非小細(xì)胞肺癌患者血清miR-195的表達(dá)及其臨床意義

蔡 靜 候 玥

肺癌的發(fā)病率為腫瘤的首位，嚴(yán)重危害人類的健康，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%～85%，是中國一個重要的公共衛(wèi)生問題，盡管化學(xué)治療方法和手術(shù)技術(shù)的不斷改進(jìn)，但是NSCLC的5年生存率僅約15%[1]，因此，尋找一些高特異性和敏感性的生物標(biāo)記物對NSCLC的早期診斷和惡性疾病的預(yù)后具有重要的臨床意義。微小RNAs(microRANs)是一類由人基因組編碼的長度在19～24個核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA，能通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3-UTR)特異性地堿基互補(bǔ)配對結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA的翻譯抑制或降解，從而廣泛地參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控[2]。miRNAs異常表達(dá)在NSCLC的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[3-4]，近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-195在NSCLC組織和細(xì)胞株表達(dá)降低，意味著miR-195可能為一種腫瘤抑制因子[5]，血清中存在著穩(wěn)定而大量的miRNAs[6]，那么在NSCLC患者血清中miR-195表達(dá)情況如何？為此，本研究主要探討NSCLC患者血清中miR-195的表達(dá)情況及其潛在的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月—2016年4月成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院100例經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為NSCLC患者，其中鱗癌44例，腺癌56例；病理學(xué)分型：高分化37例、中分化33例、低分化30例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例；病理分期：Ⅰ～Ⅱ期60例，Ⅲ～Ⅳ期40例，并選取同期至我院體檢中心體檢的健康者90例為對照組，所有患者術(shù)前均未行任何放化療、生物治療或靶向治療，總體生存時間為在我院確診為NSCLC到死亡時間或隨訪截止時間間隔，隨訪起點(diǎn)為確診日期，隨訪截止2018年4月31日，最長隨訪時間為49個月。所有研究者均簽署知情同意書，并得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的收集與保存 所有研究對象均空腹10 h以上，促凝管收集空腹血樣5 mL，4℃離心(3 000 r/min，15 min)后取上清，分裝上清于去RNA酶的EP管中并保存于-80℃冰箱中。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR法測定血清miR-195的表達(dá) 按照Trizol試劑說明書提取總RNA，取總RNA 2 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，參照Gene Bank的基因序列，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成特異性目的基因引物；has-miR-195-5p上游引物5′-CGTAGCAGCACAGAAAT-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGGGT-3′，逆轉(zhuǎn)錄引物5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACGCCAAT-3′，按照TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq TMⅡ試劑盒說明書，采用7500熒光定量PCR儀進(jìn)行模板cDNA含量的測定，以U6作為內(nèi)參照，所得的值以U6標(biāo)化后輸入Excel軟件進(jìn)行分析，具體步驟參照文獻(xiàn)報道[7]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，方差分析兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD)；采用Logistic回歸分析血清miR-195相對表達(dá)量與NSCLC的關(guān)系；繪制ROC曲線確定使用血清miR-195相對表達(dá)量診斷NSCLC的靈敏度和特異度；生存分析采用Log-rank檢驗(yàn)；生存曲線使用Kaplan-Meier法；采用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行單因素和多因素分析探討NSCLC預(yù)后的獨(dú)立影響因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群血清miR-195相對表達(dá)量的比較

與正常人群相比，NSCLC患者血清miR-195相對表達(dá)量降低(7.26±1.61vs. 4.52±1.17，P<0.01)(圖1)。

圖1 兩組人群血清miR-195相對表達(dá)量的比較Figure 1 Comparison of serum miR-195 expression between the control and NSCLC groupsNote：Compared with the control group，*P<0.01.

2.2 不同臨床病理特征NSCLC患者血清miR-195相對表達(dá)量的比較

Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者血清miR-195相對表達(dá)量低于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.01)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清miR-195相對表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.01)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清miR-195相對表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.01)。鱗癌與腺癌不同分化程度、不同性別、年齡、有無吸煙史，患者之間的血清miR-195相對表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 NSCLC患者血清miR-195相對表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清miR-195相對表達(dá)量與NSCLC的關(guān)系

以是否為NSCLC為因變量，以血清miR-195相對表達(dá)量為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，校正年齡、吸煙、病理分期、淋巴轉(zhuǎn)移等因素后，miR-195相對表達(dá)量(OR=0.526，95%CI：0.415～0.697；P=0.007)是NSCLC的保護(hù)因素。

2.4 ROC曲線分析血清miR-195相對表達(dá)量對NSCLC的預(yù)測價值

對血清miR-195相對表達(dá)量進(jìn)行ROC曲線分析以及計算曲線下面積(AUC)，血清miR-195相對表達(dá)量的AUC為0.875(95%CI：0.826～0.923；P=0.004)，截斷值取6.64時，診斷NSCLC靈敏度為87.60%，特異度為68.40%(圖2)。

2.5 NSCLC患者中血清miR-195不同表達(dá)量的生存曲線

以血清miR-195的表達(dá)水平的中位數(shù)(4.38)作為閾值，將100例NSCLC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，血清中高表達(dá)miR-195的NSCLC患者中位生存時間為38.6個月(95%CI：32.3～39.8個月)，明顯長于血清中低表達(dá)miR-195的NSCLC患者組(22.9個月，95%CI：18.5～27.3個月)(P<0.01)(圖3)。

2.6 NSCLC患者預(yù)后的影響因素分析

單因素分析結(jié)果提示病理類型、病理分化、病理分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和血清miR-195表達(dá)量與NSCLC患者預(yù)后明顯相關(guān)(P<0.05)；多因素分析結(jié)果提示病理類型、病理分化、病理分期、淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和血清miR-195表達(dá)量是NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素(表2)。此外，在血清中高表達(dá)miR-195的NSCLC患者中，病理類型(HR=2.674)、病理分化(HR=3.112)、病理分期(HR=3.998)、淋巴轉(zhuǎn)移(HR=3.865)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(HR=3.664)均是NSCLC患者預(yù)后的影響因素；在血清低表達(dá)miR-195的NSCLC患者中，病理類型(HR=2.805)、病理分化(HR=3.167)、病理分期(HR=4.103)、淋巴轉(zhuǎn)移(HR=3.789)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(HR=3.708)均是NSCLC患者預(yù)后的影響因素。

圖2 血清miR-195相對表達(dá)量診斷NSCLC的ROC曲線Figure 2 ROC curve for predicting NSCLC with serum miR-195 expression

圖3 NSCLC患者中血清miR-195高表達(dá)組和低表達(dá)組生存曲線的比較Figure 3 Comparison of survival curves between high expression and low expression of miR-195 groups

CharacteristicsUnivariate analysesHR95% CIPMultivariate analysesHR95% CIPGender1.2940.689～1.6320.473Age1.1850.532～1.4290.517Smoking1.5310.794～1.9970.115Histology2.7361.284～3.9250.0322.1161.205～3.0920.044Pathological grade3.1252.567～4.2230.0112.9951.869～3.8920.019TNM stage4.0122.753～6.6720.0024.1072.795～6.3240.008Lymphatic metastasis3.7942.316～5.6380.0063.6852.126～4.9370.005Distant metastasis3.6692.243～6.0150.0033.5292.216～5.8530.007Serum miR-1950.5530.316～0.8630.0090.6150.324～0.7830.011

3 討論

miR-195位于染色體17p13.1上，是miR-16/15/195/424/497家族中的一員，在腫瘤的形成過程中發(fā)揮重要的作用，Sun等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌組織中，miR-195表達(dá)下調(diào)，其通過抑制YAP1的表達(dá)，進(jìn)而抑制結(jié)腸細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者血清miR-195表達(dá)量低于正常健康者，并且與膽管癌的病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分級和預(yù)后密切相關(guān)；Yan等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌組織和肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中，miR-195表達(dá)均下調(diào)，其通過AEG-1途徑促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞株的增殖；miR-195在胃癌、胰腺癌中表達(dá)也均下調(diào)，故許多學(xué)者認(rèn)為，miR-195為一種抑癌因子。然而，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[11]，miR-195在慢性淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)上調(diào)，故miR-195也可以作為一種致癌因子參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

近年來肺癌的發(fā)病率持續(xù)升高，已躍居惡性腫瘤死因的第1位，而NSCLC占肺癌的大多數(shù)，吸煙、大氣污染、電離輻射、遺傳因素等均是肺癌的危險因素，但是具體病因至今尚不完全明確。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-195在NSCLC組織和細(xì)胞株中表達(dá)降低，并通過多種途徑抑制NSCLC的增殖和遷移侵襲，如miR-195與CHEK1結(jié)合抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12]，miR-195與IGF1R或者細(xì)胞周期蛋白D3結(jié)合抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[13-14]。miRNAs在血清中穩(wěn)定表達(dá)，能抗RNase的降解，反復(fù)凍融后miRNAs含量均無明顯變化，相對于癌組織，血清樣本在臨床工作中比較容易獲得，對病人創(chuàng)傷小，血清miR-195在NSCLC患者中的表達(dá)情況目前研究較少。Zhang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在無吸煙史肺腺癌女性患者中，血漿miR-195的表達(dá)量降低，血漿miR-195表達(dá)量增加能改善肺腺癌的總體生存率。也有研究發(fā)現(xiàn)[16]，與正常對照組相比，NSCLC患者血細(xì)胞中的miR-195相對表達(dá)量降低，本研究結(jié)果與此相一致。本研究發(fā)現(xiàn)與正常人群相比，NSCLC患者血清miR-195表達(dá)量降低。Landi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，腺癌組織中miR-195表達(dá)量高于鱗癌組織，而本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-195相對表達(dá)量在鱗癌和腺癌患者中無明顯差異，在高分化、中分化、低分化患者中也無明顯差異，造成這一結(jié)果的差異可能為人群的選擇及人種的差異等。本研究還發(fā)現(xiàn)，Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者血清miR-195相對表達(dá)量低于Ⅰ～Ⅱ期患者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NSCLC患者血清miR-195相對表達(dá)量低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，進(jìn)一步說明miR-195可能作為抑癌因子抑制NSCLC的增殖和轉(zhuǎn)移。Logistic回歸分析提示，血清miR-195相對表達(dá)量與NSCLC密切相關(guān)，ROC曲線結(jié)果進(jìn)一步表明，當(dāng)血清miR-195相對表達(dá)量為6.64時，其診斷NSCLC的靈敏度為87.60%，特異度為68.40%，表明血清miR-195有望成為診斷NSCLC的潛在分子標(biāo)記物。

miR-195不但與NSCLC的發(fā)病和轉(zhuǎn)移有關(guān)，還與NSCLC的預(yù)后相關(guān)，本研究通過對NSCLC病例的隨訪發(fā)現(xiàn)，血清中高表達(dá)miR-195的NSCLC患者中位生存時間明顯長于血清中低表達(dá)miR-195者，在多因素分析中，校正腫瘤病理分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床分期等因素后，血清miR-195水平是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立影響因素，具體機(jī)制仍需基礎(chǔ)研究及大規(guī)模臨床研究證實(shí)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清miR-195表達(dá)量降低，并且血清miR-195表達(dá)量與NSCLC的分期、有無淋巴轉(zhuǎn)移及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立因子，提示血清miR-195可能作為NSCLC潛在的早期診斷、預(yù)后評價的分子標(biāo)志物。