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。Ren等[10]對(duì)大鼠衰老模型腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的研究發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠的回腸絨毛高度、絨毛寬度、黏膜層厚度相比于青年大鼠均顯著降低，與本研究結(jié)果基本一致。腸黏膜上皮是人體代謝活動(dòng)非常活躍的地方，因此腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化可能與腸黏膜細(xì)胞自我更新中細(xì)胞凋亡增加相關(guān)[11]。

圖4不同月齡小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞間Occludin蛋白的表達(dá)(×400)

Fig.4ExpressionofOccludinproteininintestinalepith-elialcellsofmiceatdifferentmonthsofage(×400)

Note: A.1 month group；B.6 months group；C.10 months group；D.12 months group.n=8;compared with 6 months,*.P<0.05;**.P<0.01.

腸道屏障可防止腸道內(nèi)的有害物質(zhì)和病原微生物進(jìn)入體內(nèi)環(huán)境，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要防線[12]。腸黏膜上皮淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞在腸道免疫中起到重要作用。腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是腸道屏障中最先接觸病原體的免疫功能細(xì)胞，并且通過(guò)分泌免疫相關(guān)細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[13]，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞越多，說(shuō)明腸道防御能力越強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)，6月齡組到12月齡組腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞逐漸減少，但6月齡組相比1月齡組淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，可能是由于1月齡小鼠免疫系統(tǒng)還未完全發(fā)育成熟，淋巴細(xì)胞數(shù)量較少，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與Suzuki等[14]的結(jié)果基本一致。隨著逐漸老化，小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞減少，導(dǎo)致腸道內(nèi)病原微生物的大量繁殖，進(jìn)而可大大增加老年人腸道感染的幾率。杯狀細(xì)胞是腸黏膜上皮中的黏液分泌細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)含有大量黏液顆粒，分泌的黏蛋白附著于腸道黏膜上，對(duì)腸道起到保護(hù)和潤(rùn)滑的作用。肥大細(xì)胞則參與了腸黏膜的免疫調(diào)節(jié)，當(dāng)其被外界病原刺激活化后，大量釋放炎癥介質(zhì)，分泌免疫細(xì)胞因子，進(jìn)而影響機(jī)體發(fā)生多種免疫反應(yīng)[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠月齡增加，腸黏膜上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而肥大細(xì)胞數(shù)量從6月齡之后逐漸減少，在一定程度上說(shuō)明衰老過(guò)程中小鼠小腸黏膜的免疫防御功能降低。

腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接的相關(guān)蛋白是構(gòu)成腸黏膜上皮屏障的重要基礎(chǔ)，由跨膜蛋白和胞質(zhì)蛋白組成，其中跨膜蛋白主要有Occludin蛋白、Claudin蛋白、緊密連接分子等；胞質(zhì)蛋白主要有ZO-1、ZO-2等蛋白。一旦緊密連接蛋白數(shù)量和分布發(fā)生變化，則說(shuō)明腸黏膜緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞，腸黏膜通透性增加[16]。本研究結(jié)果顯示，Occludin蛋白6月齡組表達(dá)最多，且隨月齡升高而表達(dá)降低。衰老過(guò)程中，腸道可表現(xiàn)出一種慢性、低度的炎癥狀態(tài)[17]，相關(guān)炎癥因子表達(dá)的增加可引起Occludin蛋白表達(dá)的減少、結(jié)構(gòu)受損、腸黏膜通透性增加，屏障功能降低[18]。

綜上所述，衰老過(guò)程中小鼠小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變，上皮淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞數(shù)量減少，緊密連接Occludin蛋表達(dá)量減少，這些變化都與老年人消化道疾病發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。因此，深入研究機(jī)體衰老過(guò)程中小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫功能的變化及發(fā)生機(jī)制具有重大意義。