魷魚胴體分離蛋白的制備及營養(yǎng)成分分析

嚴鵬偉，張珊珊，蒲昕怡，包 斌,2，吳文惠,2*

（1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.舟山麥琳生物工程有限公司，浙江舟山 316100）

魷魚，又被稱為槍烏賊、柔魚，屬于軟體動物門，具有快速繁殖、成長所需時間短等特點[1]。魷魚具有高蛋白、低脂肪的特性，且魷魚富含豐富的氨基酸，不僅含有人體所需的必需氨基酸、牛磺酸等，還含有豐富的DHA、EPA 等高不飽和脂肪酸。魷魚中豐富的營養(yǎng)元素不僅提升了其營養(yǎng)價值，還促進了優(yōu)質(zhì)魷魚副產(chǎn)品的開發(fā)。魷魚肉質(zhì)鮮嫩，味道可口，具有相當高的經(jīng)濟價值和食用價值，在當前海洋類產(chǎn)品中具有廣闊的開發(fā)前景。魷魚是中國最重要的海產(chǎn)品之一，近年來我國魷魚的年捕撈量約30 萬t，市場上常見的魷魚品種有秘魯魷魚、阿根廷魷魚、太平洋魷魚等[2]。魷魚產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國漁業(yè)資源中重要的組成部分。

魷魚胴體是魷魚最大的組成部分，其中蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類豐富，是優(yōu)質(zhì)的蛋白來源。魷魚整體的粗蛋白含量較高，約占18%～20%。其中，肌漿蛋白的比例達到12%～20%，肌原纖維蛋白達到77%～85%，而基質(zhì)蛋白約占2%～3%。當?shù)鞍追N類不同時，其中氨基酸的種類與含量也會發(fā)生變化，所以營養(yǎng)價值也有差異[3]。楊憲時等[4]分別對兩種魷魚（日本海魷魚、秘魯魷魚）胴體中的營養(yǎng)成分進行了分析和比較，結(jié)果表明日本海魷魚、秘魯魷魚中蛋白質(zhì)含量達到17.25%，并且兩種魷魚中氨基酸種類達到18 種，其中必需氨基酸占總氨基酸的比例都超過了30%，氨基酸中谷氨酸含量最高，且谷氨酸參與人體腦組織的正常代謝，是人體中不可或缺的氨基酸成分；此外，對兩種魷魚中必需氨基酸按照AAS 模式進行營養(yǎng)分析，分析評價均大于0.5，這表明兩種魷魚胴體中氨基酸含量豐富均衡，符合人體氨基酸需求。JAZAYERI 等[5]對波斯灣魷魚與泰國魷魚的蛋白質(zhì)含量進行了檢測，結(jié)果表明前者含有17%的蛋白質(zhì)，泰國魷魚中含有14.91%的蛋白質(zhì)，地區(qū)間的差異可能會對魷魚的營養(yǎng)成分造成影響。

魷魚蛋白含量高、氨基酸種類豐富的特點，提高了魷魚的生物價值。吳莉敏等[6]研究發(fā)現(xiàn)在魷魚內(nèi)臟的消化液中含有多種氨基酸，如纈氨酸、蛋氨酸及呈味氨基酸等，可制備成風味獨特、高營養(yǎng)價值的海鮮醬油；此外，內(nèi)臟消化液中還具有甘氨酸、谷氨酸等含量較高的氨基酸，這類氨基酸具有促進草蝦進食餌料的作用，可用于開發(fā)蝦類飼料。管雪嬌等[7]研究發(fā)現(xiàn)秘魯魷魚皮中的蛋白含量高，氨基酸種類達到17 種，而且脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸是其特征氨基酸，可用于開發(fā)膠原蛋白。魷魚皮膠原蛋白內(nèi)包含了羥脯氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸，是I 型膠原蛋白，這使得其具備了比較低的過敏性，并且容易被酶解，研究利用價值較高。本研究以阿根廷魷魚、巴特柔魚、太平洋魷魚胴體為原料，使用堿提酸沉的方法從魷魚胴體中提取分離蛋白，通過真空冷凍干燥的方式制備分離蛋白粉末，并對制備的魷魚胴體分離蛋白的功能特性與營養(yǎng)價值進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料與試劑如表1 所示。

1.2 儀器設(shè)備

主要實驗儀器如表2 所示。

表2 主要實驗儀器

1.3 實驗方法

1.3.1 魷魚胴體分離蛋白的制備

冷凍魷魚浸泡在清水中，常溫下解凍，解凍后使用清水沖洗干凈。切除魷魚的頭、足等部位，剝除魷魚表層的薄膜及魷魚皮，抽除魷魚胴體中的骨架，使用清水沖洗幾遍，去除胴體表面的雜質(zhì)。魷魚胴體稱重，按照料液比1 ∶3 分別加入清理好的魷魚胴體和濃度為0.1 mol·L-1的NaOH 水溶液，混合放置7 h。倒去溶液，使用清水將魷魚胴體表面沖洗干凈，先用刀將魷魚切成較小的塊狀，再使用破壁機將魷魚塊處理至肉糜狀態(tài)。按照料液比1 ∶3添加濃度為0.1 mol·L-1的NaOH 水溶液，使用均質(zhì)機均質(zhì)至勻漿狀態(tài)，均質(zhì)后的混合液使用高速冷凍離心機離心，離心機轉(zhuǎn)速為8 000 g、離心25 min。離心后倒出上清液，使用6 mol·L-1的HCl 調(diào)節(jié)上清液pH 至5.5 左右。設(shè)置相同的離心條件，再次離心，收集沉淀，此時沉淀即為分離粗蛋白。魷魚胴體粗蛋白保存在-80 冰箱中，經(jīng)過真空干燥后可獲得魷魚胴體粗蛋白粉末。

1.3.2 SDS-PAGE 電泳分析

為了解提取出的魷魚胴體粗蛋白的蛋白質(zhì)組成情況，使用SDS-PAGE 電泳實驗分析其分離蛋白。本次實驗在LAEMMLI[8]的實驗方法基礎(chǔ)上稍作修改，配制0.1 mol·L-1的醋酸溶液，添加魷魚胴體分離蛋白，調(diào)節(jié)蛋白濃度在1 mg·mL-1，向樣品中加入凝膠上樣緩沖液，混合均勻，沸水浴8 min，離心后吸取清液，上樣量為10 μL。

實驗中保持電壓恒定，前期保持80 V 的電壓，觀察到樣品至分離膠后，增高電壓至120 V。電泳結(jié)束后，使用考馬斯亮藍R-250 染色，染色時間1 h，每次脫色1 h，重復(fù)脫色，當膠的背景為無色時，即表示脫色完全，脫色結(jié)束后進行拍照。

1.3.3 魷魚胴體分離蛋白氨基酸組成的測定

魷魚胴體粗蛋白的氨基酸成分測定使用高效液相的方法進行測定，測定包含常見的16 種氨基酸及色氨酸。稱取24.7 g 魷魚胴體分離蛋白至反應(yīng)瓶中，加入1 mL 6 mol·L-1鹽酸，110 酸解24 h。取200 μL液體，加入100 μL 2 mol·L-1NaOH 中和，渦旋混勻，用AccQ·Tag Ultra Borate 緩沖液稀釋90 倍。取10 μL樣品到瓶中，加入70 μL AccQ·Tag Ultra Borate 緩沖液和20 μL AccQ·Tag 試劑。將反應(yīng)混合物在55 加熱10 min，冷卻后上機測定；另取樣用6 mol·L-1氫氧化鈉水解后按照上述過程同機測定[9-10]。

1.3.4 液相色譜參數(shù)

色譜柱：Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A 相為超純水（含0.1%甲酸），B 相為乙腈（含0.1%甲酸）；開啟電腦、泵等裝置，打開色譜軟件，流速設(shè)置為0.5 mL·min-1，柱溫為55 ，進樣量為1 μL。

1.3.5 魷魚胴體分離蛋白基本成分測定

灰分測定參考GB/T 5009.4—2016，采用灼燒法；粗蛋白測定的方法是稱取0.5 g 的魷魚胴體分離蛋白粉末，加入0.4 g 硫酸銅、6 g 硫酸鉀及20 mL 硫酸于消化爐中消化，當消化爐溫度達到420 ，繼續(xù)消化2 h，調(diào)節(jié)凱氏定氮儀，測定其含量。

1.3.6 魷魚胴體分離蛋白溶解度測定

阿根廷魷魚、巴特柔魚、太平洋魷魚胴體分離蛋白溶解性的測定依據(jù)SANCHEZ-ALONSO 等的法[11]，并稍作修改。分別取魷魚胴體分離蛋白加入蒸餾水，配制成7 份，使用濃度為0.5 mol·L-1的NaOH、HCl 溶液，調(diào)節(jié)其中6 份溶液的pH，pH 梯度分別為2、4、6、8、10、12，剩余的一份為初始樣液，分別取各溶液1 mL，加入蛋白粉末1 mg。將7 份蛋白溶液渦旋5 min，離心15 min，離心后吸取清液，使用BCA 試劑盒法檢測。上清液中蛋白濃度占離心前總蛋白濃度的比值即為蛋白溶解度。

2 結(jié)果與分析

2.1 魷魚胴體分離蛋白的SDS-PAGE 電泳分析

魷魚中蛋白質(zhì)含量豐富，粗蛋白占比接近20%。其中肌原纖維蛋白的含量約占總蛋白含量的77%～85%，主要包括肌球蛋白重鏈（Myosin Heavy Chain，MHC）、肌動蛋白（Actin，AC）、原肌球蛋白（Tromyosin，TM）以及軟體動物中含有的副肌球蛋白（Paramyosin，PM）[12]。

由圖1 可知，3 種魷魚蛋白的分子量主要分布在190 ～280 kDa、95 kDa、50 kDa、45 kDa、36 kDa，其中190～280 kDa蛋白是魷魚肌球蛋白重鏈（MHC），約95 kDa 的蛋白是副肌球蛋白（PM），約45 kDa 的蛋白是肌動蛋白（AC），分子量較小的蛋白是原肌球蛋白（TM），約36 kDa[13]。在3 種魷魚胴體分離蛋白的SDS-PAGE 電泳分析結(jié)果中，巴特柔魚和太平洋魷魚中MHC 條帶顏色較深，且條帶較寬，表示這部分蛋白相近分子質(zhì)量較多，含量較高，出現(xiàn)較模糊的條帶。阿根廷魷魚胴體分離蛋白的MHC 條帶顏色較淺，說明在酸性條件下，MHC 發(fā)生了一些降解[14]，但其條帶與另外兩種魷魚蛋白的條帶相比，條帶顏色的深淺與帶寬的差異并不是十分明顯。根據(jù)分離蛋白的電泳圖可以看出，魷魚胴體分離蛋白沒有因為酸堿的處理，而導致大分子蛋白的明顯聚集和降解。

圖1 不同魷魚胴體分離蛋白電泳圖

2.2 魷魚胴體分離蛋白氨基酸組成分析

對阿根廷魷魚、巴特柔魚、太平洋魷魚胴體分離蛋白中的氨基酸的種類及含量進行了測定，結(jié)果如表3 所示。測定的17 種氨基酸中，阿根廷魷魚、巴特柔魚、太平洋魷魚胴體蛋白中的亮氨酸與賴氨酸在成人人體必需氨基酸中含量最高，其中亮氨酸分別為6.99 g/100 g、7.26 g/100 g、7.32 g/100 g，賴氨酸分別為7.07 g/100 g、7.56 g/100 g、7.25 g/100 g。經(jīng)計算，其必需氨基酸占總氨基酸比例分別為43.64%、42.63%、42.00%，均達到世界衛(wèi)生組織提出的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的標準[15]。3 種魷魚胴體分離蛋白的必需氨基酸與非必需氨基酸比值分別為77.45%、74.29%、72.42%，而根據(jù)FAO/WHO 的氨基酸標準模式[16]，當必需氨基酸占非必需氨基酸的比值在40%左右時，即表示蛋白質(zhì)量較好，因此，研究制備的3 種魷魚蛋白均屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。

表3 不同魷魚胴體分離蛋白氨基酸組成

2.3 魷魚胴體分離蛋白基本成分分析

阿根廷魷魚、巴特柔魚以及太平洋魷魚胴體分離蛋白經(jīng)過冷凍干燥后制成粉末狀，并對3 種魷魚胴體分離蛋白進行了灰分與粗蛋白的測定，結(jié)果如表2 ～表4 所示。結(jié)果表明，制備的3 種魷魚胴體分離蛋白中粗蛋白含量較高，都超過80%。該實驗結(jié)果略低于董淑華[17]提取鳶烏賊分離蛋白中粗蛋白的含量，這可能是因為實驗過程中未對蛋白進行透析，分離蛋白粉末中雜質(zhì)較多[18]。此外，通過堿溶酸沉制得的蛋白樣品中都含有較少的灰分，其灰分值低于1.85%。實驗結(jié)果表明，經(jīng)過堿溶酸沉方法制備的3 種魷魚胴體分離蛋白粉末中灰分含量與粗蛋白含量均比較接近，并且該方法提取出的魷魚胴體分離蛋白含量均較高，而灰分含量相對比較低。

表4 不同魷魚胴體分離蛋白的基本成分

2.4 魷魚胴體分離蛋白溶解度分析

由圖2 可知，阿根廷魷魚、巴特柔魚、太平洋魷魚胴體分離蛋白的溶解度隨溶液pH 的變化而產(chǎn)生波動，3 種魷魚蛋白的溶解情況整體上相似，趨勢大致呈現(xiàn)為U 型的形式。當溶液pH 接近中性范圍時，3 種魷魚蛋白的溶解度都非常低，尤其是pH 在6 ～7 時，其溶解度最低，這可能是由于溶液pH 范圍比較接近胴體分離蛋白的等電點，蛋白質(zhì)不易溶解。伴隨溶液pH 發(fā)生變化，逐漸偏離中性范圍時，3 種魷魚蛋白溶解度逐漸升高，當溶液pH 分別為2、12 時，3 種蛋白的溶解度均達到極高的位置，并且數(shù)值比較接近，這可能是由于溶液酸堿性在2 和12 兩種環(huán)境下，蛋白中的分子發(fā)生解離，且蛋白的二級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)轉(zhuǎn)變，對蛋白的電荷與側(cè)鏈基團產(chǎn)生影響[19]。此外，在溶液pH 為2時，3 種魷魚蛋白均達到比較高的溶解度，而人體的胃酸環(huán)境pH 大致在2 左右，因此，如果基于分離蛋白酸性環(huán)境溶解情況良好的性質(zhì)將其應(yīng)用到食品中，那食品中添加的分離蛋白可能會更易于人體吸收和利用[20]。

圖2 不同魷魚胴體分離蛋白溶解度

3 結(jié)論

研究選擇使用堿溶酸沉的方法制備阿根廷魷魚、巴特柔魚、太平洋魷魚胴體分離蛋白，本研究對制備的3 種魷魚胴體分離蛋白的基本成分及營養(yǎng)成分進行了分析。從3 種分離蛋白的氨基酸分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，3 種魷魚蛋白都含有豐富的氨基酸，包括了17 種氨基酸類型，其中必需氨基酸與總氨基酸的比例均超過40%，表明該蛋白質(zhì)為優(yōu)質(zhì)蛋白。研究對提取得到的魷魚胴體分離蛋白的溶解度進行檢測，3 種魷魚胴體分離蛋白的溶解性受到pH 變化而產(chǎn)生波動，3 種蛋白溶解性主體上表現(xiàn)為U 型的趨勢，其中pH 值在2、4、11、12 時溶解性均較好，但pH 值接近中性范圍時，蛋白的溶解性最差。本研究中制取得到3 種分離蛋白粉末，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，3 種蛋白的分子條帶都比較清晰，條帶中沒有出現(xiàn)明顯的聚集或降解的現(xiàn)象。通過對3 種魷魚蛋白粉的基本成分分析來看，3 種魷魚蛋白中灰分含量均低于1.89%，而粗蛋白含量都不低于80%。綜上，本研究對3 種魷魚胴體分離蛋白的基本成分及營養(yǎng)成分做了檢測分析，研究發(fā)現(xiàn)魷魚胴體分離蛋白中氨基酸配比合理，且富含多種人體必需氨基酸，表明魷魚蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白資源，為魷魚蛋白在食品等領(lǐng)域的深入研究提供了理論依據(jù)。