HLA-G在乳腺癌中的表達(dá)及意義

何 煦 葉尚勉 董丹丹 李 科

乳腺癌是發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤，也是導(dǎo)致女性因?yàn)榘┌Y死亡的最主要原因。全世界每年約120萬(wàn)女性發(fā)生乳腺癌，其中50萬(wàn)女性死于乳腺癌[1]。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，直徑在1 cm以內(nèi)的早期乳腺癌，術(shù)后5年生存率可達(dá)90%以上，如已擴(kuò)散到淋巴結(jié)，5年生存率降為71%，如果出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移，則5年生存率僅為18%[2]。

人類白細(xì)胞抗原G(Human leukocyte antigen，HLA-G)屬于非經(jīng)典HLA-I類白細(xì)胞抗原，在正常生理情況下，HLA-G僅在胎盤的絨毛膜細(xì)胞和其他少量的組織表達(dá)，在分化成熟的正常成人組織中無(wú)表達(dá)。在病理情況下，HLA-G可以在腫瘤、器官移植和自身免疫性疾病等情況下產(chǎn)生[3]。近年來(lái)HLA-G與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以及在腫瘤診斷和預(yù)后中的作用引起廣泛關(guān)注。在本研究中，我們對(duì)HLA-G在乳腺癌患者中的表達(dá)進(jìn)行了分析，并且探討了HLA-G的表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)及生存率之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究HLA-G在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

235例乳腺癌患者為2012—2015年在四川省人民醫(yī)院住院確診的病人，其組織切片取自外科術(shù)后病理組織。病人平均年齡52歲，均未接受術(shù)前化療和放療。病人在術(shù)后均依據(jù)臨床病理標(biāo)準(zhǔn)接受6個(gè)周期的輔助化療，雌激素受體及孕激素受體(ER/PgR)陽(yáng)性的病人在化療后均接受內(nèi)分泌治療。

臨床病理分期分級(jí)按照AJCC和UICC制定的TNM標(biāo)準(zhǔn)，235例乳腺癌病人中，Ⅰ期84人，Ⅱ期52人，Ⅲ期85人，Ⅳ期14人。對(duì)84例病人在治療后進(jìn)行了隨訪，其中15例病人在隨訪過程中發(fā)生死亡，隨訪率為36%。隨訪起始時(shí)間為病人出院后，終止時(shí)間為滿36個(gè)月或者病人死亡，中位隨訪時(shí)間為26個(gè)月(4～36個(gè)月)，隨訪方式為門診或電話隨訪。所有納入病例均為原發(fā)性乳腺癌，轉(zhuǎn)移性乳腺癌未納入，所有病例均為病理診斷結(jié)果。研究還包括23例正常乳腺組織和18例乳腺良性腫瘤切片。

1.2 抗HLA-G單克隆抗體的制備

從人胎盤組織經(jīng)兩個(gè)連續(xù)抗體親和層析柱(抗HLA-G抗體親和層析柱和抗HLA-Gβ2微球蛋白抗體親和層析柱)分離純化獲得天然HLA-G蛋白。然后用天然HLA-G蛋白按標(biāo)準(zhǔn)方法免疫BALA/C小鼠。再用免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2鼠骨髓瘤細(xì)胞株融合成雜交瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法，抗體捕獲酶聯(lián)免疫測(cè)定法和Western blot等方法篩選出一株分泌抗HLA-G單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為HGY[4]。該細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆經(jīng)小鼠抗體分型試劑盒確定為IgG3。實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步證明該抗體結(jié)合位點(diǎn)在HLA-G的1區(qū)域。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

用免疫組織化學(xué)法測(cè)定乳腺癌組織中HLA-G的表達(dá)，組織用福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，抗原修復(fù)，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，加一抗HGY(1∶400)4℃過夜。PBS緩沖液洗3次，加S-P試劑盒，鏡下顯色后，用蘇木素復(fù)染。每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

以癌細(xì)胞膜、細(xì)胞漿和細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色反應(yīng)物判為陽(yáng)性表達(dá)，由兩位病理學(xué)專家在光鏡下判讀結(jié)果，根據(jù)顯色百分比和顯色信號(hào)的強(qiáng)度，將顯色結(jié)果分為四級(jí)：(-)組織標(biāo)本無(wú)染色；(+)陽(yáng)性信號(hào)少于25%的癌癥組織，和/或顯色信號(hào)弱；(++)陽(yáng)性信號(hào)在25～50%之間，和/或信號(hào)強(qiáng)度中等；(+++)陽(yáng)性信號(hào)多于50%，和/或顯色為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4 宿主免疫反應(yīng)評(píng)估

本研究采用乳腺癌病人腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量評(píng)估宿主的免疫反應(yīng)。在5個(gè)高倍視野下，計(jì)數(shù)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞數(shù)目，根據(jù)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，將宿主免疫反應(yīng)評(píng)分為強(qiáng)(+++)、中(++)、弱(+)，分別計(jì)分為3分，2分和1分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 18.0軟件包，HLA-G表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，生存資料分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)。建立Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，確定影響生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，P<0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中HLA-G的表達(dá)

本研究采用免疫組化的方法對(duì)235例乳腺癌組織切片研究，發(fā)現(xiàn)66%(155/235)的病例有HLA-G蛋白的表達(dá)，其中64%(99/155)為弱表達(dá)(+)，36%(56/155)為強(qiáng)表達(dá)(+++)或中度表達(dá)(++)，HLA-G蛋白在正常乳腺組織和癌旁組織則無(wú)表達(dá)(圖1)。

圖1 乳腺癌及正常乳腺組織中HLA-G的表達(dá)(100×)Figure 1 The expression of HLA-G in breast cancer and normal breast tissues by immunohistochemistry(100×)Note：A.Strong HLA-G expression in breast cancer；B.No HLA-G expression in normal breast tissues.

2.2 HLA-G在乳腺癌的表達(dá)與病人臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)HLA-G的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移以及疾病分期有關(guān)(P<0.05)，但是與年齡、腫瘤類型、腫瘤浸潤(rùn)程度、組織分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)(表1)。

2.3 HLA-G在乳腺癌的表達(dá)與宿主免疫反應(yīng)的關(guān)系

HLA-G表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性的區(qū)域淋巴細(xì)胞少，而HLA-G表達(dá)陰性的區(qū)域有大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。HLA-G(-)病人中，約有66%(53/80)宿主免疫反應(yīng)為強(qiáng)或中度(++/+++)，HLA-G表達(dá)(+)的病人中，約有63%(63/99)宿主免疫反應(yīng)為強(qiáng)或中度(++/+++)，而HLA-G表達(dá)(++/+++)的病人中，約有83%(47/56)宿主免疫反應(yīng)較弱。HLA-G表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤組織與HLA-G表達(dá)陰性的腫瘤組織相比，淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)被明顯抑制(圖2)。分析HLA-G的表達(dá)與宿主免疫反應(yīng)的關(guān)系，可見HLA-G表達(dá)(-/+)組與HLA-G表達(dá)(++/+++)組免疫反應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.636，P=0.011)(圖3)。

表1 HLA-G在乳腺癌的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

圖2 HLA-G的表達(dá)與宿主免疫反應(yīng)的關(guān)系(200×)Figure 2 The relationship between HLA-G expression and host immune response(200×)Note：A.Very few lymphocytes in tumors with strong HLA-G expression；B.Numerous lymphocytes in tumors with negative HLA-G expression.

2.4 HLA-G在乳腺癌的表達(dá)與病人生存率之間的關(guān)系

在84例隨訪病例中，17例HLA-G表達(dá)陰性，42例為弱表達(dá)，25例為中等或強(qiáng)表達(dá)。在36個(gè)月隨訪過程中有15例死亡，7例為HLA-G弱表達(dá)或陰性，8例為HLA-G中等或強(qiáng)表達(dá)。HLA-G弱表達(dá)或陰性病例的總生存率高于HLA-G強(qiáng)或中等程度表達(dá)的生存率(88%vs. 68%)(表2，圖4)。Cox預(yù)后多因素分析顯示HLA-G對(duì)乳腺癌病人是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)(HR=10.2，95%CI：5.07～18.20，P=0.006)(表3)。

圖3 HLA-G的表達(dá)與宿主免疫反應(yīng)的關(guān)系Figure 3 The relationship between HLA-G expression and host immune responseNote：*P<0.05，when compared to the HLA-G(-/+)group.

圖4 HLA-G(-/+)及HLA-G(++/+++)乳腺癌病人生存曲線Figure 4 Survival curves of breast cancer patients with HLA-G(-/+)and HLA-G(++/+++)

HLA-G expressionAliveDeadLog-rank testχ2PHLA-G(-/+)88%(52/59)12%(7/59)HLA-G(++/+++)68%(17/25)32%(8/25)4.8330.028

表3 臨床病理學(xué)因素與病人生存率之間的關(guān)系

3 討論

上個(gè)世紀(jì)八十年代末，美國(guó)西雅圖大學(xué)Geraghty實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了一種非經(jīng)典I類白細(xì)胞抗原，稱之為HLA-G。該白細(xì)胞抗原的基因同經(jīng)典I類白細(xì)胞抗原的基因都位于第6對(duì)染色體的短臂上，基因和表達(dá)的產(chǎn)物與經(jīng)典I類白細(xì)胞抗原有86%同源[5]。HLA-G與經(jīng)典I類白細(xì)胞抗原相比，有兩個(gè)重要特點(diǎn)：一是在正常生理情況下，HLA-G僅在胎盤的絨毛膜細(xì)胞和其他少量的組織，如胸腺、角膜和骨髓造血祖細(xì)胞等表達(dá)(HLA-A、-B和-C在幾乎所有的有核體細(xì)胞均有表達(dá))，在母體對(duì)胎兒的免疫耐受起重要作用，在妊娠時(shí)可以保護(hù)胎兒免受母親免疫系統(tǒng)的排斥[6]；二是HLA-G不具有多態(tài)性(經(jīng)典I類白細(xì)胞抗原有96種，536個(gè)等位基因，而HLA-G只有1種，僅有6個(gè)等位基因)[7]。HLA-G具有抑制自然殺傷細(xì)胞(NK)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和抗原遞呈細(xì)胞(APC)的功能，是機(jī)體免疫耐受機(jī)制中重要的調(diào)節(jié)因子[8]。目前，HLA-G對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制功能已經(jīng)得到了證明，它可以與T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面的抑制性受體免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物2(Immunoglobulin-like transcript2，ILT2/CD85j)、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物4(Immunoglobulin-like transcript 4，ILT4/CD85d)和殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR2DL4/CD158d)直接結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)活性[9]。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，HLA-G在大多數(shù)常見惡性腫瘤組織又重新出現(xiàn)表達(dá)[10-11]，本研究結(jié)果表明，乳腺癌病人中有較高比例的病人(66%)出現(xiàn)HLA-G蛋白的表達(dá)，而在正常乳腺組織和癌旁組織則無(wú)表達(dá)。在分析了乳腺癌病人HLA-G的表達(dá)與各項(xiàng)臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系后我們發(fā)現(xiàn)，HLA-G的表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移以及疾病分期有關(guān)，這些結(jié)果提示HLA-G的免疫組織化學(xué)檢測(cè)可作為判斷乳腺癌的一個(gè)輔助診斷指標(biāo)。HLA-G在惡性病變中的異常表達(dá)機(jī)制之一可能是由于惡性轉(zhuǎn)化過程而引起的基因組調(diào)控的改變[12]。

腫瘤在發(fā)生和發(fā)展變化過程中，要表達(dá)一些不同于正常組織的腫瘤抗原，免疫系統(tǒng)對(duì)這些發(fā)生癌變的細(xì)胞有排斥消除的功能，稱之宿主的免疫監(jiān)視。但在已經(jīng)患上癌癥病人的體內(nèi)，癌細(xì)胞明顯地逃過了宿主的免疫監(jiān)視，這種現(xiàn)象稱之為腫瘤的免疫逃逸[13]。研究腫瘤免疫逃逸的機(jī)理則是腫瘤生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)上的一個(gè)重要命題。由于HLA-G是一種免疫抑制分子，能夠抑制免疫應(yīng)答，從而引起腫瘤細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移，因此如果腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)HLA-G的異常表達(dá)，便能更好地解釋腫瘤免疫逃逸機(jī)制。

在研究HLA-G的表達(dá)與宿主免疫反應(yīng)的關(guān)系中我們發(fā)現(xiàn)，HLA-G表達(dá)陽(yáng)性區(qū)域的宿主免疫反應(yīng)較弱于HLA-G陰性區(qū)域，HLA-G表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤組織與HLA-G表達(dá)陰性的病例相比，淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)被明顯抑制，說(shuō)明HLA-G參與了宿主的免疫反應(yīng)，是腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫反應(yīng)的策略之一。另外，HLA-G的表達(dá)與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)，HLA-G陰性病人的生存率明顯高于HLA-G陽(yáng)性病人，也表明HLA-G可通過抑制宿主免疫反應(yīng)，幫助腫瘤細(xì)胞逃避宿主的免疫應(yīng)答，使腫瘤易于發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而使病人生存率降低。

綜上所述，本研究認(rèn)為HLA-G具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，能夠用于乳腺癌的診斷以及預(yù)后的指導(dǎo)和監(jiān)測(cè)，是一個(gè)較為理想的腫瘤標(biāo)志物。