苯丙氨酸取代的絲氨酸八聚體離子的紅外光解離光譜及其在手性分析中的應(yīng)用

任 娟，馬 媛，李樹奇，孔祥蕾,2*

(1.南開大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 元素有機化學(xué)國家重點實驗室，天津 300071;2.南開大學(xué) 天津化學(xué)化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300071)

與傳統(tǒng)色譜法及其他方法相比，基于質(zhì)譜的手性分析方法具有分析速度快、樣品用量少、靈敏度高等優(yōu)勢，近年來受到了人們的廣泛關(guān)注[1-15]。而各種軟電離方法的發(fā)展，尤其是電噴霧電離(ESI)的廣泛應(yīng)用，極大地促進了質(zhì)譜技術(shù)在手性分析中的應(yīng)用[3-8]。電噴霧電離方法可在氣相中產(chǎn)生非共價復(fù)合離子，從而為對映異構(gòu)體提供手性環(huán)境。常用的基于質(zhì)譜的手性區(qū)分方法主要有3種：①廣泛使用的動力學(xué)方法，即通過比較非對映體復(fù)合離子碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜的碎裂模式差異實現(xiàn)手性分析[2-8]；②比較相對豐度法，即測量由分析物和特定參照分子形成的非對映異構(gòu)配合物離子的相對豐度[9]；③主客體交換反應(yīng)法，即研究非對映異構(gòu)主客體復(fù)合物與中性試劑(客體)反應(yīng)的交換速率[10-11]。

近年來，電噴霧質(zhì)譜-紅外解離光譜(ESI MS-IRPD)在手性分析中得到了快速發(fā)展[14-15]。該技術(shù)結(jié)合了電噴霧質(zhì)譜和紅外光譜的優(yōu)點，通過電噴霧方法產(chǎn)生一系列氣相離子，利用不同的質(zhì)譜儀實現(xiàn)離子的選擇和囚禁后，引入可調(diào)諧紅外激光，當(dāng)具有連續(xù)波長的紅外激光照射目標(biāo)離子時，通過觀察產(chǎn)物離子的相對強度或母體離子的衰減可得到相應(yīng)的紅外解離光譜，從而能夠提供相應(yīng)的離子結(jié)構(gòu)信息，并利用其光譜和質(zhì)譜的差異實現(xiàn)手性區(qū)分。

而利用質(zhì)譜-紅外多光子解離光譜法的前提則是相應(yīng)非對映異構(gòu)體復(fù)合物離子的產(chǎn)生，即必須為待分析的手性分子在氣相中提供一個有效的手性環(huán)境。在氨基酸類的手性分子分析方面，絲氨酸八聚體離子極具代表性。Cooks等[16]最早在電噴霧質(zhì)譜中觀察到一種特殊的幻數(shù)團簇離子——質(zhì)子化的絲氨酸八聚體。研究發(fā)現(xiàn)該團簇離子存在顯著的同手性優(yōu)勢，這種特殊的幻數(shù)團簇離子極易發(fā)生取代反應(yīng)，且取代后的絲氨酸八聚體仍存在同手性優(yōu)勢[17-19]。本課題組曾利用ESI-IRPD技術(shù)分別研究了脯氨酸與蘇氨酸取代的絲氨酸八聚體的手性效應(yīng)，并根據(jù)得到的紅外解離質(zhì)譜圖與紅外解離光譜圖實現(xiàn)了相應(yīng)取代團簇離子中取代單元的手性區(qū)分，對兩種氨基酸取代的絲氨酸八聚體的結(jié)構(gòu)有了新的認(rèn)識[14-15]。本文基于傅立葉變換離子回旋共振(FT ICR)質(zhì)譜儀和ESI-IRPD研究平臺對苯丙氨酸取代的絲氨酸八聚體團簇離子的質(zhì)譜和紅外解離光譜進行了研究，通過比較光譜圖在某些波數(shù)處的差異成功實現(xiàn)了同手性和異手性取代團簇的手性區(qū)分。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

絲氨酸(Ser)、苯丙氨酸(Phe)(色譜純，Sigma公司)，甲醇(色譜純，J.T.Baker公司)，乙酸(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

分別配制50 mmol/L的L-Ser溶液與20 mmol/L的L/D-Phe溶液，取一定體積進行混合后，稀釋為含0.5 mmol/LL/D-Phe和3 mmol/LL-Ser的混合溶液，混合溶液的溶劑體積比為H2O∶MeOH∶CH3COOH=49∶49∶2，將混合溶液振蕩10 min，混勻后儲存于冰箱冷藏室中備用。

1.2 儀器條件及實驗方法

所有的質(zhì)譜實驗均在7.0 T傅立葉變換離子回旋共振(FT ICR)質(zhì)譜儀上進行(IonSpec,Varian,Lake Forest,CA,USA)。所有離子均通過電噴霧電離(ESI)離子源產(chǎn)生，其中ESI源噴針的電壓為3.6 kV。為使ESI電離過程比較溫和，實驗中源內(nèi)加熱溫度設(shè)為60 ℃，低于一般ESI實驗溫度(80 ℃)。樣品溶液的流速為1 μL/min。ESI產(chǎn)生的離子經(jīng)由四極桿離子傳導(dǎo)裝置，最終被引入FT ICR分析池中進行檢測。質(zhì)譜檢測均采用正離子模式,探測范圍為m/z200～2 000。將傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀與可調(diào)諧的OPO激光器等光學(xué)器件搭建成ESI-IRPD的研究平臺，以獲得相應(yīng)體系的紅外解離光譜[20]。實驗中將激光器發(fā)射的紅外激光射入FTICR MS 圓形洞孔的分析池中。OPO激光器(Msquared公司的Firefly-IR激光器)覆蓋的波數(shù)范圍為2 700～4 000 cm-1，因此能提供O—H、N—H和C—H等的紅外特征吸收信息。[L-Ser6+L-Phe2]H+激光輸出功率和線寬分別為200 mW和5 cm-1，使用機械快門控制激光照射時間。波長的光譜強度計算公式：I=-ln(Ip/(∑If+Ip))，其中Ip和If分別為母離子和碎片離子的強度[14-15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 ESI質(zhì)譜

圖1為Ser/Phe混合溶液的ESI質(zhì)譜圖，由圖可知，(L-Ser)8H+與L、D-Phe均發(fā)生了取代反應(yīng)，主要生成了一、二取代產(chǎn)物，但L-Phe與D-Phe的離子信號分布存在明顯差異，如L-Phe與(L-Ser)8H+發(fā)生取代反應(yīng)后相對強度最高的離子由(L-Ser)8H+變?yōu)閇L-Ser7+L-Phe1]H+(圖1A)，而在D-Phe的取代結(jié)果中，(L-Ser)8H+仍為強度最高的離子(圖1B)。從兩者的離子分布差異可知(L-Ser)8H+與同手性的L-Phe更容易發(fā)生取代反應(yīng)，即苯丙氨酸取代的絲氨酸八聚體團簇具有顯著的同手性優(yōu)勢，這與文獻報道的脯氨酸、蘇氨酸以及其它氨基酸分子取代的實驗結(jié)果相同[14,16]。

2.2 IRPD質(zhì)譜與光譜

為進一步研究不同手性的苯丙氨酸取代的絲氨酸八聚體的結(jié)構(gòu)和特征，本實驗將激光器輸出激光的波數(shù)調(diào)至3 110 cm-1，分別對4種取代團簇離子照射20 s，得到各自的紅外解離質(zhì)譜圖(見圖2)。首先對單一苯丙氨酸取代后團簇離子的解離結(jié)果進行比較(見2A、B)，可看出同手性和異手性團簇離子產(chǎn)生的碎片離子及其分布大體相似，兩者解離均形成了[Sern+Phe1]H+(n=1～4)，且[Ser1+Phe1]H+的相對強度最高，說明單一苯丙氨酸取代的同手性和異手性團簇離子在紅外激光照射后，丟失若干Ser單元并形成[Ser4+Phe1]H+，然后再連續(xù)丟失1個Ser單元，直至得到最終的[Ser1+Phe1]H+；但兩者仍有細(xì)微不同，在同手性團簇的解離碎片中觀察到較弱的[Ser5+Phe1]H+，而在單一D-苯丙氨酸取代的團簇中并未觀察到該離子，可能提示[L-Ser5+L-Phe1]H+較[L-Ser5+D-Phe1]H+有著更好的穩(wěn)定性，但也可能是來自于L-或D-苯丙氨酸取代的八聚體在解離通路上存在的細(xì)微差別。

圖2 [L-Ser7+L-Phe1]H+(A)、[L-Ser7+D-Phe1]H+(B)、[L-Ser6+L-Phe2]H+(C)及[L-Ser6+D-Phe2]H+(D)的紅外解離質(zhì)譜圖
Fig.2 IRPD mass spectra of [L-Ser7+L-Phe1]H+(A)，[L-Ser7+D-Phe1]H+(B)，[L-Ser6+L-Phe2]H+(C) and [L-Ser6+D-Phe2]H+(D)laser wavelength：3 110 cm-1；irradiation time：20 s

在苯丙氨酸二取代離子的光解離質(zhì)譜圖中(2C、D),可發(fā)現(xiàn)同手性和異手性團簇也出現(xiàn)了不同的解離碎片，兩者首先丟失Ser2單元形成[Ser4+Phe2]H+，其后連續(xù)丟失Ser單元直至全部丟失，最終得到Phe2H+，此后同手性與異手性團簇離子的解離路徑出現(xiàn)差異，同手性的二取代離子出現(xiàn)1個丟失Phe單元的碎片，即[Ser1+Phe1]H+，而在異手性團簇中未觀察到該碎片?；诙〈x子解離碎片的差異，可實現(xiàn)同手性和異手性苯丙氨酸取代的絲氨酸八聚體團簇離子的手性區(qū)分。

與前期報道的脯氨酸和蘇氨酸的取代結(jié)果比較，本實驗發(fā)現(xiàn)3種氨基酸的單一取代的同手性和異手性團簇離子的解離碎片和解離路徑相似，而二單元取代的團簇離子卻存在明顯差異。在脯氨酸取代的團簇離子中，只出現(xiàn)丟失Ser單元的碎片，碎片離子種類單一[14]；在苯丙氨酸取代體系中，解離路徑除了丟失Ser單元，還出現(xiàn)了丟失Phe的情況，但這種解離路徑所占比例很小，只有[Ser1+Phe2]H+丟失1個Phe形成[Ser1+Phe1]H+；而在蘇氨酸體系中，幾乎每一種[Sern+Thr2]H+(n=1～4)碎片離子均會丟失Thr單元，碎片離子的種類非常豐富[15]。此現(xiàn)象可歸因于4種氨基酸的質(zhì)子親和勢的差異，絲氨酸的質(zhì)子親和勢為217.3 kcal/mol，而在取代的3種氨基酸中，脯氨酸最高(為224.0 kcal/mol)，苯丙氨酸次之(為220.6 kcal/mol)，蘇氨酸最低(為218.7 kcal/mol)，這3種氨基酸的質(zhì)子親和勢均比絲氨酸高，所以在這3種取代體系中均存在丟失中性Ser單元的解離路徑，且該解離路徑為主要解離路徑，而隨著絲氨酸與取代氨基酸的質(zhì)子親和勢差值減小，丟失質(zhì)子親和勢較高的取代氨基酸單元的路徑逐漸占優(yōu)勢。此外，3種取代體系結(jié)構(gòu)的差異也可能是造成解離路徑不同的主要原因。

圖3 [L-Ser8]H+(A)、[L-Ser7+D/L-Phe1]H+(B)及[L-Ser6+D/L-Phe2]H+(C)的紅外解離光譜圖Fig.3 IRPD spectra of [L-Ser8]H+(A),[L-Ser7+D/L-Phe1]H+(B)and [L-Ser6+D/L-Phe2]H+(C)laser wavelength：2 700～3 600 cm-1

通過調(diào)諧輸出激光的波長，最終可獲得苯丙氨酸取代的絲氨酸八聚體在2 700～3 600 cm-1范圍內(nèi)的紅外解離光譜圖(圖3)。與其他氨基酸取代體系類似，在2 800～3 250 cm-1范圍內(nèi)所有的苯丙氨酸取代團簇離子均觀察到強烈的吸收峰。此外，在3 335、3 425、3 465 cm-1等波數(shù)處也存在規(guī)律性變化，如3 335 cm-1吸收峰在單一取代的同手性和異手性團簇中全部消失，但在二取代的同手性團簇中仍存在；3 425 cm-1的吸收峰在單一取代的同手性團簇中存在，在異手性團簇中藍(lán)移至3 465 cm-1；而在二單元取代的光譜圖中，可觀察到同手性團簇離子的3 425 cm-1吸收峰略微紅移，而在異手性團簇離子中由于取代效應(yīng)的作用使得3 465 cm-1處的吸收峰明顯展寬。

根據(jù)這些光譜的差異，可快速實現(xiàn)苯丙氨酸一、二取代的同手性和異手性的絲氨酸八聚體團簇離子的手性區(qū)分，也可以通過選擇合適的激光波長，利用光解離質(zhì)譜快速實現(xiàn)單元的手性區(qū)分。從圖3可知，對于二單元取代的團簇離子，其光解離光譜在2 780～2 830 cm-1存在差別，[L-Ser6+L-Phe2]H+的光譜強度明顯強于[L-Ser6+D-Phe2]H+。這一差別在對于波段的光解離質(zhì)譜中更容易體現(xiàn)。圖4顯示，激光波長在2 805 cm-1處時，[L-Ser6+L-Phe2]H+的光解離碎片強度明顯優(yōu)于[L-Ser6+D-Phe2]H+，而產(chǎn)生的碎片[Ser+Phe]H+并未在[L-Ser6+D-Phe2]H+的光解離質(zhì)譜被觀察到，體現(xiàn)出手性取代單元給體系帶來結(jié)構(gòu)上的差異。值得注意的是，盡管在相同的實驗條件下對此體系進行了多次實驗，其光譜也獲得了較好的重復(fù)性，但考慮到絲氨酸八聚體本身結(jié)構(gòu)中存在的多態(tài)性[19]，一些重要的實驗條件(如溶劑、離子源的結(jié)構(gòu)和參數(shù))對實驗結(jié)果的影響需受到重視。

3 結(jié) 論

本文通過電噴霧電離的方法經(jīng)傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀產(chǎn)生了不同手性的苯丙氨酸取代的絲氨酸八聚體團簇離子，并結(jié)合IRPD技術(shù)對這些團簇離子的紅外解離光譜與手性效應(yīng)進行了研究。通過比較各自的ESI質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)在兩種取代團簇中均存在顯著的手性優(yōu)勢，即絲氨酸八聚體可將其所具有的手性優(yōu)勢傳遞給苯丙氨酸，同時對各自的光解離路徑進行了初步探究。實驗分別得到2種取代團簇離子在2 700～3 600 cm-1范圍內(nèi)的紅外解離光譜，通過比較光譜圖在某些波數(shù)處的差異成功實現(xiàn)了同手性和異手性取代團簇的手性區(qū)分。其對應(yīng)的紅外解離光譜變化反映了取代效應(yīng)的存在，同時也反映了ESI-IRPD方法在研究非共價復(fù)合物大分子結(jié)構(gòu)方面的特點，從而為手性分子的識別提供了新的思路和方法。