烏頭酸基多色熒光碳點的制備及其分析應用

趙鳳姣，千佳麗，孫圓圓，王兆彥，周 雷*

(1.蘭州大學 化學化工學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學 藥學院，甘肅 蘭州 730000)

作為一種新興的碳納米材料，碳點(CDs)具有優(yōu)良的光學性質(zhì)、較好的生物相容性和低的細胞毒性[1-3]，在生物成像、疾病診斷、化學傳感和光催化等領(lǐng)域具有廣闊的應用前景[4-8]。近年來，碳點的制備與應用受到科研工作者的廣泛關(guān)注[9-10]。然而，目前報道的碳點的量子產(chǎn)率偏低且熒光多為藍色，嚴重限制了此類材料的應用。因此，提高碳點的量子產(chǎn)率并調(diào)控其發(fā)射波長是該領(lǐng)域亟待解決的問題。

以小分子為前驅(qū)體采用“自下而上”法制備的碳點通常能獲得較高的量子產(chǎn)率。其中以檸檬酸為前驅(qū)體，通過改變共摻雜試劑制備的系列碳點具有優(yōu)異的量子產(chǎn)率[11-18]，相對量子產(chǎn)率最高可達94%[14]。研究推測，檸檬酸基碳點的形成首先是檸檬酸分子中的3個羧基與氨基形成聚合物中間體，隨后進一步碳化生成熒光碳點[11,19-20]；也有研究者認為，檸檬酸分子在一定條件下能自組裝形成層狀結(jié)構(gòu)，然后通過分子間脫水形成碳點[12,14-16,18,21-22]。檸檬酸基碳點雖然量子產(chǎn)率較高，但其所發(fā)射的熒光多為藍色，盡管可以通過改變激發(fā)波長調(diào)控碳點的發(fā)射波長，但該方法獲得的長波長發(fā)射的量子產(chǎn)率急劇下降，嚴重影響了此類碳點在生物學領(lǐng)域的應用[23-26]。因此，研究者通過改變不同的前驅(qū)體，以獲得不同發(fā)射波長的碳點[27-28]；或通過控制碳點粒徑大小和表面的氧化程度來調(diào)控其熒光發(fā)射[29]。粒徑大小、表面狀態(tài)、摻雜元素等因素均會影響碳點的量子產(chǎn)率和發(fā)射波長，但上述因素如何影響碳點的熒光性質(zhì)，至今尚無明晰的理論解釋?；诖?，發(fā)展新型的長波長碳點以及研究總結(jié)碳點的發(fā)射波長調(diào)控理論很有必要。

與檸檬酸相比，烏頭酸(AA)的分子骨架中存在1個不飽和的碳碳雙鍵，因而推測其是一種更為理想的碳點前驅(qū)體[30-31]。本實驗以烏頭酸為碳源，通過組合碳點制備中最常用的共摻雜試劑(乙二胺(EDA)或尿素(Urea))和碳化方法(水熱法或微波法)，分別制得4種光學性質(zhì)優(yōu)良的碳點(AA&EDA-HT-CDs、AA&EDA-MW-CDs、AA&Urea-HT-CDs、 AA&Urea-MW-CDs)。其中3種碳點發(fā)射藍色熒光，1種發(fā)射黃色熒光。本實驗選定藍色熒光碳點中量子產(chǎn)率最高的AA&EDA-HT-CDs 和黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs為對象，系統(tǒng)研究了其光學性質(zhì)和形貌特征，并考察了其在分析化學中的應用潛力。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

烏頭酸(98%,Alfa-Aesar公司)；乙二胺(99%,天津百世化工有限公司)；尿素(99%,天津光復化工有限公司)。其他試劑均為市售分析純，實驗用水為超純水，所有試劑未經(jīng)純化直接用于實驗。

家用微波爐(700 W,Midea公司)。碳點的紫外可見吸收光譜由UV 2800SPC分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)測量，熒光光譜由F97Pro熒光分光光度計(上海棱光技術(shù)有限公司)測量，測試時使用石英比色皿(10 mm×10 mm)。碳點的絕對量子產(chǎn)率及熒光壽命通過FLS920光譜儀(Edinburgh Instruments，U.K.)測定。透射電子顯微鏡照片用Tecnai F30(荷蘭)拍攝，加速電壓為200 kV。紅外光譜用傅立葉變換紅外光譜儀(NEXUS 670，Nicolet)進行測定。碳點的元素組成由Vario EL元素分析儀(Elementar，Germany)測定。粒徑分布通過BI-200SM動態(tài)光散射儀(Brookhaven，USA)進行測定。X-射線光電子能譜用X-射線光電子能譜儀(XPS，PHI 5702)進行測定。RT-6100酶標分析儀(深圳雷杜生命科學股份有限公司)和激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV-1000，405 nm，Japan)用于細胞毒性(MTT法)實驗和細胞成像實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1水熱法制備烏頭酸基碳點將0.087 1 g烏頭酸和100.4 μL 乙二胺或0.225 1 g尿素溶于5 mL水中，反應溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯水熱合成釜中，置于烘箱中于180 ℃下反應5 h。反應完成后自然冷卻至室溫，將反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在真空干燥箱中50 ℃條件下干燥8 h，得棕色粉末固體產(chǎn)物，分別命名為AA&EDA-HT-CDs和AA&Urea-HT-CDs。

1.2.2微波法制備烏頭酸基碳點將0.087 1 g烏頭酸和100.4 μL 乙二胺或0.360 4 g尿素溶于盛有5 mL水的錐形瓶中，將錐形瓶置于微波爐內(nèi)，700 W功率下加熱6 min或5 min。錐形瓶中的無色澄清溶液轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚腆w即表示熒光碳點生成。將錐形瓶置于真空干燥箱中50 ℃下干燥2 h，冷卻至室溫后將固體研磨成均勻的粉末用于后續(xù)實驗，分別命名為AA&EDA-MW-CDs和AA&Urea-MW-CDs，其中AA&Urea-MW-CDs用反相硅膠柱進一步純化。

1.2.3烏頭酸基熒光碳點的細胞毒性實驗細胞毒性用MTT 法進行評價：將肝癌細胞SMMC-7721接種在盛有RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute-1640)培養(yǎng)基(100 μL/孔，5%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)的96孔板中(約104個細胞/孔)，在5% CO2、37 ℃下于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。18 h后，向96孔板的實驗組中加入適當濃度的碳點溶液，使其最終濃度由上到下依次為1 500、1 000、500、250、125 mg/L；對照組細胞培養(yǎng)過程中未加碳點溶液，于5% CO2、37 ℃下繼續(xù)孵育36 h。隨后更換新的培養(yǎng)基并向每孔加入10 μL的噻唑藍(MTT，5 g/L)繼續(xù)孵育4 h。除去培養(yǎng)基后，向各孔中加入100 μL DMSO并振蕩搖勻，10 min內(nèi)用酶標儀測定 490 nm 處的吸光度，依據(jù)下式計算并評估碳點對肝癌細胞的影響狀況：Cell Viability(%)=ODTreated/ODControl×100%，其中,ODTreated為加入碳點的實驗組的吸光度；ODControl為未加碳點的對照組的吸光度。

1.2.4烏頭酸基熒光碳點的細胞成像實驗將肝癌細胞SMMC-7721接種在盛有RPMI-1640培養(yǎng)基(1 mL/孔)的12孔板中(約含有106個細胞)，在5% CO2、37 ℃下于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。向12孔板中加入適當濃度的AA&EDA-HT-CDs(800 mg/L)和AA&Urea-MW-CDs(800 mg/L)溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h后，棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖溶液(PBS，10 mmol/L，pH 7.4)沖洗3次，用激光共聚焦顯微鏡采集成像結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 烏頭酸基碳點的熒光性能

以烏頭酸為碳源，乙二胺或尿素為共摻雜試劑，通過水熱法和微波法分別制得3種藍色熒光碳點(AA&EDA-HT-CDs、AA&EDA-MW-CDs、AA&Urea-HT-CDs)和1種黃色熒光碳點(AA&Urea-MW-CDs)。4種烏頭酸基碳點的制備條件列于表1，后續(xù)實驗以藍色熒光碳點中量子產(chǎn)率最高的AA&EDA-HT-CDs和黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs為研究對象。在自然光下，AA&EDA-HT-CDs和AA&Urea-MW-CDs的水溶液均澄清透明；在紫外燈(365 nm)下，AA&EDA-HT-CDs溶液發(fā)射出明亮的藍色熒光(圖1A插圖)，而AA&Urea-MW-CDs溶液呈黃色熒光(圖1B插圖)。在固體狀態(tài)下，AA&EDA-HT-CDs在紫外燈下無熒光，而AA&Urea-MW-CDs在紫外燈下也能發(fā)射黃色熒光。由熒光光譜圖可見，AA&EDA-HT-CDs的最佳激發(fā)波長為360 nm，最佳發(fā)射波長為441 nm，且譜線的半寬度較窄，僅為60 nm。其發(fā)射波長在激發(fā)波長由320 nm逐漸增至400 nm的過程中保持不變(圖1A)，顯示出激發(fā)不依賴的光學性質(zhì)。AA&Urea-MW-CDs的最佳激發(fā)波長為415 nm，最佳發(fā)射波長為525 nm。在激發(fā)波長由380 nm逐漸增至460 nm的過程中，其發(fā)射波長出現(xiàn)微弱紅移(圖1B)。通過絕對法測得AA&EDA-HT-CDs和AA&Urea-MW-CDs的量子產(chǎn)率分別為57%和44%。紫外可見吸收光譜顯示，4種碳點在245 nm附近均有吸收，這是由于碳核中心存在π-π*躍遷。此外，黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs還在325 nm和410 nm處有吸收，而藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs僅在350 nm處有吸收(圖1)。

表1 烏頭酸基熒光碳點的制備條件及光學性質(zhì)Table 1 Preparation conditions and fluorescence properties of aconitic acid derived CDs

圖1 AA&EDA-HT-CDs(A)和AA&Urea-MW-CDs(B)的熒光光譜及紫外可見吸收光譜(黑線)
Fig.1 Fluorescence spectra and UV-Vis absorption spectra(black line) for AA&EDA-HT-CDs(A) and AA&Urea-MW-CDs(B)insert:photographs of AA&EDA-HT-CDs and AA&Urea-MW-CDs under daylight(left) and UV lamp(right，365 nm)，respectively

4種烏頭酸基碳點的最佳激發(fā)/發(fā)射波長、量子產(chǎn)率(QY)及熒光壽命(τ)見表1。由表可知，摻雜試劑和碳化方法均會對碳點的熒光性質(zhì)產(chǎn)生影響。就量子產(chǎn)率而言，乙二胺作為摻雜試劑所得碳點的量子產(chǎn)率整體高于尿素作為摻雜試劑的碳點。此外，以乙二胺作為摻雜試劑時，制備方法對碳點的熒光波長無顯著影響，但水熱法制得碳點的量子產(chǎn)率高于微波法。而以尿素作為摻雜試劑時，相比于水熱法，微波法制得的碳點熒光波長顯著紅移，且量子產(chǎn)率更高。4種碳點的時間分辨熒光信號均為雙指數(shù)衰減模式，黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs的兩個熒光壽命占比相差不大，分別為60.32%(4.53 ns)和39.68%(8.26 ns)。而對于另外3種藍色熒光碳點，兩個熒光壽命中的一個占比超過90%，表明雖然存在兩條電子躍遷路徑，但其中一條路徑占絕對優(yōu)勢。綜上，4種碳點表現(xiàn)出不同的熒光性質(zhì)，其原因可能是由于微波法制備碳點的過程中加熱速度較快，所得碳點表面產(chǎn)生了更多的缺陷，這些缺陷為電子的轉(zhuǎn)移提供了多條路徑。

2.2 烏頭酸基碳點的結(jié)構(gòu)表征

采用透射電鏡(TEM)、傅立葉紅外光譜(FTIR)、X-射線光電子能譜(XPS)等多種技術(shù)對藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs和黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs的結(jié)構(gòu)特征進行表征。由TEM照片(圖2)可見，AA&EDA-HT-CDs和AA&Urea-MW-CDs均近似球形且具有良好的分散性，平均粒徑分別為1.6 nm和3.6 nm。粒徑統(tǒng)計結(jié)果則顯示，水熱法制備的碳點具有更均一的粒徑。4種碳點的元素分析結(jié)果列于表2。與藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs相比，黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs具有更高含量的氮元素和較低含量的氫元素，其原因可能是使用了不同的制備方法和共摻雜試劑，導致各碳點在元素種類及含量上的差異。

CDsCNHO(Calculated)AA&EDA-HT-CDs27.6411.454.0156.90AA&EDA-MW-CDs47.7318.636.4527.19AA&Urea-HT-CDs38.4914.935.8240.76AA&Urea-MW-CDs31.0332.442.6733.86

圖3 AA&EDA-HT-CDs及AA&Urea-MW-CDs的紅外光譜圖Fig.3 FTIR spectra of AA&EDA-HT-CDs and AA&Urea-MW-CDs

2.3 烏頭酸基碳點的離子響應特性

由于烏頭酸基碳點的表面含有豐富的含氧和含氮基團，易與某些金屬離子絡合，導致碳點的熒光猝滅，據(jù)此可設(shè)計某些特定金屬離子的傳感測定方法。為評價烏頭酸基碳點應用于分析領(lǐng)域的潛力，考察了溶液pH值和離子強度對碳點熒光的影響，結(jié)果顯示，在強酸或強堿條件下，4種碳點溶液均出現(xiàn)熒光猝滅，但在溶液pH 5.0～10.0范圍內(nèi)，4種碳點的熒光強度均保持穩(wěn)定。此外，4種碳點在不同濃度NaCl溶液中的熒光強度基本保持不變。這些特性預示了烏頭酸基熒光碳點在生命分析領(lǐng)域具有潛在的應用價值。選擇 Li+、K+、Ag+、Pb2+、Ba2+、Cd2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Hg2+、Cr3+、Fe3+、Al3+共18種常見的金屬離子作為研究對象，篩查了所制備4種碳點的離子響應特性，金屬離子濃度均為60 μmol/L。結(jié)果顯示，AA&Urea-HT-CDs對Hg2+有較強的響應，對Fe3+也有一定的響應；AA&EDA-MW-CDs對Hg2+有較強的響應，但其熒光猝滅程度與AA&Urea-HT-CDs相比稍弱；而另兩種碳點對18種金屬離子均無響應。金屬離子通常會與碳點表面的基團相互作用而導致碳點的熒光猝滅[5]，據(jù)此可以認為，4種碳點的不同離子響應特性來源于其表面基團的差異，這與FTIR和XPS表征的結(jié)論一致。在此基礎(chǔ)上，基于AA&EDA-MW-CDs發(fā)展了環(huán)境水體中Hg2+的測定方法[30]。

2.4 烏頭酸基碳點的細胞成像實驗

進行細胞染色實驗前，采用MTT實驗評估了藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs和黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs對肝癌細胞(SMMC-7721)生長的影響(圖6A、C)，結(jié)果表明，經(jīng)兩種碳點孵育的細胞均未出現(xiàn)明顯的死亡或形態(tài)變化，說明烏頭酸基碳點具有較好的生物相容性。細胞成像實驗顯示，兩種碳點均能很好地進入細胞，實現(xiàn)細胞的染色(圖6B、D)。對比成像實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs僅分布在細胞質(zhì)中，而黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs可部分進入細胞核。進一步研究了不同濃度的AA&Urea-MW-CDs孵育細胞后的成像情況，結(jié)果顯示，較低濃度的AA&Urea-MW-CDs孵育細胞后，細胞核染色現(xiàn)象不明顯，但隨著碳點濃度的增加，細胞核中的熒光信號逐漸增強，說明AA&Urea-MW-CDs具有細胞核染色能力。通常而言，粒徑小于8 nm，且能夠與核酸和染色質(zhì)發(fā)生相互作用的納米顆粒才能夠進入細胞核[32]。本實驗中，粒徑較大的AA&Urea-MW-CDs(3.6 nm)比粒徑較小的AA&EDA-HT-CDs(1.6 nm)更易進入細胞核，推測是因為AA&Urea-MW-CDs的表面基團使其更易與核酸和染色質(zhì)發(fā)生相互作用。

3 結(jié) 論

本文以烏頭酸為前驅(qū)體，乙二胺或尿素為共摻雜試劑，分別采用水熱法和微波法，制備了4種光學性質(zhì)優(yōu)良的熒光碳點，其中3種發(fā)射藍色熒光，1種發(fā)射黃色熒光。藍色熒光碳點AA&EDA-HT-CDs 的絕對量子產(chǎn)率為57%，黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs的絕對量子產(chǎn)率為44%，采用多種手段對比研究了此2種碳點的粒徑分布、元素組成以及表面基團等，討論了導致光學性質(zhì)差異的可能原因。并進一步對比研究了4種烏頭酸基碳點的離子響應特性，實驗結(jié)果顯示了碳點表面基團的不同，同時也說明此類碳點具備作為熒光納米探針的潛力。細胞毒性實驗則顯示，所制備的烏頭酸基碳點具有良好的生物相容性，并成功用于細胞染色，尤其是黃色熒光碳點AA&Urea-MW-CDs，初步顯示了其具備細胞核染色的能力。